萜类化合物(Terpenoid)是自然界中结构最为多样、种类最为丰富的天然产物^[1]。萜类合成酶(Terpenoid synthase，TPS)是萜类化合物合成的关键酶。根据异戊二烯(isoprene，C5)单元数的不同，萜类化合物可分为单萜(monoterpene，C10)、倍半萜(sesquiterpene，C15)、二萜(diterpene，C20)、三萜(triterpene，C30)和多萜等。在生物体内，萜类化合物可通过两条不同的途径合成，即甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)途径与甲基赤藓糖磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途径。除了植物可同时利用MVA和MEP途径外，大部分生物体只能利用两条途径中的一种^[2]。细菌主要利用MEP途径进行萜类产物的合成^[3]，即首先合成异戊烯基焦磷酸(Isopentenylallyl diphosphate，IPP)前体和二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)；然后IPP和DMAPP在聚异戊二烯焦磷酸合成酶(Polyisoprenyl diphosphate synthase)的作用下缩合成长度不同的非环化前体，即香叶基焦磷酸(geranyl diphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)；最后这些前体在TPS的催化下环化重排形成萜类化合物。

萜类化合物具有重要的生理、生态和药用价值，它们作为激素、味道与气味成分以及抗生素被广泛应用。长期以来人们在各种物种中不断探究TPS的功能。在植物中，TPS已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)^[4]、水稻(Oryza sativa)^[5]、杨树(Populus trichocarpa)^[5]、葡萄(Vitis vinifera)^[5]和番茄(Solanum lycopersicum)^[6]等物种中被报道。在真菌中，TPS已经在娄地青霉(Penicillium roqueforti)^[7]、土曲霉(Aspergillus terreus)^[8]和葡萄孢菌(Botrytis cinerea)^[9]等物种中被发现。以前人们认为TPS只存在于植物和真菌中^[10]，但随着人们对细菌气味与挥发性物质代谢的探索^[11,12,13]，细菌TPS的研究逐渐引起人们的重视。Dairi等^[14]于2001年首次在Kitasatospora griseola MF730-N6中发现了二萜合成酶。目前发现的细菌TPS主要集中在革兰氏阳性菌如链霉菌属的细菌以及其他一些放线菌中^[15]，如从链霉菌属Streptomyces lasaliensis NRRL 3382^[16]与Streptomyces coelicolor A3(2)^[17]分别发现能够合成2-methylisoborneol的基因tpc和sco7700；从Streptomyces coelicolor A3(2)^[18]发现能够合成epi-isozizaene的基因sco5222；从Streptomyces melanosporofaciens MI614-43F2^[19]中发现了1个二萜合成酶基因簇，由cotB1、cotB2、cotB3、cotB4组成。

目前对于TPS的研究主要集中在植物和真菌中，而对细菌TPS的研究尚少。随着越来越多的细菌基因组被测序，单靠传统的实验方法去鉴定细菌TPS的功能，已经远远落后于数据增长的速度，迫切需要开发和利用新的手段对细菌TPS进行系统研究。建立在已经被大量测序的细菌基因组基础上，本文利用生物信息学方法，对细菌TPS在全基因组范围内进行了识别、分类和功能分析，这为系统理解细菌TPS的物种分布、分类、功能和进化奠定了很好的基础。

Pfam数据库中^[20]标号为PF03936的结构域是TPS蛋白的特征结构域。首先从Pfam数据库中(http://pfam.xfam.org/)下载此结构域包含的信息，然后从NCBI (National Central for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=bacteria)下载4 705个完成基因组测序的细菌的蛋白质序列(共44 322 195条)构建本地细菌蛋白质组数据库。

利用基于隐马尔科夫模型的HMMER2.3.2^[21]程序，以PF03936为检索模型，搜索本地细菌蛋白质组数据库中含有TPS结构域的候选序列，E-value设为<10−5^{[22, 23]}。

利用MAFFT 7.130b^[24]中的L-INS-i方法对搜集到的细菌TPS序列进行多序列比对分析。比对结果用MEGA 6.0^[25]软件构建细菌TPS蛋白的分子系统进化树。建树方法为最大似然法(Maximum likelihood)。具体设置参数Test of Phylogeny：Bootstrap method；Replications：500；Model：Jones-Taylor-Thornton (JTT) model；Rates among Sites：4；Gamma Distributed (G)；Gaps：Complete deletion。其余参数为默认。

