反硝化作用是微生物将化合态氮(硝酸盐、亚硝酸盐)转化为游离态氮(氮气)的过程^[1]，该反应是细菌在无氧条件下的一种呼吸方式，为细胞生存提供能量。反硝化过程包括四步反应： NO₃⁻→NO₂⁻→NO→N₂O→N₂，需要硝酸盐还原酶类(nar)、亚硝酸盐还原酶类(nir)、一氧化氮还原酶类(nor)和一氧化二氮还原酶类(nos)四套酶依次进行催化，约50个酶共同参与^[2]。这些基因以基因簇方式在多种反硝化细菌中均有发现并且表达受严格调控，其表达水平与氧气浓度成反比，并且还原酶的表达需要硝酸盐或者其还原产物的存 在^{[3, 4, 5]}。NO₂⁻还原为NO的过程是反硝化作用区别于其他硝酸盐代谢的标志性反应，该反应由nir编码的亚硝酸盐还原酶类催化，包括亚硝酸盐还原酶结构基因和亚硝酸盐还原酶发挥催化功能所需的一系列组件^[1]。在反硝化细菌中有两种类型：nirS基因编码的细胞色素cd1-nir型和由nirK基因编码的Cu-nir型，二者不能共存于同种细菌中^[6]，其中由nirS基因编码的亚硝酸还原酶在不同细菌中分子大小相似，形态结构相对保守^[7]。

施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501是假单胞菌属鲜有的一株联合固氮菌^[8]，可附着、侵入禾本科作物水稻根际。在低铵、微好氧条件下具有良好的固氮活性，为水稻提供氮源；在绝对厌氧条件下，具有反硝化能力^[9]。基因组分析发现施氏假单胞菌A1501基因组中存在40个反硝化相关基因^[10]。其中，nir基因簇编码16个ORFs (开放阅读框)，序列比对发现A1501中的亚硝酸还原酶属于细胞色素cd1型，由nirS基因编码亚硝酸盐还原酶^[5]。

为研究A1501菌中nirS基因的转录调控模式，本研究将nirS基因启动子与pGD926载体上的lacZ相连，构建融合启动子，通过测定β-半乳糖苷酶活性研究在不同供氧条件、不同浓度的硝酸盐和亚硝酸盐诱导条件下nirS基因的表达水平，同时比较野生型A1501及RpoN突变株中nirS基因的表达差异，探索细菌氮代谢调控因子RpoN对nirS基因表达的影响；此外，为研究nirS基因在反硝化途径中的功能，通过同源重组方法构建了nirS的突变株，通过生理生化试验分析其功能，为进一步利用和改造反硝化途径，解决固氮过程中氮素流失提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒：施氏假单胞菌A1501为本实验室分离鉴定；高频转化宿主菌大肠杆菌Escherichia coli JM109、E. coli DH5α^[11]为本实验室保存；pGD926^[12]是一个lacZ融合广宿主载体(本实验室保存)，具有Tc抗性，用于构建nirS启动子载体；pRK2013^[13](本实验室保存)为穿梭质粒，用于辅助供体菌中的质粒向受体菌的传递，具有Km抗性；rpoN突变株(本实验室保存)为A1501的衍生菌株，其编码rpoN基因内部被插入Tn5而导致基因突变，具有Km抗性。pSUP202质粒(本实验室保存)为自杀性质粒，具有Tc、Cm、Amp抗性，可以通过结合转移方式进入宿主内并与宿主DNA发生同源交换。pKOK5质粒(本实验室保存)，具有Km抗性，为构建nirS插入突变提供Km+lacZ片段。

1.1.2 主要试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶，购自Promega公司；PCR相关试剂，购自TaKaRa公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收纯化试剂盒，购自天根公司；实验试剂均使用分析纯。

