2015, Vol. 42扩展功能
文章信息
- 黄翔峰, 方正, 黄薇, 彭开铭, 陆丽君, 刘佳
- HUANG Xiang-Feng, FANG Zheng, HUANG Wei, PENG Kai-Ming, LU Li-Jun, LIU Jia
- MATH法表征环境微生物细胞表面疏水性的研究进展
- Recent progress on MATH characterizing the cell surface hydrophobicity of environmental microorganisms
- 微生物学通报, 2015, 42(1): 200-206
- Microbiology China, 2015, 42(1): 200-206
- 10.13344/j.microbiol.china.140397
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文章历史
- 收稿日期: 2014-05-10
- 接受日期: 2014-06-25
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2014-10-14
微生物细胞表面理化性质对微生物的生长代谢过程至关重要,在微生物领域有关表面理化性质的研究正在逐渐增加。微生物细胞表面理化性质主要包括疏水性和表面带电性等。细胞表面疏水性(Cell-surface hydrophobicity,CSH)是微生物细胞最重要的理化性质之一,主要影响细菌非特异性吸附到生物或非生物表面以及界面。在环境微生物研究领域,微生物细胞表面的疏水性对生物絮凝、生物挂膜、污染物的吸附降解利用等过程有重要影响,同时还直接影响了环境微生物各种重要生物过程的效率,如生物降解、生物发酵和污水处理等。
目前微生物细胞表面疏水性的测试手段和方法有疏水作用色谱法[1]、盐聚集测试[2]、接触角测量[3]、聚苯乙烯微球吸附法[4]、微生物碳氢吸附能力(Microbial adhesion to hydrocarbons,MATH)[5] 等,其中接触角测量和微生物碳氢吸附能力是最常用的两种方法。这两种方法对微生物进行测试的结果如表1所示,由表1的研究结果可知,MATH与接触角表征同一种微生物细胞疏水性具有较好的相关性。相比于接触角测量,微生物碳氢吸附能力在环境领域的应用更为广泛。MATH自Rosenberg[9]在1980年首次提出用于测试细菌细胞表面疏水性的研究以来,近三十年来取得了较大的进展,该方法在环境工程[10,11,12,13]、生物工程[14,15,16,17]、石油开采[18]、医学[19,20]、食品工程[21,22,23]等领域应用广泛。
| 微生物种类 Strain | 微生物碳氢吸附能力 MATH (%) | 接触角 Contact angle measurement | 结果 Result | 参考文献 Reference |
| Alcaligenes sp.S-XJ-1 | 78.4 | 114.6 | MATH与接触角结果相关性较好;破乳效果和细胞表面疏水性呈正相关关系 | Liu等(2011)[ |
| Pseudomonas fluorescenes LP6a | 18.3 | 39.7 | MATH与接触角结果相关性较差;菌体形成稳定乳状液能力随着MATH值升高而增强,与接触角结果没有明显相关性 | Dorobantu等 (2004)[ |
| Rhizomonassu berifaciens EB2-1a | 55.0 | 50.3 | ||
| Rhodococcus erythropolis 20S-E1-c | 80.3 | 152.9 | ||
| Acinetobacter venetianus RAG-1 | 95.7 | 56.4 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 33.5 | 33.3 | MATH与接触角结果相关性较好;细胞表面疏水性在细胞凝聚过程中起次要作用 | Lau等 (2009)[ |
| Pseudomonas aeruginosa migA mutant | 38.2 | 34.0 | ||
| Pseudomonas aeruginosa wapR mutant | 40.2 | 34.1 | ||