利用MEME[^26] (http://meme.nbcr.net/meme/)对TPS蛋白的保守基序(Motifs)进行了图示，具体参数设置如下：The occurrences of a single motif are distributed among the sequences：Zero or one per sequence；Minimum width (≥2)：6；Maximum width (≤300)：50；Maximum number of motifs to find：20。其余参数为默认。

为了研究各个点突变对整条蛋白序列功能的影响，选择代表性的细菌TPS序列，使用PredictProtein (http://ppopen.rostl-ab.org/)对其进行点突变分析，此预测基于SNAP2，在分析点突变对功能的影响时准确性能达到82%^[27]。

为了系统探索细菌TPS，以TPS的隐马尔科夫模型HMM (Hidden Markov models) PF03936为查找模型，利用HMMER软件搜索本地自建的细菌蛋白质数据库，共得到具有统计学显著性的1 423条匹配序列(E-value<10⁻⁵)，即为预测的细菌TPS。

分析表明，这1 423条TPS来自553个细菌基因组中，它们主要分布于细菌8个门中(图 1A)，在放线菌门(Actinobacteria)的405个基因组中发现了1 206条TPS，占总数的84.751%，在变形菌门(Proteobacteria)的95个基因组中发现了141条，在蓝藻门(Cyanobacteria)的21个基因组中发现了29条，在拟杆菌门(Bacteroidetes)的16个基因组中发现了27条，在厚壁菌门(Firmicutes)的8个基因组中发现了9条，在绿弯菌门(Chloroflexi)的5个基因组中发现了8条，在酸杆菌门(Acidobacteria)的2个基因组中发现了2条，在衣原体门(Chlamydiae)的1个基因组中发现了1条，它们所占TPS总数的比例依次为9.909%、2.038%、1.897%、0.632%、0.562%、0.141%和0.07%。研究结果显示，细菌TPS主要集中在放线菌中，这与所报道的结果是一致的^[15]。与前人^[10]的研究结果相比，厚壁菌门(Firmicutes)和酸杆菌门(Acidobacteria)中的细菌TPS是我们基于预测模型发现的。对放线菌门(Actinobacteria) TPS的物种分布进一步分析表明，链霉菌科(Streptomycetaceae)所含序列数目最多(图 1B)，达到902条之多，占放线菌门TPS总数的74.793%，其余科所含序列数目均在100条以内。

图 1 　细菌萜类合成酶的分布情况 Figure 1 　Distribution of terpenoid synthase in bacteria 注：A：在各个门中的分布情况；B：在放线菌门各个科中的分布情况. Note: A: Distribution for each phylum; B: Distribution for each family of Actinobacteria.

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通常单种细菌含有的TPS数在10个以内(表 1)，但我们的研究发现一些细菌含有更多数目的TPS，它们的物种分布是：棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus ATCC 27064，拷贝数为26个)、砂栖海水小单胞菌(Salinispora arenicola CNS-205，拷贝数为27个)，分别属于放线菌门(Actinobacteria)的链霉菌科(Streptomycetaceae)和小单胞菌科(Micromonosporaceae)。这些编码多拷贝的TPS基因可能是由细菌TPS基因倍增或者基因水平转移引起的，它们在细菌TPS的产物多样性中扮演着重要角色，其潜在的分子机制还需要进一步研究。

为了研究细菌TPS的进化关系，根据细菌萜类合成酶在各个门类中的分布情况选取109个典型细菌TPS以及6个已被实验证实的二萜合成酶进行蛋白序列分析。首先利用多序列比对软件MAFFT对细菌TPS蛋白序列进行比对，然后利用MEGA软件中的最大似然法构建细菌TPS蛋白序列的分子进化树。根据进化树的拓扑结构，将细菌分为4大类(图 2)。第1类(Group Ⅰ)包含41个序列，分布在放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)中；第2类(Group Ⅱ)包含33个序列，分布在放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、衣原体门(Chlamydiae)中；第3类(Group Ⅲ)包含19个序列，分布在放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)中；第4类(Group Ⅳ)包含9个序列分布在放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)中；未能分类的包含13个序列，分布在放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)中。其中放线菌门(Actinobacteria)的TPS分布最广，在各大类中都存在，Group Ⅱ所含细菌种类最多，包含了预测到的TPS所在的所有门类。绿弯菌门(Chloroflexi)的TPS仅在Group Ⅱ中出现，这一方面暗示这些TPS具有功能特异性，另一方面可能是由绿弯菌门发现的包含TPS的细菌种类较少造成的(仅有5种细菌)，但对其进一步的探索需要实验验证。