1.1.3 培养基：E. coli JM109、E. coli DH5α于LB培养基37 °C培养，野生型A1501、ΔnirS及ΔrpoN于A15限制性培养基^[14] 30 °C培养。抗生素在培养基中的终浓度：四环素(Tetracycline，Tc) 10 mg/L、氯霉素(Chloromycetin，Cm) 30 mg/L、卡那霉素(Kanamycin，Km) 50 mg/L、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp) 100 mg/L。

1.2 方法 1.2.1 nirS基因启动子区片段的克隆及nirS-lacZ重组质粒的构建：根据A1501基因组亚硝酸盐还原酶结构基因nirS的启动子片段设计引物^[15]：上游引物Pnirs-F：5′-GAAATAACCAACCGCTGTCGTG-3′；下游引物Pnirs-R：5′-GTCGGTAAACCTATTCTGGATC CC-3′ (下划线为BamH I酶切位点)。以A1501总DNA为模板进行PCR扩增，获得目的片段(大小为360 bp)。50 μL体系(TaKaRa公司)：Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，10×Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，模板DNA 100 ng，引物(20 μmol/L)各1 μL，用灭菌高纯水补齐至50 μL。PCR条件为：95 °C 5 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30个循环；72 °C 10 min。

将纯化后的nirS启动子区片段与pGEM-T easy载体连接，构建pTeasy-nirS质粒，转化感受态细胞E. coli JM109，蓝白斑筛选并将阳性克隆质粒测序。提取测序正确的pTeasy-nirS质粒，用Hind III和BamH I酶切，切胶回收nirS启动子区片段，同时将其与经过Hind III和BamH I完全酶切的pGD926载体连接，连接产物采用电击法转化入E. coli DH5α，经蓝白斑和Tc抗性筛选阳性克隆，将重组质粒进行PCR及酶切验证，获得带有距nirS基因翻译起始位点上游260 bp并与lacZ融合的重组质粒，命名为pGDP。

1.2.2 nirS-lacZ重组质粒转入A1501和ΔrpoN中：将验证正确的含有pGDP质粒的大肠杆菌作为供体菌，野生型A1501和ΔrpoN突变株分别作为受体菌，在穿梭质粒pKR2013的辅助作用下，进行三亲本结合实验。由于A1501和ΔrpoN没有Tc抗性，大肠杆菌在A15培养基上不能生长，因此分别将两组亲本混合菌体于含Tc和X-gal的A15培养基固体平板上筛选含pGDP质粒的A1501菌株，于含Km、Tc及X-gal的A15培养基固体平板上筛选含pGDP质粒的ΔrpoN突变株。将筛选到的菌经3次单菌落纯化，提取质粒PCR及酶切验证，得到目的菌株并分别命名为pGDP-A1501和pGDP-ΔrpoN。将得到的目的菌株提取质粒，PCR检测。如果得到286 bp的nirS启动子片段，说明已将含nirS基因启动子区的表达质粒成功转入A1501和ΔrpoN中。

1.2.3 nirS基因片段的克隆及重组载体pSUP202-TCK的构建：根据A1501亚硝酸盐还原酶结构基因nirS基因序列设计引物克隆该基因内部部分序列^[15]：上游引物nirS-F：5′-CTGGGCACCAA GCGCCTGGA-3′；下游引物nirS-R：5′-TTAGTACA CGTCGTCATGG-3′。以A1501总DNA为模板进行PCR扩增，获得目的片段。PCR体系与条件同1.2.1。将目的片段克隆到pGEM-T Easy载体并转到感受态细胞E. coli JM109，筛选阳性克隆，将验证正确的重组质粒命名为pNIRS。

将pNIRS用Pst I酶切获得1.39 kb的nirS基因内部片段纯化回收，并与经过Pst I酶切处理的pSUP202质粒连接转化入E.coli JM109。通过抗性筛选酶切验证，得到重组质粒pSUP202-III。将pSUP202-III质粒用Sma I酶切(从nirS内部中间切开)，使重组载体变为线性的平末端载体；同时用Pst I酶处理pKOK5质粒，切下一段含Km+lacZ盒的4.6 kb片段，将此片段用Klenow酶补平粘性末端；随后将经Sma I处理后的线性pSUP202-III质粒与粘性末端被补平的Km+lacZ连接并转化到E.coli JM109，经Tc、Cm及Km抗性筛选并酶切验证得到自杀性重组质粒pSUP202-TCK。

