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文章信息
- 姜韶东, 李平花, 孙普, 马雪青, 白兴文, 包慧芳, 卢曾军, 曹轶梅, 付元芳, 李冬, 陈应理, 刘在新
- JIANG Shao-Dong, LI Ping-Hua, SUN Pu, MA Xue-Qing, BAI Xing-Wen, BAO Hui-Fang, LU Zeng-Jun, CAO Yi-Mei, FU Yuan-Fang, LI Dong, CHEN Ying-Li, LIU Zai-Xin
- 嵌合 O/GSLX/CHN/2010 株 S 片段的基因工程口蹄疫病毒的生物学特性
- Characterization of chimeric foot-and-mouth disease viruses bearing the S-fragment of O/GSLX/CHN/2010
- 微生物学通报, 2015, 42(12): 2396-2406
- Microbiology China, 2015, 42(12): 2396-2406
- 10.13344/j.microbiol.china.150124
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文章历史
- 收稿日期: 2015-02-05
- 接受日期: 2015-04-03
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2015-06-03
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是危害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性动物传染病[1]。其病原是小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)[2]。作为一种单股正链RNA病毒,FMDV的基因组全长约8.5 kb,依次由5′-非翻译区(Untranslatedregion,UTR)、开放阅读框(Open reading frame,ORF)和3′-UTR组成。FMDV包含O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3 7个血清型,每个血清型又可以分为多个拓扑型。
S片段是位于FMDV基因组5′-UTR最前端的一个相对独立的单元。它的5′端可以与尿苷酸化的VPg蛋白共价结合,而它的3′端通过Poly(C)片段与基因组其余组分隔开。S片段模拟的二级结构是一个长的单一茎环[3, 4],该结构被推测是S片段行使功能的结构基础。类比小RNA病毒科其他病毒上的相关研究,S片段被认为与FMDV基因组RNA稳定性、基因组RNA复制以及病毒致病力有关[1, 5, 6],但至今没有明确的实验证据。
FMDV O/SEA/Mya-98谱系病毒S片段的一般长度为368 nt,而2010年分离自我国甘肃宁夏回族自治州的Mya-98谱系毒株O/GSLX/CHN/2010的S片段却只有298 nt[7]。与同谱系毒株进行核酸序列比对,我们发现O/GSLX/CHN/2010的S片段在核酸序列第149−218位存在70 nt的缺失。实验室研究发现,与同谱系毒株相比,O/GSLX/CHN/2010基因组RNA复制较慢,病毒滴度较低,对乳鼠的致病力也较差。
为了探讨O/GSLX/CHN/2010毒株较弱的表型是否是由其特征性的S片段决定的,我们利用现有的2株Mya-98谱系的感染性克隆[8],构建了嵌合O/GSLX/CHN/2010毒株S片段的基因工程嵌合病毒rGDexc和rGZexc。并从病毒基因组RNA复制、病毒滴度、对乳鼠致病力等方面,对嵌合病毒及其亲本病毒进行了评价和比较。本研究将为进一步理解O/GSLX/CHN/2010的致弱机制、S片段中部70 nt缺失对病毒的影响等奠定基础。