图 2 　115个典型细菌TPS蛋白序列的系统进化树 Figure 2 　Phylogenetic tree of 115 typically bacterial TPS protein sequences 注：括号中的序号表示GenBank蛋白登录号，分支上的数字表示Bootstrap值(<30的隐藏). 进化树中不同颜色的序列名称代表不同类别的TPS：绿色代表Group Ⅰ，红褐色代表Group Ⅱ，紫色代表Group Ⅲ，水绿色代表Group Ⅳ，黑色为无法分类的TPS序列. Note: The numbers in parenthesis represent GenBank accession numbers, the numbers on each branch indicate the bootstrap values (hide if <30). Sequences names with different colors in the tree represent different groups of TPS: green represent Group Ⅰ, reddish brown represent Group Ⅱ, purple represent Group Ⅲ, aqua represent Group Ⅳ, black represent sequences that can’t be classified.

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建立在细菌TPS分类的基础上(图 2)，可以在每个类别中根据已知功能的细菌TPS去预测未知TPS的功能。因为在Group III中，已知的TPS功能主要为单萜合成酶(monoterpene synthase)，所以我们推测Group III中的未知TPS也可能为单萜合成酶。同样的道理，我们可以推测Group I和Group II中未知功能的TPS主要为倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase)。Group Ⅳ包含了6条被实验证实的二萜合成酶(diterpene synthase)及3条本研究预测的TPS，推测此类可能为二萜合成酶。

虽然植物、真菌和细菌中TPS的氨基酸序列差异很大，但是所有的TPS序列都具有2个高度保守的金属离子结合基序：第一个基序为-DDxx[D/E]-或-DDxxx[D/E]-，此基序富含酸性氨基酸，在细菌TPS中经常位于N末端下游80−120个氨基酸处，本研究发现此基序在Group Ⅱ中为-DDxx[D/E]-，而在Group Ⅰ与Group Ⅲ中为-DDxxx[D/E]-；第二个基序为-xxNDxxSxxxE-，通常位于第一基序下游140±5 aa处，这与以前报道的结果是一致的^[28]。

值得注意的是我们发现-DDxx[D/E]-或-DDxxx[D/E]-基序的氨基酸组成在不同类别的细菌TPS中具有很大差异(图 3，红色方框标记)：Group Ⅰ与Group Ⅱ的上游基序富含酸性氨基酸并含有高比例的芳香族氨基酸，这个保守基序又分为-FxFDDHFLE- (图 3A)和-FFxxDDxxD- (图 3B)两种情况。Group Ⅲ的上游基序为-xVDDxxx[D/E]- (图 3C)，虽然同样富含酸性氨基酸，但芳香族氨基酸的含量要低于Group Ⅰ与Group Ⅱ。相对而言，下游的保守基序-xxNDxxSxxxE-在这3个类群中都很保守(图 3，蓝色方框标记)。虽然Group Ⅳ的6条蛋白序列已被实验证实是二萜合成酶[^29] (diterpene synthase)，但序列比对结果表明-DDxx[D/E]-和-xxNDxxSxxxE-的保守性较低。

图 3 　细菌TPS在各个类群的序列比对结果 Figure 3 　Alignment of amino acid sequences of bacterial TPS in each group 注：A：Group Ⅰ的序列比对结果；B：Group Ⅱ的序列比对结果；C：Group Ⅲ的序列比对结果；D：Group Ⅳ的序列比对结果. 红色方框中为-DDxx[D/E]-或-DDxxx[D/E]-基序，蓝色方框中为-xxNDxxSxxxE-基序. Note: A: Alignment result in Group Ⅰ; B: Alignment result in Group Ⅱ; C: Alignment result in Group Ⅲ; D: Alignment result in Group Ⅳ. The sequence in red box is -DDxx[D/E]- or -DDxxx[D/E]- motif, the sequence in blue box is -xxNDxxSxxxE- motif.