1.2.4 nirS突变株的构建：利用三亲本结合方法将自杀性重组质粒pSUP202-TCK转入A1501中，通过同源重组方法将Km+lacZ片段插入A1501基因组nirS基因内部以阻断nirS基因转录，经Tc、Cm及Km抗性筛选得到nirS插入突变株命名为ΔnirS。

1.2.5 不同供氧条件处理：厌氧条件处理：本实验使用自动真空抽气装置，将装有菌液的青霉素小瓶于该装置下抽真空6 min后取出，再向小瓶中注入氩气，重复以上操作3次，最后将灭过菌的针管插在小瓶塞上以保持常压。有氧条件处理：将装有菌液的青霉素小瓶用氩气排气6 min，之后按小瓶体积的0.5%注入氧气。反硝化条件：在厌氧条件下向LB培养基中加入10 mmol/L NO₃⁻或者5 mmol/L NO₂⁻，此浓度是实验室摸索出的测定A1501反硝化能力电子受体的最佳浓度。

1.2.6 固氮酶活的测定：本实验固氮酶活的测定采用乙炔还原法，具体方法见参考文献^[9]。

1.2.7 β-半乳糖苷酶活性的测定：本方法基于Miller法略有改动^[16]。将待测菌株接种于A15液体培养基(含相应抗生素)，待OD₆₀₀值达到0.5−0.8时，记录OD₆₀₀值。取1 mL菌液5 000 r/min、4 °C离心5 min，弃去上清并用无菌水洗涤2次后按需要重新悬浮菌体；将菌悬液与Buffer Z混合，使总体积为1 mL，加入3滴氯仿，混匀，开盖于37 °C保温40 min；转入30 °C保温5 min之后加入200 μL (4.0 g/L)的邻硝基苯-C-D-苷(ONPG)混匀，30 °C继续保温，此时立即记录下反应起始时间；观察样品若出现黄色，加入500 μL浓度为1 mol/L的Na₂CO₃以终止反应，记下反应终止时间，并将样品放于冰上待测OD值；使用紫外分光光度仪测定OD₄₂₀、OD₅₅₀的值。按照下列公式计算β-半乳糖苷酶的活性：一单位β-半乳糖苷酶的活性为单位细胞每min催化ONPG分解的量。

$Units{\rm{ = }}1{\rm{ }}000 \times \frac{{O{D_{420}} - 1.75 \times O{D_{550}}}}{{T \times V \times O{D_{600}}}}$

其中T代表反应时间(min)，V代表反应中菌体体积。

1.2.8 亚硝酸盐浓度的测定：本实验亚硝酸盐的测定采用Nicholas法^[17]。

2 结果与分析 2.1 亚硝酸盐还原酶结构基因nirS的系统进化分析

A1501菌的NirS与反硝化模式菌株Pseudomonas stutzeri Zobell的亚硝酸还原酶同源性较高，达91.25%。将A1501中亚硝酸还原酶结构基因的氨基酸序列与其他反硝化细菌的亚硝酸还原酶同源物进行进化分析，结果表明，A1501亚硝酸盐还原酶与大多数假单胞菌中cd1型NirS属于一个分支，而与包括绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)和生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum 4B)在内的Cu型NirK不在一个分支(图 1)。此外，结构域分析发现A1501亚硝酸盐还原酶蛋白中含有与cd1型血红素结合的结构域，因此推断A1501中的亚硝酸还原酶属于cd1型NirS。

2.2 不同供氧状况对nirS基因表达的影响

将pGDP-A1501菌株在A15培养基中进行有氧(0.5%)和厌氧培养。经4 h的诱导后，取出培养物，测定β-半乳糖苷酶活性。结果如图 2所示，nirS的表达受氧气的抑制，其在厌氧条件下的表达活性显著高于有氧条件。