1 材料与方法 1.1 细胞、毒株、质粒、试剂和仪器幼仓鼠肾细胞系BHK-21来自美国标准培养物保藏中心(American type culture collection,ATCC),稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞系由德国Max von Pettenkofer研究所的Conzelmann教授惠赠,这两种细胞都按规定培养和传代[9]。
FMDV毒株O/GSLX/CHN/2010 (GenBank登录号:JQ900581)分离自猪,其基因组在S片段缺失70 nt。FMDV毒株O/GD/2/CHN/2010和O/GZSB/ CHN/2010分别分离自猪和牛,它们的S片段不存在缺失,长度均为368 nt。这3株FMDV都是在2010−2011年东亚暴发的Mya-98谱系口蹄疫疫情中分离的,都属于O/SEA/Mya-98谱系,且亲缘关系较近(两两间全基因组核苷酸一致性均大于97.8%)。本研究之前,O/GD/2/CHN/2010和O/GZSB/ CHN/2010的感染性克隆均已构建、拯救成功,质粒分别命名为pGD和pGZ,基因工程病毒分别命名为rGD和rGZ。
实验中用到的胎牛血清、细胞培养液、Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;AMV逆转录酶、高保真DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、DNA marker等,购自大连宝生物公司;口蹄疫病毒3A单克隆抗体(命名为3A24)由本实验室制备并保存。山羊抗鼠lgG(H+L)FITC荧光标记的二抗、细胞核染料DAPI,购自康为世纪公司;构建用的病毒RNA用Qiagen RNeasymini Kit试剂盒提取。定量用的病毒RNA由Eppendorf公司的自动核酸提取仪epMotion M5073c统一提取。TaqMan探针由ABI公司设计、合成。实时荧光定量PCR的相关试剂购自德国Roche公司;实时荧光定量PCR仪(ABI 7500),美国ABI公司;激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8),德国Leica公司。
1.2 全基因组序列分析、S片段二级结构模拟为了了解3株FMDV的基因组序列差异,利用MEGA 6.0软件对这3株FMDV的全基因组核酸序列进行了比对分析。为了了解3株病毒S片段二级结构的差异,运用mfold在线程序模拟了这3株病毒S片段的二级结构。
1.3 嵌合病毒的构建、拯救和鉴定根据3株病毒的基因组序列设计引物(表 1)。其中,引物LXS-和引物C-K+横跨Poly(C)区,且把Poly(C)长度固定为16个C。除Poly(C)外,引物LXS-和引物C-K+还包含30 nt的重叠互补序列,以便于实施融合PCR。此外,在引物LXS+的5′端引入了SphI外源单一酶切位点,引物C-K-正好位于保守的内源单一酶切位点Kpn I处。
名称 Names |
引物序列 Primer sequence (5′→3′) |
长度(碱基对) Size (bp) |
LXS+ | GGTGCATGC aTAATACGACTCACTATAGGG bTTGAAAGGGGGCGCTAGGGTCT | 51 |
LXS- | AGCGACGGTAAAACTTGGGGGGGGGGGGGGGG cTGAAAGGCGGGCTTCGAGT | 51 |
C-K+ | AAGCCCGCCTTTCACCCCCCCCCCCCCCCC cAAGTTTTACCGTCGCTCCCGACGT | 54 |
C-K- | CCTCGGGGTACC dTGAAGGGCATCCTT | 38 |
首先,用引物LXS+和引物LXS−扩增O/GSLX/CHN/2010的S片段LXS;同时,用引物C-K+和引物C-K−扩增O/GD/2/CHN/2010和O/GZSB/CHN/2010基因组上Poly(C)至Kpn I的序列C-KGD和C-KGZ。然后,利用引物LXS+和C-K−将LXS与C-KGD或C-KGZ融合,分别得到PCR片段EXCGD、EXCGZ。用Sph I和Kpn I分别双酶切 PCR片段EXCGD、EXCGZ以及感染性克隆质粒pGD、pGZ。将酶切后的PCR片段替换进酶切后的感染性克隆质粒,得到新的全长质粒pGDexc、pGZexc。