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为了进一步分析细菌TPS序列在各个类别之间的差异性，利用MEME软件对TPS序列的Motifs进行了系统分析，并得到20个基序(图 4)。研究发现，这20个基序在不同类群细菌TPS中的分布差异很大。Group Ⅰ所含基序数目最多，为17−19个。Group Ⅱ和Group Ⅲ所含基序数目分别为5−7个和4−5个。Group Ⅳ所含基序数目最少，为1−3个。分析发现Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ所共有的Motifs为Motif 2和Motif 5 (图 5A)；Group Ⅰ特有的Motifs为Motif 15和Motif 19 (图 5B)；Group Ⅲ所特有的Motif为Motif 18 (图 5C)，Group Ⅱ和Group Ⅳ所含的Motifs均在其他类群中出现过，无特异Motifs。

图 4 　典型细菌TPS的Motifs Figure 4 　The motifs of typical bacterial TPS 注：左半部分为TPS的分子进化关系；中间为TPS motifs组成结构的Combined P-value；右半部分为20个Motifs在TPS中的分布. Note：Left part illustrates the molecular phylogenetic relationships among TPS. Middle part indicates combined P-value of motifs structure of TPS. Right part shows 20 motifs distribution in TPS protein sequence of bacteria.

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图 5 　细菌TPS在各类群中共有及特有的Motifs Figure 5 　Common and group-specific motifs of bacteria TPS in each group 注：A：Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ共有的基序(Motifs)；B：Group Ⅰ特有的基序(Motifs)；C：Group Ⅲ特有的基序(Motif). Note: A: In common motifs of Group Ⅰ, Group Ⅱ and Group Ⅲ; B: Motifs specific to Group Ⅰ; C: Motif specific to Group Ⅲ.

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萜类产物是由其TPS决定的，而TPS的重要氨基酸位点的点突变通常可导致TPS功能(主要指TPS的酶活和TPS的萜类产物)的改变。为了识别和理解细菌TPS中重要氨基酸位点突变对TPS功能的影响，选取Group Ⅲ中的一条序列(登录号为NP_733742.1)进行点突变分析(图 6)。由于-xxNDxxSxxxE-这个基序在不同细菌TPS之间是非常保守的，并且D的保守性最强，所以无论D被替换成20个氨基酸中的哪一个，都会对TPS的酶活产生严重的影响；而D后第6位的E替换为D时，预测结果为白色，证明此处E可与D互换，但当E替换为除D外的其他氨基酸时，则会对TPS的酶活产生严重的影响。除-xxNDxxSxxxE-外，其他位置的氨基酸突变也会对细菌TPS的功能产生

图 6 　分析点突变对NP_733742.1的功能影响 Figure 6 　Analysis of effect of point mutations of NP_733742.1 注：深红色(>50)：替换后对功能影响很大；绿色和白色(<50)：替换后对功能比较小；黑色：野生型. Note: Deep red (>50): have great influence on function if replaced; Green and White (<50): have relatively small influence on function if replaced; Black: Wild type.

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很大影响(详见图 6中红色箭头位置所示的氨基酸位点E、A、G、A、N和L)，由于这些氨基酸位点在不同细菌之间是不保守的，所以这些氨基酸位点的突变可能导致萜类产物的改变。细菌TPS的重要氨基酸位点的识别，为今后定向改变萜类合成酶的功能，利用代谢工程方法改变目标萜类产物提供了理论基础。同时，我们的点突变方法也可以应用到其他细菌TPS的功能分析中。

鉴于TPS具有重要的生理、生态和药用价值，长期以来人们一直对不同的物种进行TPS的识别和功能研究，并在拟南芥、水稻、杨树、葡萄、番茄、土曲霉、娄地青霉、葡萄孢菌等许多物种中进行了较为系统的研究。但相对于植物和真菌TPS的识别和功能研究，细菌TPS的系统研究尚少，本研究通过对细菌TPS的系统分析，在厚壁菌门(Firmicutes)和酸杆菌门(Acidobacteria) 2个门中发现了新的TPS，这为今后利用这些新发现TPS进行功能分析和揭示不同细菌门类之间TPS的进化关系打下了很好的基础。

不同物种TPS的功能探究一直是TPS研究领域的热点，为了系统探究细菌TPS的特征和功能，本文利用MAFFT、MEGA、MEME、PredictProtein等生物信息学方法，从不同角度对细菌TPS进行了预测和分析，通过分子进化、Motifs及点突变影响分析，我们对细菌TPS功能差异的可能原因进行了多层次研究(不同类别之间的差异、Motifs差异和TPS中不同位点氨基酸的差异)，这为今后深入研究细菌TPS的功能提供了理论支撑和数据来源。