近年来，属革兰氏阴性菌的嗜线虫致病杆菌，由于其在与线虫的共生生活以及昆虫寄生中产生丰富的次级代谢产物和发挥独特的作用，吸引了越来越多的关注^{[1, 2, 3]}。致病杆菌具有独特的生活史，其首先寄生在土壤中，处于感染态的线虫通过其自然开口侵染到被寄生的昆虫体腔内，并将线虫体内共生的致病杆菌释放到昆虫的体腔中，致病杆菌在24-28 h内进行繁殖，并产生一系列的代谢物。这些毒素和蛋白酶类对昆虫具有很强的杀伤作用，导致昆虫产生败血症而死亡。继而，致病杆菌会继续产生体外酶，将昆虫的生物大分子物质降解为氨基酸和核酸等生物小分子物质，以提供线虫自身繁殖所需；同时致病杆菌还可以产生一些次级代谢产物来抑制其他细菌或真菌的生长，防止营养物质流失。线虫利用被转化的小分子物质开始自身繁殖，一般可持续繁殖一到三代。当营养物质匮乏时，通过特定信号的诱导，线虫与共生杆菌进行重新组装，生成新的感染态共生体系被释放到土壤中，继续寻找新的宿主进行下一个生命周期^{[4, 5, 6]}。尽管嗜线虫致病杆菌的次级代谢产物在与线虫的共生生活史中具有极其重要的作用^[7]，但是到目前为止，仅仅少数几类化合物被分离鉴定出来^{[8, 9, 10]}。已经被报道的化合物具有各种各样的生物活性，如抗昆虫、抗线虫、抗菌以及抗癌活性等^{[11, 12, 13, 14, 15, 16]}。不仅如此，因其独特的生活史，致病杆菌所产生的代谢产物正在被当作新型的生物农药而被广泛研究^[17]。本文从筛选新型农业抗生素角度出发，选取一株嗜线虫致病杆菌，以HPLC-MS技术指导代谢产物的分离，从中分离鉴定了4个吲哚生物碱类抗生素，并对其抗菌活性进行了测试，为寻找新型微生物药物或农业抗生素提供了有益信息。

菌株PacYellow为馈赠的未鉴定菌株。NBTA培养基(g/L)：NB培养基(Difco) 8.000，溴百里酚蓝0.025，氯化三苯基四氮唑0.040，蒸馏水1 000 mL。TSBY液体培养基(g/L)：Oxoid tryptone soya broth 30，葡萄糖103，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，上海凌峰试剂公司；氘代试剂，美国CIL公司；色谱级分析试剂，美国TEDIA试剂公司；柱层析硅胶，青岛海洋化工厂；C₁₈反相层析硅胶(50-75 μm)，YMC公司；Sephadex TM LH-20，GE医疗；500M核磁共振仪，德国布鲁克；傅立叶红外光谱仪，美国赛默飞；紫外测试仪，美国赛默飞；安捷伦1260系HPLC、LC-MS、Q-TOF，安捷伦科技有限公司。

用于细菌16S rRNA基因序列扩增的上游引物27F：5'-AGAGTTTGATC MTGGCTCAG-3'，下游引物1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'。挑取新鲜培养的单克隆菌落，充分悬浮于50 µL无菌水中，沸水浴5 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR反应模板。50 µL PCR反应液中含有：10×Buffer 5 µL，0.025 mol/L MgCl₂ 5 µL，0.002 mol/L dNTPs 5 µL，Taq DNA聚合酶2.5 U，10 µmol/L引物各2 µL，模板DNA 40 ng，50% DMSO 5 µL，补双蒸水至50 µL。反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 90 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；循环30次；72 ℃ 10 min。反应产物用1%琼脂糖胶进行电泳观察，用凝胶回收试剂盒(OMEGA)回收和纯化目的片段，上海杰李生物技术有限公司进行测序。得到的序列结果与GenBank数据库进行比对和相似性分析，并用Neighbor-Joining 法建立系统进化树。

将菌种划线接种于NBTA平板，28 ℃培养 48 h，然后挑取Ⅰ型单克隆菌落^[18]接种于装有 25 mL TSBY培养基的100 mL三角瓶中，28 ℃、220 r/min振荡培养24 h，取5 mL种子液接种于装有500 mL相同培养基的2 L三角瓶中，相同条件下发酵3 d。

对嗜线虫致病杆菌PacYellow进行大批量发酵，共50 L。将收集到的发酵液先经过8 000 r/min离心8 min，得上清液和菌体沉淀，分别合并上清液和沉淀。随后上清液用乙酸乙酯反复萃取3次，将萃取后的有机相于30 ℃减压蒸馏，除去有机溶剂；利用丙酮重悬菌体沉淀，将丙酮破碎的菌体离心，收集上清液，于30 ℃减压蒸馏，除去溶剂，合并两部分待进一步分离纯化。