测序鉴定正确后,利用基因组3′末端的Not I酶切位点线化全长质粒pGDexc、pGZexc。线化的全长质粒用PCR纯化试剂盒纯化回收后,利用Lipofectamine 2000将线化质粒转染单层BSR T7/5细胞,并于37 °C 5% CO2继续培养。72 h后,将转染了线化质粒的BSR T7/5细胞反复冻融3次,继续在BHK-21细胞上传代,直至出现明显的细胞病变效应。转染拯救成功的嵌合病毒分别命名为rGDexc、rGZexc (图 1)。
除观察细胞病变效应外,我们还利用反转录PCR和间接免疫荧光试验对嵌合病毒进行了鉴定。具体操作步骤参照文献[10]。
1.4 反转录-实时荧光定量聚合酶链式反应将等量(MOI=0.1)的基因工程病毒rGD、rGDexc、rGZ、rGZexc以及蚀斑纯化的O/GSLX/CHN/2010接种BHK-21细胞,分别在感染后0、4、8、12 h收取病毒。收取的病毒反复冻融3次后,利用自动核酸提取仪统一提取病毒RNA,并用cDNA合成试剂盒进行反转录。借助事先定量的DNA标准品,进行实时荧光定量PCR,对合成的病毒cDNA进行绝对定量。所用的引物和探针与张萌等[10]一致,条件和体系等参照实时荧光定量PCR探针法试剂盒FastStart Universal Probe Master (ROX)的说明书。
1.5 病毒滴度的测定将等量(MOI=0.1)的基因工程病毒rGD、rGDexc、rGZ、rGZexc以及蚀斑纯化的O/GSLX/CHN/2010接种BHK-21细胞,分别在感染后0、4、8、24 h收取病毒。收取的病毒反复冻融3次后,用在96孔板中培养的BHK-21细胞单层滴定病毒,并按照Reed-Muench法计算TCID50。
1.6 病毒对乳鼠致病力的测定测定了基因工程病毒rGD、rGDexc、rGZ、rGZexc以及蚀斑纯化[8]的O/GSLX/CHN/2010的 TCID50,将这些病毒分别稀释成10 TCID50/100 μL、1 TCID50/100 μL、0.1 TCID50/100 μL、0.01 TCID50/100 μL,并分别颈背部皮下接种9−12只3日龄的BALB/c乳鼠。接种后每隔12 h观察并记录一次乳鼠死亡情况,连续观察7 d。病毒对乳鼠的致病力通过存活率曲线来表示[11]。
2 结果与分析 2.1 全基因组序列及S片段模拟二级结构的分析虽然O/GSLX/CHN/2010与另2株病毒的全基因组核酸序列一致性分别为97.8%、98.7%,亲缘进化关系非常近;但是,通过序列比对,在O/GSLX/CHN/2010上发现了许多特征性的变异位点(表 2)。这些变异位点分别位于与基因组复制相关的S片段、3′-UTR以及2C、3A和3B的编码区,与病毒侵入细胞相关的组成衣壳的VP2、VP3和VP1的编码区以及蛋白酶Lpro和3Cpro的编码区。
No. a | O/GSLX/CHN/2010 | O/GZSB/CHN/2010 | O/GD/2/CHN/2010 | |
S-fragment | 149-218 | - | b | b |
198 | - | G | A | |
210 | - | C | T | |
219 | C | C | T | |
279 | C | T | T | |
284 | C | C | T | |
285 | C | C | T | |
290 | G | A | A | |
293 | G | A | A | |
345 | T | C | C | |
L-5′UTR | 399 | G | T | T |
553 | C | T | T | |
560 | T | C | C | |
L proc | 4 | T | A | A |
10 | V | - | - | |
13 | H | Y | Y | |
20 | T | A | A | |
24 | P | S | S | |
VP2 | 56 | I | V | V |
VP3 | 13 | S | G | G |
105 | I | V | V | |
VP1 | 133 | D | N | N |