| Pseudomonas aeruginosa rmlC mutant | 45.2 | 37.5 |
相比于其他方法,MATH方法有很明显的三大优点[9]:(1) 不需要特殊的设备仪器,只需要有振荡器和分光光度计就可以检测细胞表面的疏水性,并且实验结果具有一定的准确性;(2) 吸附到碳氢化合物表面的微生物能够通过显微镜观察到;(3) 使用MATH能够检测的对象比较广泛,不论是混合菌体或单一菌体,还是直接从自然界获得的样品都可以进行测试。除了应用于测试疏水性以外,MATH还被修改应用于测试微生物吸附性[7],测试微生物吸附碳氢化合物过程中不同特性作用力的有机溶剂吸附能力(Microbial adhesion to solvents,MATS)[24],研究微生物细胞表面蛋白质和碳氢化合物相互作用来影响细胞在油水界面吸附的蛋白质吸附能力(Protein adhesion to hydrocarbons,PATH)[25],还有被用于分离亲疏水性的微生物[18]。
MATH方法的基本原理是微生物对碳氢化合物有一定的吸附性,通过分光光度计检测菌悬液在与液相碳氢化合物混合前后水相中细菌细胞浓度的变化。整个实验过程中碳氢化合物被振荡破碎成细小的液滴,随后一些微生物吸附到这些细小的液滴上并在静置的过程中随着液滴上升至试管顶部液滴凝聚实现相分离,微生物也从底部的水相中转移到油相中。
根据XDLVO[26]理论,MATH实验过程中微生物在油水界面的吸附过程中受静电斥力(Eletrical double bayer,EL)、非极性的利弗席兹-范德华力(Lifshitz-van der Waals interactions,LW)和极性的路易斯酸碱电子作用力(Lewis acid-base interactions,AB)共同作用。此外,微生物表面具有复杂的物质结构,在细菌吸附碳氢化合物的微观过程中,也要考虑位阻效应和架桥作用[27]。所以这个方法的整个过程受到细胞的疏水性、表面电荷以及细胞双分子层结构等共同决定,也受到油相种类和油水体积比、缓冲液离子浓度和pH等实验操作因素的影响。因此,采用MATH方法准确表征细胞表面疏水性因其影响因素的复杂性而具有一定难度。
环境微生物技术在环境领域具有广泛的应用,目前关于环境微生物细胞表面疏水性的研究,在环境领域主要集中在污水处理中污泥絮体性能表征、难降解有机物降解、MBR膜污染控制、乳状液破乳等方面。
在污泥絮体性能的研究方面,MATH可以用于测试好氧生物絮体中的微生物细胞疏水性,一般研究表明污泥中微生物表面的亲疏水性对污泥性能的影响十分显著。在研究不同亲疏水性微生物对好氧颗粒污泥形成的影响时,研究结果表明细胞表面疏水性对好氧颗粒污泥的形成起着重要的作用,并且可能是某种疏水性特别强的微生物对好氧颗粒污泥的形成起着关键的作用[28]。在研究微生物细胞表面性能对活性污泥吸附效果的影响时,研究结果表明微生物细胞表面疏水性和接触时间对微生物吸附率有影响,在较短接触时间下疏水性是影响细菌对活性污泥吸附率的主要因素[29]。
在难降解有机物生物降解方面,MATH常用来表征有机物降解菌细胞表面疏水性,一般研究表明微生物细胞表面疏水性与其降解有机物能力之间显著相关。在红球菌属Rhodococcus sp. CN6降解对硝基苯酚的研究中发现其细胞表面的强疏水性随着培养时对硝基苯酚浓度的升高而升高,这使得红球菌细胞在培养基质中高毒性条件下具有较强的耐受能力。并且细胞表面的强疏水性有利于微生物有效的吸附在污染物表面,促进对硝基苯酚的降 解[30]。在不同亲疏水性微生物对碳氢化合物降解能力差异性的研究中,疏水性菌种比亲水性菌种表现出更强的碳氢化合物物降解能力,细胞表面疏水性和烷烃降解能力之间有着显著地相关性[31,32]。
在膜污染控制研究方面,MATH常用来表征MBR反应器中活性污泥的相对疏水性 (Relative hydrophobicity,RH),研究其与膜污染之间的关系。在膜污染影响因素的研究中,有研究者使用改进的MATH方法[33]测试活性污泥的相对疏水性RH,活性污泥的相对疏水性RH越高膜污染阻力越大,RH和膜污染阻力之间有显著地相关性。并且当RH较高时污泥颗粒之间以及污泥颗粒与膜丝之间更易发生疏水性作用,膜污染越严重[34]。同时有研究者发现污泥的相对疏水性与胞外多聚物(EPS)有关,不同亲疏水性膜片上污泥的相对疏水性不同,并且疏水性膜片上更易吸附蛋白质从而表现出较强的疏水性[35]。
