近年来研究表明，不同酿造环境中(葡萄酒、啤酒、清酒和面包等)的酵母菌株，尤其是Saccharomycescerevisiae具有不同的表型特征以适应不同环境^[1]，即使是同一种属的不同菌株之间的性质，包括耐受性、发酵性能以及在发酵食品风味中的功能也会不同^{[2, 3, 4]}。Jeyaram等^[5]分析了来自两个不同地域的16株S. cerevisiae的遗传多态性，发现其基因组结构有很少的同质性，包括染色体数量、染色体长度及基因序列等。Romano等^[6]发现野生葡萄酒酿造中不同菌株产生挥发性产物不同。Tristezza等^[7]发现不同S. cerevisiae菌株的高级醇产量显著不同。与国外研究相比，目前国内研究领域对S. cerevisiae的认识仅限于耐受性或发酵力等一两个方面的特性，缺乏生理代谢的系统性研究。

中国酱香型白酒采用高温制曲、高温堆积、高温发酵的独特酿造工艺，造就了特殊酿造环境，具有高温、高酸、高浓度乙醇等多种胁迫因素。例如，其制曲过程中温度最高可达60 °C，堆积过程中表面温度最高达48−49 °C，发酵过程中温度最高达38−39 °C^[8]，同时发酵过程中酸度可达pH 2.0左右^[9]、乙醇可达15% (体积比)^[10]以上。特殊的酿造环境通过长时间的驯化作用积累了具有独特理化特征的微生物菌群。

酵母菌作为白酒发酵生产中的主要菌群，其种类与数量在不同香型白酒中有很大的不同。酱香型白酒特殊的酒体风格在于其独特酿造工艺所形成的特殊微生物区系。但是，酵母菌通常在发酵过程前期具有较强新陈代谢，随着发酵过程中各项胁迫因子的提高，酵母菌的生理代谢活动逐渐受到抑制，对发酵原料的转化利用能力及乙醇的发酵生产能力逐渐下降，甚至停止^[11]。因此，选育高胁迫环境条件下仍具有旺盛的生理代谢活动及乙醇发酵生产能力的酿酒酵母并进行功能研究，有目的地将其应用于白酒实际生产中，是白酒生产实践中提高原料利用率和产酒率及酒质的技术关键。优良发酵性能酵母菌的筛选及应用，将改善传统的白酒生产工艺。此外，认识解读其不同于其他工业酿造酵母的生理代谢特征，对中国白酒的发展将具有重大现实意义。

本文通过对贵州茅台酒某名优酒厂酱香型酒醅中酵母菌的分离筛选，并结合现代分子鉴定手段鉴定得到一株酿酒酵母MT1 (CCTCC M 2014463)。通过与模式菌株S.cerevisiae S288c及其他菌株的生理生化特征的比较分析，发现MT1具有高耐受力、高效的发酵性能及广泛的碳源利用图谱，并能生成多种挥发性物质。将其应用于白酒实际生产中，将改善传统的白酒生产工艺，提高白酒生产的产量与产值，产生较大的经济效益。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品及菌种：酒醅采集于贵州茅台酒某名优酒厂酱香型白酒车间正常发酵窖池。模式菌株S. cerevisiae S288c (ATCC204508)购于Biological Resource Center，NITE (NBRC)。商业酵母菌株为丹宝利酿酒酵母(酒类专用，型号133)与安琪酿酒酵母(白酒酿造用，商品编号1138678700)，清酒酵母K9来自本实验室。

1.1.2 培养基：WL培养基^[12]，TTC上层培养基^[12]，YPD培养基^[12]，发酵培养基：高粱粉碎后称500 g，加4倍体积水，加入适量液化酶后蒸煮至糖度达18 °BX，冷却后加入糖化酶，60 °C保温4 h，过滤离心后加水稀释至糖度10 °BX。

1.1.3 试剂：培养基试用剂购自国药集团化学试剂有限公司；PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；乙醇、薄荷醇等色谱纯化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法 1.2.1 优良酿酒酵母菌株的筛选：(1) 分离纯化。取5 g酒醅至加有玻璃珠的100 mL生理盐水中，30 °C、200 r/min培养20 min；采用平板稀释法^[13]分离菌株，在WL平板上涂布10⁰−10⁻³ 4个稀释度，每个稀释度3个平行，30 °C培养；挑选菌落形态呈圆形，中央绿色或蓝绿色，边缘白色，表面光滑，边缘整齐的菌株^[14]进行划线纯化。(2) TTC法和杜氏管发酵法初筛。将分离纯化的菌株转接到YPD平板上，30 °C培养1−2 d，倒入TTC上层培养基，避光保温2−3 h，挑选红色较深的菌株；将TTC法初筛得到的菌株接种YPD液体试管于30 °C、200 r/min培养后等量接种含有杜氏小管的YPD培养液中于30 °C培养，每隔3 h观察产气情况，每株2个平行，挑选产气多且快的菌株。(3) 耐受性和发酵性能复筛。将初筛得到的菌株接种YPD培养液于30 °C、200 r/min培养获得种子液，等量转接至相应培养基静置培养48 h；以YPD培养液为基础培养基，耐受条件分别为42 °C，12% (体积比)乙醇，pH 2.7 (乳酸调)，每个条件3个重复；将初筛得到的菌株接种高粱汁试管于30 °C、200 r/min培养获得种子液；取250 mL三角瓶装液量100 mL，接种量2%后装发酵栓并称重，于30 °C培养，每隔12 h振荡称重，记录失重量，当12 h失重量小于0.2 g时，停止发酵，12 000 r/min离心15 min取上清。(4) 菌株分子鉴定。基因组DNA提取采用珠磨法^[15]，PCR反应以NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGG AGGAAAA-3′)和NL4 (5′-GGTCCGTGTTTCAAGA CGG-3′)为26S rDNA序列的上下游引物。PCR反应体系(25 μL)为：模板DNA 1 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，上下游引物(20.0 μmol/L)各0.50 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2.00 μL，rTaq DNA聚合酶(5.0 U/μl) 0.15 μL，ddH₂O 18.35 μL。PCR反应条件为：94 °C 4 min；94°C 45 s，60°C 45 s，72 °C 60 s，30个循环；72 °C 10 min。PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序后进行相似性鉴定。

