β-甘露聚糖酶(β-Mannanase，EC3.2.1.78)是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖，生成甘露二糖、三糖等小分子物质的水解酶^[1]。结合甘露糖苷酶(β-Mannosidase，EC3.2.1.25)、半乳糖苷酶(α-Galactosidase，EC3.2.1.22)、葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)、乙酰甘露聚糖脂酶(Acetylmannan esterase，EC3.2.1.6)等支链酶的协同作用，可彻底降解甘露聚糖^[2]。目前，β-甘露聚糖酶已广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、印染、纺织及石油开采等领域^{[3, 4, 5]}。

β-甘露聚糖酶普遍存在于自然界中，但微生物生产的β-甘露聚糖酶是主要来源。迄今，已有许多关于微生物生产β-甘露聚糖酶的报道，例如：细菌中的芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus、Bacillus nealsonii PN-11、Bacillus pumilus GBSW19)^{[6, 7, 8]}等；真菌中的萨托菌(Neosartorya fischeri P1)^[9]、篮状菌(Talaromyces leycettanus)^[10]等，曲霉如构巢曲霉(Aspergillus nidulans XZ3)^[11]、黑曲霉(Aspergillus niger BK01)^[12]等；放线菌中的链霉菌(Streptomyces tendae)^[13]等。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活性高，成本低，来源稳定，提取方便以及比动植物更广的作用pH、温度范围和底物适应性等显著特点，易被理论研究和工业化生产应用。随着β-甘露聚糖酶的工业化需求不断增长，如何利用微生物资源高效生产能适用于不同工业领域的β-甘露聚糖酶业已成为专家学者们关注的焦点，选育优良菌株并优化其产β-甘露聚糖酶的工艺条件是高效生产的基础。

本项目组选育到一个能同时高产耐热偏酸性β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的半纤维降解高效菌株B. subtilis BE-91^{[14, 15]}，前期已对该菌木聚糖酶的发酵工艺、分离纯化和酶学性质等进行了系统研究^{[16, 17]}。本研究拟在单因素试验基础上，采用正交试验法优化B.subtilis BE-91的生长条件和胞外表达β-甘露聚糖酶的摇瓶发酵条件，为开发B.subtilis BE-91在酶制剂产业的应用价值提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 菌株

半纤维降解高效菌株B.subtilis BE-91 (曾用编号：CXJZ11-01)由中国农业科学院麻类研究所酶工程项目组选育并保存。

1.2 培养基

选择平板：在标准LB固体培养基(g/L，胰蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5，琼脂15，加水至1 L，NaOH调整pH为7.4−7.6，1×10⁵ Pa高压蒸汽灭菌20 min)配方的基础上，添加5 g/L魔芋胶、0.5 g/L曲利苯兰。

生长培养基、发酵培养基配方通过正交试验确定。

1.3 主要试剂

魔芋胶(纯度>95%)，成都路特实业有限公司；魔芋精粉(食品级)，湖南龙山天食有限责任公司；曲利苯兰和甘露糖，美国Sigma公司；3,5-二硝基水杨酸，国药集团。

1.4 主要仪器

酶标仪(MLtiskan GO)，美国Thermo Scientific公司；分析天平(MS32000LE)，瑞士梅特勒公司；pH计(HI9025)，意大利HANNA公司；水浴摇床(THZ-82)，中国荣华仪器公司。

1.5 菌种培养及β-甘露聚糖酶粗酶液制备

取真空保存的B. subtilis BE-91菌种一环，接种于6 mL生长培养基，35 °C静置培养5.5 h；稀释涂于选择平板，35 °C培养18 h，挑取优良单菌落接种于6 mL生长培养基，35 °C静置培养6 h，即为一级培养菌悬液。将一级菌悬液接种于盛有100 mL培养液的小三角瓶，35 °C、180 r/min振荡培养至指数生长期，即为二级菌悬液。按接种量2%接种于300 mL发酵培养基，35 °C、180 r/min振荡培养。按相关实验步骤的时间要求取样(10 mL发酵液)，4 °C、3 000 r/min离心10 min，上清液即为β-甘露聚糖酶粗酶液。