2.3 硝酸盐、亚硝酸盐浓度对nirS基因表达的影响

将pGDP-A1501菌株在加有不同浓度的亚硝酸盐和硝酸盐的A15培养基中分别有氧和厌氧条件下诱导4 h，测定β-半乳糖苷酶活性(分别做5个重复)。结果如表 1、2所示，不论在厌氧还是有氧条件下，nirS的表达几乎不受亚硝酸盐的诱导，不同浓度亚酸盐的加入几乎没有引起nirS基因表达的变化；而nirS的表达受硝酸盐的明显诱导，尤其在厌氧条件下，不同浓度的硝酸盐对nirS表达的诱导明显高于不加硝酸盐的对照组。在厌氧条件下当硝酸盐浓度为1 mmol/L时，nirS的表达最高，呈现的β-半乳糖苷酶活性为12 900 Units，远高于对照组的2 015 Units。

2.4 RpoN对nirS基因表达的影响

RpoN是细菌RNA聚合酶组成成分Sigma因子的类型之一，在细菌中主要负责氮代谢有关基因的转录^[18]。将含有nirS-lacZ融合片段的载体pGDP分别转化入A1501和ΔrpoN中，在浓度为1 mmol/L硝酸盐的厌氧条件下，比较nirS在A1501和ΔrpoN突变株中的表达量，研究nirS的表达是否受细菌氮代谢调控因子RpoN的调控。实验结果如图 3所示，以硝酸盐为电子受体的厌氧条件下，nirS在rpoN突变株中的表达约为野生型的1/4，远远低于在野生型的表达活性，表明A1501中nirS基因的启动有可能依赖RpoN，但是分析nirS启动子没有发现RpoN保守的识别位点，RpoN突变对nirS启动的影响可能是通过间接的方式。

2.5 nirS突变对施氏假单胞菌A1501反硝化生长的影响

在厌氧条件下分别以含有10 mmol/L硝酸盐、5 mmol/L亚硝酸盐的LB培养条件下测定A1501和ΔnirS的生长曲线。结果如图 4所示，厌氧条件下，A1501野生型在LB培养基中不能生长，当加入硝酸盐或者亚硝酸盐时可以生长，并且在硝酸盐中的生长能力显著高于亚硝酸盐；同野生型一样，nirS突变株在LB厌氧培养条件下依然不能生长，但是在含有硝酸盐的培养基中，ΔnirS的生长能力相比野生型下降了约30%；而当以亚硝酸盐为电子受体时，ΔnirS几乎不能生长。分析原因，在LB厌氧条件下，菌体的呼吸链由于缺乏电子受体无法进行呼吸作用，因此没有能量供应，菌株也无法生长。当加入一定量的硝酸盐或者亚硝酸盐时，这两者均可代替氧气作为呼吸链末端的电子受体，菌体可以通过厌氧呼吸产生能量，因此A1501可以在含硝酸盐或者亚硝酸盐的培养基中生长。当nirS突变后，反硝化过程中的亚硝酸盐还原酶无法合成，因此电子在传递过程中受到阻断，菌体利用硝酸盐为电子受体，仅有第一步可以产生少量能量，表现为反硝化能力明显降低；而亚硝酸盐为电子受体时，菌体进行反硝化第一步亚硝酸盐还原为NO的过程即受阻，由于没有能量提供菌株无法生长。

2.6 nirS突变株对亚硝酸盐的利用

在亚硝酸盐为电子受体时，ΔnirS几乎不能生长，由此推测nirS参与了亚硝酸盐的代谢。为了验证推测，将A1501与ΔnirS分别在含5 mmol/L亚硝酸盐的LB培养基中厌氧培养，不同时间点取样测定培养基中亚硝酸盐的剩余量。测定结果如表 3所示，亚硝酸盐为电子受体时，A1501在10 h内将培养基中一定量的亚硝酸盐完全消耗，而ΔnirS仅有微弱的下降。这个结果表明在厌氧条件下A1501中NirS参与亚硝酸盐的代谢。亚硝酸盐为电子受体时，ΔnirS几乎不能生长的原因：在厌氧条件下nirS突变后亚硝酸盐无法被代谢，因此反硝化作用无法进行，电子呼吸链不能运作，导致细菌无法生长。