1.2.2 耐受性能研究：等量接种于9个不同酒精梯度(0%−16%，体积比)、9个不同pH梯度(2.0−6.0)、3个不同温度梯度(30、37、44 °C)的YPD液体培养基，每个梯度3个重复。

1.2.3 发酵性能研究：以DNS法^[16]测定残糖，标准曲线为Y=0.634 8X+0.008，R²=0.998 7；乙醇测定采用HPLC法^[17]，标准曲线为：

Y=0.000 014 487 6X−0.007 96，R²=0.999 16。

1.2.4 产挥发性物质测定：采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法^[18]。

1.2.5 碳源同化：见Biolog YT Microplate使用说明。

2 结果与分析 2.1 优良酿酒酵母MT1的筛选

经分离纯化及初筛共得到20株代谢旺盛，产气多且快的菌株进行耐受性测试。如图 1所示，各菌株的乙醇耐受差异不明显，但是温度耐受及酸耐受的差异很大。其中，13、15、16、17、20号菌株温度和酸耐受都较差，5、6号菌株高温耐受强但酸耐受差，7、8、9、10、18、19号菌株的酸耐受强但高温耐受差，1、2、3、4、11、12、14号菌株3种耐受性都较好。

通过三角瓶扩大实验测定发酵性能相关指标。由表 1可知，上述三项耐受性都较强的菌株中1、2、4、11、12、14号菌株的乙醇转化率都高于85%，发酵性能较好。但是4、14号菌株产生较多异戊醇。1号菌株不仅在较短时间产生较多乙醇，其乙醇转化率达到复筛菌株中的最高值(91.78%)，其异戊醇量也是最少的(2.79 mg/L)。综合复筛试验，选择1、2、11、12号菌株进行菌株鉴定。

2.2 菌株分子鉴定

复筛得到的4株菌经分子鉴定都是酿酒酵母。综合初筛及复筛实验结果，确定1号菌株为目的菌株进行各项生理代谢研究。将其命名为Saccharomyces cerevisiae MT1并保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC M 2014463)。

2.3 S. cerevisiae MT1的耐受性能研究

以模式菌株S288c、商业酵母和清酒酵母为对照，研究了S.cerevisiae MT1的耐受能力。由图 2可知，当各项胁迫条件高于一定限度时(温度≥37 °C，乙醇浓度≥12%及pH≤3.5)，MT1的生长逐渐优于其他菌株。在44 °C或16%乙醇或pH 2.0条件下，模式菌株及清酒酵母不再生长甚至开始死亡，MT1仍然可以很好生长。此外，MT1具有略高于商业酵母的耐受性水平，尤其是酸耐受性。综上所述，MT1具有较高的环境耐受力，尤其是酸耐受力。

2.4 S. cerevisiae MT1的发酵性能研究

采用高粱汁培养基比较分析了各项发酵动力学参数，如表 2所示。除生物量对底物的得率系数(Y_x/s)之外，MT1的其他各项指标均要高于S288c。MT1不仅可以更好地生长且可以更快地耗糖产乙醇，其最大比生长速率(µ_max)和最大比乙醇生成速率(q_pmax)分别达到了S288c的125%和114%。还原糖消耗量(S_c)显示MT1在糖浓度很低时仍然可以继续发酵。另外，MT1的乙醇转化率明显高于模式菌株及商业酵母，甚至略高于因高产乙醇而著名的清酒酵母。总之，MT1的较高的乙醇终浓度(ETOH_f)是由生长优势、高发酵力以及优良的发酵性能决定的。酵母菌最重要的功能是产乙醇，工业发酵过程中糖的利用率、乙醇转化率和酒的出酒率主要是由酵母发酵能力决定的。MT1具有高于98%的乙醇转化率，且发酵终乙醇浓度高达43.4 g/L，具有很大的工业应用价值。