1.6 β-甘露聚糖酶活力测定

参照Akino等方法^[18]，用魔芋胶和pH 6.5 0.025 mol/L柠檬酸-0.05 mol/L NaH₂PO₄缓冲液配制5 g/L (质量体积比)的底物，取1 mL适当稀释的酶液与2 mL预热的底物充分混匀，65 °C反应10 min，DNS法测还原糖生成量。用灭活的酶液做相同处理作对照。β-甘露聚糖酶活力定义：底物每分钟释放相当于1 μmol甘露糖的还原糖所需酶量为1个酶活力单位(以IU表示)。

1.7 生长培养条件优化 1.7.1 单因素试验：分别以培养温度(30、35、37和40 °C)和起始pH (4.5−8.0，间隔0.5)为变量，固定其他生长培养条件，转接摇瓶后，在适当的培养时间点取样，以测得的菌液OD₆₀₀为衡量指标进行优化水平评价。每组试验设置3个重复。

1.7.2 正交试验：根据培养基的主要成分C源、N源和无机盐3因素设计正交实验L₉(3³)方案(表 1)^{[19, 20]}，以OD₆₀₀值为衡量指标，结合极差和方差析评价生长培养基成分优化组合。每组试验设置分3个重复。

1.8 发酵条件优化 1.8.1 单因素试验：以发酵培养基C源浓度(0−0.9%)、起始pH (4.5−8.0，间隔0.5)和发酵温度(30、35、37和40 °C)为变量，固定其他发酵条件，进行单因素试验。以发酵12 h的胞外β-甘露聚糖酶活力为衡量指标。评价发酵条件优化水平。每组试验设置3个重复。

1.8.2 正交试验：在单因素试验基础上，采用正交试验设计L₉(3⁴)方案(表 2)^{[19, 20]}，以胞外β-甘露聚糖酶活力为衡量指标，结合极差和方差分析评价发酵条件优化组合。每组试验设置3个重复。

1.9 B. subtilis BE-91的生长规律和产酶规律测定

采用试验确定的优化生长和发酵条件，按照方法1.5菌种培养流程进行B. subtilis BE-91发酵，从发酵培养基培养第6 h开始取样，每小时取样一次，测定OD₆₀₀和胞外β-甘露聚糖酶活力。

1.10 数据分析

每个检测指标重复3次，取平均值。利用Excel 2007和统计分析软件SAS 9.0对3次重复试验结果进行分析并绘制图表。

2 结果与分析 2.1 生长培养条件优化 2.1.1 单因素对菌种生长的影响：测定在不同培养温度和起始pH条件下B. subtilis BE-91的生长趋势。(1) 培养温度：从图 1可以看出，不同温度明显影响了B. subtilis BE-91生长。35 °C条件下培养，B. subtilis BE-91的指数生长期呈现在接种后第4−8 h；40 °C条件下，B. subtilis BE-91接种4 h后，OD₆₀₀不增长，甚至负增长；在30 °C和37 °C条件下，B. subtilis BE-91的对数生长曲线的斜率远不及35 °C。因此，可以肯定，35 °C是B. subtilis BE-91的适宜生长温度；若要进行扩大培养或发酵取6−8 h菌龄比较合适。(2) 起始pH：从表 3可以看出，当起始pH为4.5−8.0，培养第8 h的菌液OD₆₀₀值都大于第6 h的菌液OD₆₀₀值，说明B. subtilis BE-91的适宜生长pH范围比较宽；当起始pH 6.0时，培养第6 h和第8 h的菌液OD₆₀₀值均较其余pH组大，说明起始 pH 6.0更适合于该菌生长。

2.1.2 多因素正交试验：在单因素试验的基础上，对N源、C源和无机盐进行正交试验。结合极差和方差分析(表 4和表 5)的结果可知：影响B.subtilis BE-91生长的因素主次顺序为：无机盐>N源>C源；在选定的条件下，优化生长培养基组合为0.3%牛肉膏+0.2%酵母膏、0.1%葡萄糖+0.4%魔芋精粉、0.5% NaCl。