在乳状液破乳研究方面,MATH常用于表征破乳菌细胞表面疏水性,研究其与破乳菌的破乳能力之间的关系。生物破乳菌的细胞表面疏水性和破乳能力密切相关,细胞表面疏水性是决定破乳能力强弱的重要因素。红球菌Rhodococcus sp. PR-1具有很强的细胞表面疏水性,这使得PR-1菌体对模型乳状液发挥了超强的破乳能力[36]。产碱杆菌Alcaligenes sp. S-XJ-1的破乳能力(48 h)与其细胞表面疏水性具有显著地线性关系(R2=0.88),说明破乳菌疏水性越强破乳效果越好[37]。
MATH方法在环境领域细胞表面疏水性的研究中取得了广泛的应用,然而在进行测试时,不同研究者所选的碳氢化合物种类、油水体积比以及缓冲液离子强度都有所不同,如表2所示,这给实验结果的分析和比较带来难度。同时,研究中也发现实验操作条件对实验结果影响较大、对亲水性微生物辨识度较差以及使用分光光度计测试振荡前后菌悬液浓度不准确等问题。针对以上两个问题,本文主要从MATH方法的操作条件、计数方法和数据分析这三方面来综述MATH改进的研究进展。
| 微生物种类 Strain | 油水体积比 Volume ratio | 缓冲液离子强度 Ionic strength (mol/L) | 碳氢化合物 Hydrocarbon | 计数方法 Counting method | 结果 Result (%) | 参考文献 Reference |
| Acinetobacter sp. | 0.01−1.00 | 0.34 | 十六烷 | 分光光度法 | 40−80 | Hori等 |
| strain Tol 5 | (2008)[ | |||||
| Escherichia coli | 0.08 | 0.50 | 二甲苯 | 分光光度法 | 32 | Bunt等 |
| ATCC 29214 | 1.00 | 二甲苯 | 分光光度法 | 56 | (1993)[ | |
| Pseudomonas putida F1G4 | 0.06 | 0.02 | 十六烷 | 分光光度法 | −5 | Zoueki等 |
| putida F1G4 | 十六烷 | Helber计数法 | 38 | (2010)[ | ||
| 十六烷、甲苯等体积混合液 | 分光光度法 | 17 | ||||
| 十六烷、甲苯等体积混合液 | Helber计数法 | 74 |
MATH方法操作时需先将菌体在与碳氢化合物振荡混合,然后静置直至水相和有机相完成分层。该过程中不仅包括细菌在油水界面的吸附,还包括菌体扩散到油相、吸附到管壁、聚集沉淀到管底等过程,所以该方法的实验操作条件仍需要优化。许多研究也表明MATH的实验操作条件对疏水性结果具有显著影响,有大量的研究者对原始的MATH操作条件进行了改进并发现某些条件参数的改变能够很明显地影响实验结果。这些参数包括:实验试管的直径,水相的pH和缓冲液的离子浓度,温度,油相体积及种类等。Hori等[38]研究发现实验前用酸洗涤玻璃仪器以及使用超纯水可减小细菌到管壁的吸附,并且提出改变有机相体积、水相离子浓度来影响细菌细胞在MATH实验过程中的吸附效果。研究发现在水相体积不变的情况下,MATH实验结果随着上层有机相体积增加呈现先升高后降低的趋势;在比较纯水和离子浓度为0.34 mol/L溶液配制的菌悬液的MATH时发现,前者微生物细胞吸附到玻璃壁的数量明显减少。Bunt等[39]研究了水相中的pH,离子浓度对MATH测试的影响,发现较低的缓冲液pH值和高的离子浓度能够提高细菌细胞对碳氢化合物的吸附作用。从表2的实验数据中可以看出当缓冲液离子浓度从0.5 mol/L提高到1.0 mol/L时,MATH实验结果从78%升高至90%。Huang等[41]研究中用MATH测试生物破乳菌细胞表面疏水性,配制菌悬液采用磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L,pH 7.0),这样使整个实验过程在一定的离子强度下进行,减少了静电力的影响,提高了疏水性对微生物吸附有机相的作用,使实验结果更准确地表征疏水性。
