(1) 普通PCR。检测巴尔通体主要基于16S rRNA、16S-23S rRNA ITS、gltA、groEL、ftsZ和ribC基因PCR扩增。目前,栗冬梅等已采用普通PCR扩增上述基因和测序的方法在北京、山东和云南等地的猫、狗、鼠、蚤和蜱中检测出Bq、Bh、Bvb和Bc等巴尔通体^{[84,85,86,87]}。虽然普通PCR已是快速检测病原体常用的一种技术,但还存在很大缺陷,如引物结合缺乏特异性、实验室污染和临床上PCR抑制物存在造成假阴性等。我们在实际工作中发现,对于直接检测临床样品,不敏感和假阳性是存在较多的问题,特别是应用巢式PCR时,敏感性虽然增加,但是污染造成的假阳性问题仍然比较突出,因此限制了在临床上的推广应用。

(2) 实时荧光定量PCR(Real-time quantity PCR,qPCR)。目前用于微生物病原体检测的qPCR多为探针法。优点是对目标序列有很高的特异性,依据序列特异性探针区别物种,特异性准确率更高,解决了荧光染料非特异的缺点,且反应结束后不需要进行寡核苷酸熔解曲线分析,缩短了实验时间。

单重实时荧光探针定量PCR:国外报道通过扩增ssrA基因建立实时荧光探针PCR方法检测巴尔通体属^[88]。国内本实验室已建立了单重实时荧光定量PCR方法检测一些常见的巴尔通体,如Bvb^[89]、Bh、Bq、Be和Bb (尚未发表),其他实验室也有报道采用TaqMan-MGB探针技术建立了检测Bh和Bq单重实时荧光定量PCR方法^[90]。这些方法虽然克服常规PCR技术的不足,并可对未经PCR扩增的原始模板进行定量,特异性、敏感性和重现性相对更好,但是一个PCR体系只能检测一种或一类病原体,不能同时检测多种病原体,导致待测样品和试剂使用量相对比较多,与目前发展的多重实时荧光探针PCR相比还是有些不足。

多重实时荧光探针定量PCR,在单一管中有效的区分多种病原体,具有高效性、经济简便性等优点,节约样本的同时又达到了经济实用、加速实验进程等。缺点是要合成昂贵的探针,且在设计引物探针时要避免引物和引物、探针和探针及引物和探针之间二聚体,给设计合适组合的引物探针带来一定的困难。该方法在其他致病菌如曲霉菌等检测应用广泛,而在巴尔通体检测上还没有相关报道。

(3) 高分辨率熔解曲线分析技术(High-resolution melting analysis,HRM)。是在实时荧光定量PCR上发展的一种新技术,克服了无需使用特异性探针即可分析核酸熔解曲线的变化,克服了不饱和染料如SYBR Green的一些缺点,如荧光强度较低、稳定性差,标记DNA双链时不能保证全部PCR产物都嵌合上染料,嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中不能及时脱落,抑制PCR反应等。该技术主要采用饱和染料如LC Green等有更强DNA结合能力和很低抑制作用,解链过程中不会发生重排,使熔解过程中发出的荧光信号具有更高的分辨率。结合多重PCR方法建立HRM方法根据其特定T_m值和熔解曲线有效区分T_m差异的多种物种。与多重实时荧光探针PCR相比,操作相对简单,不需制作标准曲线,仅用T_m值即可判断结果;不需合成探针,成本低。但还有些不足,可以检测任何双链DNA序列的扩增,没有引物特异性。国外已报道采用SYBR染料建立检测巴尔通体荧光定量PCR方法,用作巴通体心内膜炎的诊断^[61],最新报道采用饱和染料cyto9扩增rpoB、gltA、ITS测序检测巴尔通体^[91,92,93]。

目前,国内外尚未见应用多重实时荧光探针PCR和HRM方法同时检测鉴定多种巴尔通体。感染人心内膜炎的巴尔通体最常见的病原体为Bq、Bh和Bvb,因此有必要建立灵敏度高、快速同时检测这3种病原体的方法,为BE检测工作提供更有效的手段。鉴于上述两种方法各自优缺点,本研究试验建立这两种方法检测巴尔通体,通过实验比较其特异性灵敏性。