2.2 发酵条件优化 2.2.1 单因素对菌种产β-甘露聚糖酶的影响：分析不同发酵温度、pH和魔芋精粉的浓度对产酶的作用效果。(1) 发酵温度：从图 2可以看出，35 °C条件下发酵，B.subtilis BE-91胞外表达β-甘露聚糖酶活力最高为307.2 IU/mL。该实验结果的差异与上述“培养温度”实验结果雷同。说明35 °C是B.subtilis BE-91生长及其胞外表达β-甘露聚糖酶的优化温度条件。(2) 发酵pH：培养基的pH主要通过影响细胞膜所带电荷及细胞对营养物质的利用，改变培养基中有机化合物的离子化作用程度，从而促进或抑制微生物的生长和代谢。从图 3可以看出，pH 6.0条件下发酵，B.subtilis BE-91产β-甘露聚糖酶活力最高为305.8 IU/mL。该实验结果的差异与上述“起始pH”实验结果雷同。说明pH 6.0是B.subtilis BE-91生长及其胞外表达β-甘露聚糖酶的优化pH条件。(3) 魔芋精粉浓度：由图 4可知，当发酵培养基的魔芋精粉浓度<0.7%时，B.subtilis BE-91产β-甘露聚糖酶随着魔芋精粉含量增大而迅速升高；魔芋精粉浓度>0.7%时，随着魔芋精粉含量增大，B.subtilis BE-91产β-甘露聚糖酶迅速降低。这可能是因为魔芋精粉含量高，导致培养基黏度过大，不利于发酵体系的传质和溶氧，从而影响菌株产酶。当培养基不含魔芋精粉时，发酵液中几乎检测不到β-甘露聚糖酶活力。因此，可以推断魔芋精粉在B.subtilis BE-91产β-甘露聚糖酶过程中不仅作为营养成分的碳源，还可能是重要的诱导物。

2.2.2 多因素正交试验：在单因素试验的基础上，对C源、N源、发酵温度和发酵pH进行正交试验。表 6和表 7结果表明：影响因素的主次顺序为C源>温度>pH>N源；在选定的条件下，最优发酵条件组合为：0.7%魔芋精粉、0.4%大豆蛋白胨和0.1% (NH₄)₂SO₄、发酵温度35 °C和发酵pH 6.0。

2.3 产酶时间进程

与菌体生长相比，B. subtilis BE-91菌株分泌β-甘露聚糖酶具有明显的同步效应(图 5)，约6 h菌株进入指数生长期，10 h达到最高峰，OD₆₀₀约为2.5。同时，β-甘露聚糖酶的产生在 10 h达到了最高值432.4 IU/mL，之后有小幅降低。据此，初步确定在该培养条件下，B.subtilis BE-91菌株分泌β-甘露聚糖酶的最佳时间为10 h。

3 结论

前期研究已表明，B. subtilis BE-91胞外表达β-甘露聚糖酶的最适pH为6.0，最适反应温度和热稳定性均大于60 °C，属于典型的耐热偏酸性β-甘露聚糖酶^[14]。本研究获得的优化生长条件为：0.3%牛肉膏、0.2%酵母膏、0.1%葡萄糖、0.4%魔芋精粉、0.5% NaCl，初始pH 6.0、培养温度35 °C；胞外表达β-甘露聚糖酶活力的摇瓶发酵条件优化组合为：0.7%魔芋精粉、0.4%大豆蛋白、0.1% (NH₄)₂SO₄、0.5% NaCl，发酵温度35 °C和起始pH 6.0。优化条件下发酵10 h，β-甘露聚糖酶活力最高达432.4 IU/mL。与国内外已有相关报道相比^{[21, 22, 23]}，发酵时间缩短了14-86 h、最高酶活力提高了5倍以上。由于本实验的发酵培养基采用价格低廉的魔芋精粉兼做碳源和产酶诱导物，大大节省了β-甘露聚糖酶的生产成本^[24]。因此，B. subtilis BE-91培养与发酵周期短、胞外表达β-甘露聚糖酶的活性高，是酶制剂产业具有重大开发价值的菌种资源。本研究中的最适生长温度和发酵温度相同(均为35 °C)，最适生长和发酵的初始pH值也相同(均为6.0)。由于二者的主要外界环境参数相同，不仅减轻了菌体生长和发酵产酶的同步最优化的技术难度，还可简化实际生产的操作流程。

本研究的目标菌株B. subtilis BE-91在发酵10 h产β-甘露聚糖酶达到432.4 IU/mL，较国内外其他报道具有产酶早、酶活力高的优势。综合考虑产量和生产成本，利用B.subtilis BE-91生产耐热偏酸性β-甘露聚糖酶，值得进一步中试^[25]。