综上认为,在使用MATH表征细胞表面疏水性时,为了确保实验结果的准确性,需要注意以下三点:一是有机相和水相体积比应设定在一个合适的范围,使得振荡时上层有机相能够充分分散成细小液滴,静置分层时上层这些小液滴能够融合;二是在选择有机相种类时,要选择不会改变所测试微生物表面性质的有机相物质;三是在选用配置菌悬液所用的缓冲液方面,应采用一定离子浓度的溶液。
除实验操作条件上的改进,研究者尝试了将MATH方法与其他手段相结合进行计数以得到更为精确的实验结果[42]。例如直接使用细胞计数法[38]取代分光光度计测试水相中细胞个数和吸附到碳氢化合物液滴上的细胞个数。最近也有研究中使用共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)对微生物吸附到油水界面的过程进行实时可视观察[43,44,45],检测菌悬液与上层的碳氢化合物混合前后菌体数量的改变,从而减少其他因素对实验结果的干扰。还有研究者如Zoueki等[40]在MATH测试中将吸光度测菌体浓度替换为使用一种Helber计数装置,具体操作是在涡流振荡后使用巴斯德移液管将底部的水相转移到Helber细胞计数室,这种细胞计数室会形成计数网格线,通过显微镜观察网格线里的细菌细胞数量,显微镜观察下的碳氢化合物液滴和细菌细胞差别很明显,这样表征水相中细菌细胞数量和传统MATH中使用分光光度计相比就较为准确。表2中的数据可以看出,当使用Helber计数法代替分光光度计来表征细胞浓度时,有效地避免了菌悬液中有机相液滴对实验结果的干扰。在一般MATH测试中,振荡以后水相中会存在稳定或者半稳定的油相液滴。这些油相液滴之间因存在微弱的范德华力,并且这些液滴吸附水相中的氢氧根离子等其他阴离子使得这些液滴稳定存在。此外,测试中的菌体和非生物的胶体颗粒也使得这些油相液滴更稳定。这些油相液滴的存在直接影响实验结果的准确性。因此,使用传统分光光度法测量水相中的菌体细胞浓度会存在不可避免的误差。为获得更为准确的实验结果应该采用上述材料中直接细胞计数的方法。
传统MATH方法的数据处理一般是将油水两相分离后,通过计算底层水相细胞密度减少的百分比来表征疏水性。虽然这种方法很快就能获得实验结果,但这样处理数据需要建立在MATH方法具有统一标准的操作条件上,从上文可知MATH方法中实验的操作条件对实验结果的影响较为显著。在被测试微生物种类疏水性差别较大时,传统MATH方法能够有效的表现出差异;在测试疏水性只有细微差别的微生物菌种时,传统MATH的结果往往比较模糊。所以使用单一的细胞密度减少百分比来表征疏水性方法得到的实验结果偏差性就比较大。针对这一问题,目前有研究者提出了动态MATH方法[46],通过多次不同条件实验结果的数据处理来消除其他因素的干扰。其中一种方法是通过测试不同振荡时间下的MATH值,由于实验结果是时间的指数型函数,所以通过作水相中剩余微生物细胞数量比例的对数(log[At/A0×100])和时间的函数就得到一条直线,这条直线的斜率定义为初始分配率R0 (min-1)[47,48]用于表征疏水性。还有研究者提出了另一种动态MATH方法[38],这种方法是通过测试不同菌悬液浓度下的MATH值。实验结果使用Langmuir吸附等温式:
| \[Y = \frac{{{Y_{\max }}aX}}{{1 + {\rm{a}}X}}\] | (1) |
其中Y代表吸附到烷烃液滴中细胞的数量(cells/mm2),X是底层水相中微生物细胞浓度(cells/mL),a为常数。将实验数据代入公式就可以得出a和Ymax的值。Ymax代表被测微生物细胞表面疏水性。
MATH用于表征细胞表面疏水性具有实验条件简便、实验结果较为准确的优点,目前广泛应用于环境领域用以表征微生物表面的疏水性。在使用MATH测试微生物细胞表面疏水性时,应选择合适的油水体积比、不影响菌体性质的有机相和具有一定离子浓度的缓冲液。在计数方法上,将分光光度法与细胞计数法、共聚焦显微镜等技术结合表征实验结果则更为准确。此外,采用动态MATH法能更准确地表征微生物疏水性之间的差异。随着环境微生物表面物质和特性的研究技术不断革新,将MATH结合其他检测设备或方法应用于测试其他微生物表面疏水性,揭示微生物与不同界面之间的作用过程可能是MATH未来的发展方向。
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