2.5 挥发性物质生成的研究

通过比较MT1和S288c的挥发性产物生成发现，二者挥发性产物种类差异较小，而含量差异较大。如图 3所示，MT1的各项挥发性物质总量都高于S288c，尤其是MT1的总醇量达到S288c的4倍，其中MT1的苯乙醇产量达到S288c的8倍，法呢醇和橙花叔醇产量为S288c的2倍。这3种醇类都是白酒中的主要风味物质，苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气；橙花叔醇干甜而少清，带有像玫瑰、铃兰和苹果花的气息，微带木香，香气持久；法呢醇具有甜香、花香、青香。另外，MT1的乙偶姻和大马酮产量分别达到S288c的9倍和3倍，乙偶姻是一种有令人愉快的奶香物质，且具有特殊药理作用；大马酮则具有令人愉快的玫瑰香气。图 4显示了所有风味物质在两株菌的发酵液中的含量差异。MT1和S288c的主要酸类物质都是己酸和辛酸，只有在MT1的发酵液中可检测到的酸类物质有2-甲基己酸(42.14 μg/L)、壬酸(34.80 μg/L)、2-甲基丁酸(79.07 μg/L)、2-苯乙基3-甲基丁酸(163.91 μg/L)、2-苯乙基2-甲基丙酸(291.11 μg/L)、山梨酸(42.81 μg/L)等。MT1和S288c产生的主要酯类物质都是己酸乙酯，只在MT1发酵液中检测到的酯类物质有：棕榈酸乙酯(62.88 μg/L)、二-(2-苯乙基)-草酸酯(163.91 μg/L)、十五烷酸-3-甲基丁酯(45.68 μg/L)、己酸己酯(76.04 μg/L)等。此外，还检测到MT1合成了一定量的苯并噻唑(144.98 μg/L)、2,3-二氢苯并呋喃(622.33 μg/L)、4-乙烯基愈创木酚(404.79 μg/L)及具有抗氧化能力的丁羟甲苯(358.37 μg/L)等。

酱香酒香气成分研究始于20世纪60年代，乙基愈创木酚、乙偶姻、呋喃类等被认为是其主体香。马荣山等^[19]从麸曲酱香型酒醅中分离得到7株酵母菌，发现部分酵母酿造产酒具有明显酱香风格。Wu等^[8]系统分析9个种属酵母的酿造特性，发现S.cerevisiae和Schizosaccharomyces pombe (粟酒裂殖酵母)很有可能是主要产酱香的酵母属。吴徐建^[20]系统追踪酱香型白酒酿造体系中酵母群落结构并分析不同酵母种属对酱香物质形成的贡献，研究发现Zygosaccharomyces bailii (拜耳接合酵母)、S. cerevisiae、S. pombe (粟酒裂殖酵母)对酱香的产生具有积极贡献。而本文对MT1的挥发性物质生成的研究发现其确实对酱香酒的风味形成具有积极贡献。

2.6 碳源同化研究

如图 5所示，与S288c相比，MT1可以利用更多种类的碳源，如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖、阿洛酮糖、麦芽糖、蜜二糖、松二糖、海藻糖、棉子糖和α-甲基-D-葡糖苷。这一典型特征与酱香型白酒的酿造工艺是密不可分的。由于酱香型白酒酿造属于同步糖化发酵过程，以高粱、麸皮等为原料进行发酵，将糖化过程和发酵过程两个工序结合到一起，使得该体系中含有多种多样的碳源组分，除了多种单糖(葡萄糖、半乳糖和果糖等)之外，不乏各种二糖(蔗糖、麦芽糖、蜜二糖和海藻糖等)、三糖及多糖。在长期的环境压力驯化下，环境中的微生物可以通过基因重组或基因漂移等方式获得相应的基因型从而具有独特的生理生化特征^[21]。如Novo等通过全基因组学研究发现S.cerevisiae EC1118中有一些关键基因通过基因漂移由Z. bailii物种获得^[22]。

3 结论

通过各项生理代谢的系统性研究，可以看出酱香酒酿造中酿酒酵母MT1具有高环境耐受力、高效发酵和多碳源利用的特征，并可产生多种挥发性物质。众所周知，酿酒酵母是白酒生产中的主要微生物，对白酒的产量、质量及风味等方面具有重要作用。而在工业发酵过程中不可避免地存在一些因素对酿酒酵母产生胁迫作用(如酒精毒性，高温胁迫等)，酿酒酵母对这些胁迫条件的耐受性直接关系到工艺、设备的确定，进而影响经济效益。因此提高菌株对胁迫条件的耐受性是酿酒酵母工业菌株改良的重要目标之一。另一方面，目前发酵产业中存在发酵过程副产物浓度偏高、底物转化率偏低和生长周期过长等问题，构建少产副产物而高产乙醇的酿酒酵母工业菌株是近年来的研究热点。而通过基因改造等手段构建的工程菌则面临菌株性能不稳定的关键问题。因此，选育性能优良的菌株并有目的地将其应用于白酒实际生产中，是白酒生产实践中提高原料利用率和产酒率及酒质的技术关键，将改善传统的白酒生产工艺，促进白酒生产的产量与产值的提高，产生较大的经济效益。