142 | T | L | P | |
2C | 80 | N | S | S |
248 | I | N | T | |
3A | 93 | H | Y | Y |
3B | 39 | R | K | K |
3C | 28 | I | V | V |
3′-UTR | 3 | C | T | T |
40 | C | A | A |
用mfold模拟的这3株病毒的S片段都能形成单一的长茎环结构(图 2)。而且,这3个模拟的茎环结构中细节上的二级结构(膨泡、内环、发卡等)的位置和比例也基本一致。但是O/GSLX/CHN/2010的S片段在相对另两株病毒S片段中部的149−218位缺失了70 nt,使得其模拟的二级结构的茎矮了约1/5。
2.2 嵌合病毒的鉴定嵌合病毒rGDexc、rGZexc转染后在BHK-21细胞上传到第3代,就可以看到比较明显的细胞病变效应。将两株嵌合病毒在BHK-21细胞上传到第4代,也可以通过间接免疫荧光实验检测到FMDV的3A蛋白(图 3)。提取两嵌合病毒在BHK-21上传到第3代和第10代时的RNA,进行反转录PCR并测序,发现病毒序列与构建时预期一致且无变异。这些都说明嵌合病毒rGDexc和rGZexc拯救成功,并能在10代以内保持序列稳定。
2.3 嵌合病毒RNA复制能力、病毒滴度的检测对实时荧光定量PCR和病毒滴度的检测数据进行t检验,ns代表差异不显著(no significant),*代表差异显著(P<0.05),**和***代表差异极显著(P<0.01,P<0.001)。由结果可知,嵌合病毒rGDexc、rGZexc与亲本基因工程病毒rGD、rGZ在病毒RNA复制能力、病毒滴度方面没有明显差异。即使嵌合了O/GSLX/CHN/2010的S片段,嵌合病毒RNA的复制能力和病毒滴度并没有变弱,仍明显强于O/GSLX/CHN/2010 (图 4、5)。这表明嵌合病毒核酸复制和病毒粒子产生的速率并没有因为嵌合了O/GSLX/CHN/2010的S片段而降低。
2.4 嵌合病毒对乳鼠致病力的检测
乳鼠对FMDV和牛等动物一样敏感,是常用的测定FMDV致病力的实验动物[12]。当给乳鼠接种100 μL的PBS或0.01 TCID50/100 μL的病毒(图 6A)时,接种后7 d内所有接种的乳鼠均存活。当给乳鼠接种100 μL的0.1 TCID50/100 μL的病毒(图 6B)时,接种O/GSLX/CHN/2010、rGZ和rGZexc的乳鼠接种7 d后均存活100%,接种rGD和rGDexc的乳鼠接种7 d后均存活90%。当给乳鼠接种100 μL的1 TCID50/100 μL的病毒(图 6C)时,接种7 d后,接种O/GSLX/CHN/2010的乳鼠的存活率最高(80%),接种rGZ和rGZexc的乳鼠均能存活30%。而接种rGD和rGDexc的乳鼠在接种后4.5 d死光。当给乳鼠接种100 μL的10 TCID50/100 μL的病毒(图 6D)时,接种O/GSLX/CHN/2010的乳鼠在5 d后死光,接种rGZ和rGZexc的乳鼠在4 d后死光,接种rGD和rGDexc的乳鼠只需2.5 d就死光了。这表明,嵌合O/GSLX/CHN/2010的S片段后,嵌合病毒对乳鼠的致病力没有明显改变,仍然比O/GSLX/CHN/2010要强。
3 结论反向遗传操作是研究表型和基因型之间关系的有力工具,尤其适合研究病毒这种基因组较小的有机体[13, 14]。相对于一般的Mya-98谱系毒株,分离自2010−2011年Mya-98大流行中的O/GSLX/ CHN/2010在其S片段的中部缺失70个碱基。2010年之前分离的3株A型和1株C型FMDV也被提到存在类似缺失,但是文献中并没有描述具有这种特征性S片段的毒株的表型[15]。2010−2011年, Mya-98在东亚的大流行暴发了数百次疫情[16],但是只在两次疫情中分离到了具有这种特征性S片段的毒株。将分离的O/GSLX/CHN/2010进行蚀斑纯化后,O/GSLX/CHN/2010与同谱系毒株相比,基因组RNA复制较慢,病毒滴度较低,对乳鼠的致病力也较差。这种较弱的表型可能正是大流行中具有该特征性S片段的毒株传播范围小、分离到的数量少的原因。