萜类化合物(Terpenoids)，又称类异戊二烯，在自然界中分布十分广泛，是植物次生代谢产物，由异戊二烯(Isoprene)单元组成的化合物及其衍生物。根据所含异戊二烯数目的不同可以分为单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)、四萜(C40)和多萜等。由于萜类化合物分子中含有不同的碳环数目，又可因此分为链萜、单环萜、双环萜和三环萜等^[1]。

萜类具有重要的商业价值，被广泛应用于工业、农业、医药卫生等领域。近几年来，植物萜类在医药上的成功应用引起了人们的广泛关注。比如青蒿素作为倍半萜类衍生物用于治疗疟疾^{[2, 3]}；紫杉醇作为二萜类衍生物用于治疗各种癌症^{[4, 5, 6]}；人参皂苷作为三萜类化合物常用于中药配方^{[7, 8]}；番茄红素作为抗氧化剂用于各种保健品^{[9, 10, 11]}；银杏内酯B作为迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂，用于治疗缺血性脑中风的痰瘀阻络症^[12]；长春花萜类吲哚生物碱广泛应用于临床抗肿瘤、降血压、降血糖等^[13]；柠檬烯具有良好的镇咳、祛痰、抑菌作用^{[14, 15]}；榄香烯也被开发为抗肿瘤新药^{[16, 17, 18]}，等等。因为资源的有限性，直接从植物里提取这些萜类物质远远不能满足人们的需要，而且植物生长周期长、投入大、不易管理。

对酵母的萜类生物合成途径进行人为设计来生产萜类物质是近年来迅速发展的生物合成技术在应用上的具体表现。通过改造酵母的方式来生产这些萜类，不但成本低，周期短，而且不受地域环境影响，表达稳定，便于工业化生产及下游分离，使这些萜类物质更能为人类所应用^{[19, 20]}。

萜类在植物中包括初生代谢物和次生代谢物两大部分。初生代谢物在植物基本生命活动中发挥着重要作用，例如植物甾醇参与细胞生物膜的构建^[21]；叶绿素、类胡萝卜素和质体醌参与其光合作用^{[22, 23]}；泛醌参与呼吸作用里的氧化还原反应^[24]；脱落酸、赤霉素、油菜素内酯和细胞分裂素则调节植物生长发育^{[25, 26, 27]}；多萜醇和异戊二烯基团参与蛋白修饰等^[28]。植物的次生萜类代谢物的生物学功能主要表现在植物与环境的相互作用方面，如吸引传粉动物、防御食草动物吸食和病原微生物感染等^{[29, 30]}。

植物萜类生物合成主要有两条途径。第一条是甲羟戊酸(Mevalonic acid，MVA)途径。它定位于细胞质中，以乙酰辅酶A作为原初供体生成异戊烯焦磷酸(Isopentenyl diphosphate，IPP)，倍半萜类化合物、类固醇(甾体类)等经由这一途径合成^[31]；第二条途径是2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸(2-Methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途径，它主要在植物质体中进行，以IPP为中间产物，分别合成叶绿素、叶醌、赤霉素、脱落酸、生育酚、单萜和质体醌等^{[32, 33]}。在以酵母为宿主菌的基因改造研究中，主要是集中于MVA途径的改造。

为便于研究，可把植物萜类生物合成分为3个阶段：(1) 前体形成。包括起始单元IPP及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)、直接前体牻牛儿基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)，法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP)，牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(Geranyl geranyl diphosphate，GGPP)，牻牛儿基法尼基焦磷酸(Geranylfarnesyldiphosphate，GFPP)；(2) 骨架构建。分别包括单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜等萜类骨架的形成；(3) 后修饰过程。根据修饰反应类型分为羟化反应、酰化反应、糖基化反应等。IPP与DMAPP是植物中萜类合成的共同前体，在相关酶GPPS (Geranyl diphosphate synthase)、FPPS (Farnesyl diphosphate synthase)、GGPPS (Geranylgeranyl diphosphate synthase)的作用下，IPP与DMAPP头尾缩合生成线性前体GPP、FPP、GGPP。其中，FPP是倍半萜、三萜、多萜的共同前体。在质体中，GPP是单萜的前体，GGPP是二萜、四萜、叶绿醌等的前体^{[34, 35]}。植物萜类化合物的生物合成示意图过程见图 1。