2.7 nirS突变对施氏假单胞菌A1501固氮酶活的影响

在厌氧条件下向A15无氮培养基中分别添加不同浓度的硝酸盐和亚硝酸盐，测定A1501与ΔnirS在此条件下的固氮酶活。结果如表 4所示，在含有0.5 mmol/L硝酸盐的培养基中，A1501的固氮酶活性高于无氮培养基中的固氮酶活性，随着硝酸盐浓度的提高，A1501的固氮酶活性逐渐丧失；而加入微量的亚硝酸盐则使得A1501的固氮酶活性几乎完全丧失。这个现象与之前的研究报道相一致^[9]。在nirS突变株中，硝酸盐的添加可对固氮酶活产生与野生型中一致的影响趋势，但是亚硝酸盐的添加对固氮酶活的影响与野生型中的情况差别较大。如表 4所示，野生型中0.5 mmol/L亚硝酸的加入可造成固氮酶活的极度下降，而突变株在浓度为0.5和1.0 mmol/L亚硝酸盐的反硝化条件下表现出较高的固氮酶活。产生这个现象的原因可能是在野生型A1501菌中，抑制固氮酶活的除了亚硝酸盐本身，还包括亚硝酸盐作为反应底物产生的代谢产物，nirS基因突变后，亚硝酸盐的代谢产物不再产生，所以抑制能力降低。

3 讨论

A1501菌在厌氧条件下有需硝酸盐而不需亚硝酸盐的固氮酶活性，硝酸盐在反硝化条件下既可以充当电子受体进行反硝化作用为细胞供能，同时也可以充当氮源，低浓度的氮源促进固氮酶活，高浓度氮源抑制固氮酶活：在0.5 mmol/L硝酸盐的厌氧条件下，硝酸盐浓度低于固氮酶活受限制时氮源的浓度阈值，A1501固氮酶活较高，当硝酸盐浓度达到1mmol/L时，硝酸盐浓度超过阈值，A1501的固氮能力受到抑制，固氮酶活急剧下降。之前的研究表明A1501中亚硝酸盐抑制反硝化条件下的固氮酶活性，但是本研究发现当加入0.5 mmol/L的亚硝酸盐时，几乎测不到野生型的酶活，而ΔnirS在此条件下出现了明显的固氮酶活，这表明抑制A1501在反硝化条件下固氮酶活性的可能不止亚硝酸本身。研究共生根瘤菌反硝化与固氮调控发现共生根瘤菌中反硝化途径中间产物和终产物都是固氮作用的抑制剂，其中亚硝酸盐是固氮酶的竞争性抑制剂，能使有活性的亚铁型的加氧血红蛋白自动氧化为无活性的高铁型；氮的氧化物是活细胞的毒物，也是固氮酶的抑制剂，亚硝酸盐的产物NO对共生固氮细菌酶活的抑制起直接作用^[19]。因此推测抑制A1501固氮酶活性的并不仅是亚硝酸盐，很可能是亚硝酸盐还原产物NO或者是反硝化作用途径中亚硝酸还原酶之后产生的还原产物如N₂O。反硝化产物对A1501固氮酶活的抑制机理还需进一步研究。

生物固氮与反硝化是自然界氮循环过程中两个相反的生理反应。当稻田浸水氧分压极低的条件下，水稻根际联合固氮微生物A1501兼具有固氮与反硝化功能，并且反硝化是此条件下氮素流失的主要因素，为了提高固氮效率同时避免氮素流失，研究其反硝化过程中的基因调控机制以及与固氮酶活的关系显得尤为重要，本研究为揭示A1501反硝化与固氮调控机理提供理论依据。