在本研究中,借助病毒反向遗传操作,分别以两株现存的近缘FMDV感染性克隆为骨架,嵌合上O/GSLX/CHN/2010的S片段,然后通过评价和比较嵌合病毒与亲本毒的生物学特点,来探讨O/GSLX/CHN/2010特征性的S片段与其较弱的表型之间的联系。致细胞病变效应、反转录PCR和间接免疫荧光等结果表明,嵌合病毒rGDexc和rGZexc拯救成功。病毒RNA复制、病毒滴度、病毒对乳鼠致病力实验表明,嵌合病毒rGDexc、rGZexc的生物学表型与各自的亲本毒rGD、rGZ相当,且各项指标显著强于弱毒株O/GSLX/CHN/ 2010,嵌合O/GSLX/CHN/2010的S片段并没有使病毒致弱。
长期以来,FMDV的S片段被认为与病毒RNA的复制、毒力有关。虽然还没有明确的实验证据,但是许多实验结果佐证了这一推测。一方面,S片段可以和聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP1-PCBP2)[17]、RNA解旋酶A (RNA Helicase A,RHA)[18]、病毒自身的3′-UTR[19]结合并互作,而PCBP1-PCBP2、RHA被认为是病毒复制复合体的组成部分,3′-UTR也被认为是调节病毒复制、翻译的开关。而且,S片段上的点突变可能会因为破坏了其发挥功能的结构基础,使得在S片段仅引入一个碱基的突变就无法拯救到活病毒[20]。另一方面,S片段折叠形成的高级结构被鉴定为一种病原相关分子模式,可以诱发宿主的先天性免疫反应,进而使宿主产生抗病毒应答[21]。而宿主的抗病毒应答与病毒的毒力其实是从两个角度阐释的同一个问题。
与另2株近缘毒株相比,O/GSLX/CHN/2010的S片段除了在第149−218位存在70个碱基的缺失外,还在S片段存在至少4个碱基的差异。这些核酸一级结构上的差异很可能影响到S片段的二级结构和高级结构,进而通过影响与相应蛋白、核酸的相互作用影响病毒的表型。两嵌合病毒都能拯救成功,说明rGD、rGZ的骨架可以容纳O/GSLX/CHN/2010的S片段。病毒骨架与外来S片段匹配时,外来S片段引入的每一项变异都可能对嵌合毒的表型产生影响。而从实验结果看,嵌合毒rGDexc、rGZexc的表型与亲本毒rGD、rGZ的表型相当,说明各项基因型变异叠加作用的结果相互抵消了对病毒表型的改变。
作为一株弱毒,O/GSLX/CHN/2010和一般Mya-98谱系FMDV毒株的差异不仅在S片段上,还存在于全基因组的许多元件中。比如,构成复制复合体的2C、3A、3B编码区和3′-UTR上的变异很可能会影响病毒的复制,组成衣壳的VP2、VP3、VP1上的变异很可能会影响病毒对细胞的入侵进而影响核酸复制、病毒粒子包装、滴度和毒力。Lpro和3Cpro作为蛋白酶可以切割或降解FMDV自身翻译产生的多聚蛋白、宿主的真核翻译起始因子eIF4G[22]、干扰素调节因子IRF3/7[23]、核因子NF-κB[24]、NF-κB必需调节因子NEMO[25]、定位在细胞核的RNA结合蛋白Sam68[26]、内部核糖体进入位点IRES的结合蛋白Gemin5[27]、核转运受体蛋白KPNA1[28]等,从而广泛地参与对病毒复制、翻译、包装、诱导先天性免疫和毒力等方面的调节。Lpro和3Cpro上的变异很可能对蛋白酶的切割位点和效率产生影响,进而影响FMDV的RNA复制、病毒滴度和毒力。尤其是Lpro在第9个氨基酸后多出1个缬氨酸,这一插入突变之前从未报道过,其对病毒表型的影响很值得研究。综上,O/GSLX/CHN/2010基因组上诸多变异都可能导致其较弱的表型,究竟哪种突变起了关键作用,还有待深入鉴别。
本研究表明O/GSLX/CHN/2010特征性的S片段不能独自决定其较弱的表型,这一发现为进一步研究O/GSLX/CHN/2010的致弱机制、S片段70 nt的缺失等奠定了基础。构建O/GSLX/CHN/2010的感染性克隆并依次替换O/GSLX/CHN/2010上的变异,直接在rGD和rGZ感染性克隆的S片段上删除相应的70 nt等将成为我们接下来的实验计划。
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