图 1 　植物萜类 MVA 生物合成途径示意图 Figure 1 　Schematic diagram for the biologic MVA synthesis pathway of plant terpenoid 注：ERG10：乙酰乙酰CoA硫解酶；ERG13：3-羟基-3-甲基戊二酰CoA氧化酶；HMGR：3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶；ERG12：甲羟戊酸激酶；ERG8：甲羟戊酸二磷酸激酶；MVD1：甲羟戊酸二磷酸脱羧酶；IDI：异戊烯基焦磷酸异构酶；IPP：异戊烯基焦磷酸；DMAPP：二甲基烯丙基焦磷酸；GPS：牻牛儿基焦磷酸分酶；GGPPS：牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶；FPPS：法尼基焦磷酸合酶；ERG9：角鲨烯合酶. Note: ERG10: Acetoacety1-CoA thiolase; ERG13: Hydroxymethylglutaryl-CoA oxidase; HMGR: Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase; ERG12: Mevalonate kinas; ERG8: Phosphomevalonate kinas; MVD1: Mevalonate pyrophosphate decarboxylase; IDI: Isopentenyl diphosphate isomerase; IPP: Isopentenyl pyrophosphate; DMAPP: Dimethylallyl pyrophosphate; GPS: Geranyl diphosphate synthas; GGPPS: Geranyl geranyl diphosphate synthase; FPPS: Farnesyl diphosphate synthase; ERG9: Squalene synthase.

图选项

酿酒酵母作为一种安全有效的真核微生物，遗传背景广为熟知，其基因序列早在1996年已被测出。目前，很多实验室研究把植物里特有的一些合成途径转到酿酒酵母，通过发酵，使其生产出植物才能生产的药物、保健品、化工原料等。这既扩展了原料来源渠道，对环境保护也起到了积极作用，而且在经济上也可以使制造加工成本降低^[36]。

纵观目前世界各实验室改造酿酒酵母并通过发酵来生产萜类物质，所做研究工作主要集中于如下几方面：(1) 改变上游的HMGR基因；(2) 导入单个或多个下游靶基因；(3) 反义RNA或RNAi降低某基因表达强度；(4) 改变分叉代谢途径的流向；(5) 通过更换基因启动子来控制基因表达强弱；(6) 物种间同源基因的利用；(7) 转录因子基因的表达调节^[37]。

表 1具体显示了近年来用酵母作为宿主表达菌研究的萜类物质种类、采用的方法策略及研究所取得的成果。

目前用酵母代替高等植物来生产合成其次生代谢物萜类化合物还存在很多的问题，归纳起来，主要有以下几方面原因：(1) 植物中，后翻译修饰酶种类繁多^[49]。不但已经分离得到的萜类结构复杂，其中间代谢产物也多种多样，多种酶多步参与催化；改变代谢途径中的一种酶活性就会影响到多种中间产物浓度，也因此影响其它酶活性。(2) 某些表达调控机制还不清楚。因为后修饰酶调控网络复杂，有些酶只有痕量水平表达，分离难度大。(3) 萜类代谢过程复杂。对上、下游某些所谓关键基因进行改造后，中间各种代谢产物的浓度就会相应变化，使各方向的代谢流此消彼长，其规律难以把握。(4) 酵母经过改造后，其生长稳定性可能会受到很大影响，发酵过程不易控制，副产物量比重大，导致关键产物产量不高。

针对这些可能存在的问题，结合前人大量研究结果(表 1)，可以采取一些适当的策略，总结如下：(1) 适当提高上游关键酶(比如HMGR、IDI)的活性，直接增强前体物质IPP和DMAPP的供应^{[50, 51]}。(2) 除了提高关键酶的活性，同时也要关注那些非限速酶的活性，找到他们最佳配合的平衡点。(3) 在酵母中异源表达植物基因时，要注意密码子优化，使其适合酵母菌的调控生长环境。(4) 根据目标产物，提高关键前体底物浓度。比如要提高青蒿素的产量，可以通过提高FPPS活性来提高FPP的量；要提高番茄红素的产量，则可通过加强GGPPS的活性来提高GGPP的量。(5) 抑制竞争代谢途径。方法有反义RNA技术及同源阻断等。比如鲨烯合酶和紫穗槐-4,l1-二烯合酶竞争性地利用FPP，则可通过反义RNA技术抑制鲨烯合酶的表达，增加青蒿素代谢流中FPP的量。(6) 合理利用选择压力，挑选耐受突变菌株。比如在培养基中施以适当浓度的制霉菌素、角鲨抑素、外源胆固醇等来选择固醇耐受菌株，可能其甲羟戊酸途径某些部分会得到加强，然后根据目标生产萜类，突变其关键基因，使其前体物质合成量增加，继而达到目标产物的增加。

总之，在对微生物进行代谢途径改造和再造时，可以根据目标产物选取关键的中间产物和主要路径，使关键中间产物的前一步反应的底物浓度增高，即“Push”策略；同时要加强催化此关键中间产物的酶活性水平，即直接“Pull”策略；然后考虑所有有竞争性的旁路代谢，改变旁路代谢流方向，即“Restrain”的策略^[52]。综合多种方法，找到菌株适应生产的最佳平衡点，同时优化下游发酵及提纯工艺，从而达到比较理想的改造目的。

自然界中，萜类化合物种类众多，但因资源有限、提取工艺复杂，难以大量生产。如青蒿素虽然是很好的抗疟疾药物，但受资源限制，导致供不应求。而尝试用微生物改造的方法大量获得青蒿素，则是可持续发展战略，但目前也只能得到中间产物青蒿酸，还需要借助化学半合成的方法才能获得功能完全的青蒿素。在酵母中青蒿酸的成功生物合成对人们利用微生物发酵生产其他药物是一个很大的鼓舞。目前很多实验室也在试图用类似的策略来生产紫杉醇等高效、高价药物，但仍然没有成功。归纳起来，问题主要有两个方面，一是紫杉醇本身的生物合成通路复杂，在酵母中难以再建一条这样的通路而不影响酵母生长；二是还有些通路处于模糊状态，比如MVA通路中一些关键前体FPP、GGPP等流向其它通路，一些关键酶还有待进一步进行鉴定及克隆，如紫杉烷1β-羟化酶、紫杉烷9α-羟化酶、紫杉烷9-酮基-氧化酶、紫杉烷C4,C20-β-环氧酶等。

酵母作为一种相对简单、安全的微生物，其正常的生长环境通过不断进化已经达到了一个平衡状态，人为地从基因组水平彻底地对其进行改造，它的一些生理功能有可能会受到影响而不能正常生长，或许经过改变后产生一些对人类有害的物质，所以在产品应用时也要加强评估。对它的一些旁路途径进行改造后要保证它的正常生长，以便最终正常发酵。选择性地在酵母中调控类萜生物合成途径；优化植物基因在其体内表达；从总体上来提高萜类合成前体和下游萜类产物的表达量。这样，随着生物技术的成熟，可以直接将某个物种的代谢途径转入工程菌实现工业化生产，但前提是要将代谢途径和调控研究透彻，而后修饰酶因其多样性和复杂性将是难点。但我们有理由相信，在不久的将来，利用微生物发酵技术来生产紫杉醇、人参皂苷等药物必将有很大的突破。