通过石油醚、乙酸乙酯和甲醇体系来进行TLC分析，确定正相硅胶柱分离条件为石油醚、石油醚:乙酸乙酯=2:1 (体积比)、乙酸乙酯、乙酸乙酯:甲 醇=5:1 (体积比)、乙酸乙酯:甲醇=2:1 (体积比)、甲醇。收集正相硅胶柱分离的样品，使用HPLC利用分析柱(5.0 mm×150 mm，3.6 μm，C₁₈)检测后合并目标化合物组分，HPLC分离条件为0-30 min，乙腈浓度从30%梯度洗脱到100%。随后，将目标化合物经Sephadex LH-20 (2.0 cm×110 cm；MeOH；2.5 mL/min)纯化。接下来将所得的目标组分经半制备型HPLC (9.4 mm×250 mm，5 μm，C₁₈)纯化。

菌株PacYellow的总DNA作为模板进行PCR扩增，获得长1.5 kb的16S rRNA基因序列(图 1)。与GenBank的序列比对结果显示，共有37株已经报道菌株的16S rRNA基因序列与PacYellow的16S rRNA基因序列有99%的一致性，其中菌株Xenorhabdus bovienii SS-2004 (444303959)、Xenorhabdus bovienii (343202497)等致病杆菌显示了最高的同源性。表明菌株PacYellow在分类上应属于肠杆菌科致病杆菌属。进一步应用NCBI对该菌株的16S rRNA基因序列在16S ribosomal RNA (Bacteria and Archaea)进行BLASTn搜索，参照Saitou等^[19]采用MEGA 5中的Neighbor-Joining法构建系统发育树(图 2)。通过比较系统发育树，可明显发现菌株PacYellow处于致病杆菌Xenorhabdus bovienii的分支。因此，这株线虫共生菌被鉴定为致病杆菌Xenorhabdus bovienii。

图 1　 PacYellow的16S rRNA基因序列 Figure 1　 16S rRNA gene sequence of the strain PacYellow

图选项

图 2　 基于16S rRNA基因序列分析构建的系统发育树 Figure 2　 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence Note: Bar: 0.5% sequence divergence. The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on N-J analysis of 1 000 resampled data sets.

图选项

化合物1 (图 3)为无色油脂状。紫外吸收(MeOH) λ_max(log ε): 222 nm (2.27)、282 nm (1.59)。红外光谱(KBr)：ν_max 3 410、2 972、1 707、1 457、1 098、 1 026、743。高分辨质谱给出加钠分子离子峰[M+Na]⁺为m/z288.154 5，而其理论分子加钠峰为288.152 1，因此确定其分子式为C₁₇H₂₁NO₃。核磁共振氢谱中(图 4)，在δ 7.35(1H，d，J=8.0 Hz)、7.65(1H，d，J=7.8 Hz)、7.15(1H，t，J=7.5 Hz)、7.21(1H，t，J=7.5 Hz)、7.04(1H，d，J=2.0 Hz)和核磁共振的碳谱信号如δ127.5、110.7、118.9、123.0、119.8、122.3、110.3和136.2，表明该化合物中存在一个吲哚环结构。结合氢谱中的信号δ2.07(3H，s)信号和碳谱中的信号δ170.5(s)和20.9(q)信号，表明该化合物中含有一个乙酰基结构单元。结合氢谱 (图 4)中其他位置的信号δ3.31(dd，J=15.1，4.6 Hz)、3.19(dd，J=15.1，8.2 Hz)、5.49(dd，J=8.2，4.6 Hz)、2.64(m)、1.74(m)、1.40(m)、0.88(t，J=7.5 Hz)、1.00(d，J=6.8 Hz)和碳谱中的信号δ210.8、44.3、26.7、15.2、26.3 (表 1)，化合物1被鉴定为一个已知的吲哚类生物碱^{[20, 21]}。

图 3　 代谢产物1−4的化学结构 Figure 3　 The chemical structures of compounds 1−4

图选项

图 4　 代谢物1的核磁共振氢谱 Figure 4　 The 1H NMR of compound 1

图选项

化合物2也是无色油脂状。它的紫外吸收光谱和红外光谱与化合物1基本相同。高分辨质谱的分子加钠离子峰[M+Na]⁺为m/z273.274 1，比化合物1小14，因此确定其分子式为C₁₆H₁₉NO₃。它的核磁共振氢谱(图 5)与化合物1非常相似(表 1)，不同之处只在于化合物1氢谱中的一个三重峰甲基在化合物2的氢谱中变成了二重峰，并且减少了亚甲基信号。因此，化合物2被鉴定是化合物1的结构类似物^{[20, 21]}，结构见图 3。

图 5　 代谢物2的核磁共振氢谱 Figure 5　 The 1H NMR of compound 2

图选项

化合物3的紫外吸收光谱和红外光谱与以上两个化合物的基本相同，说明是同系物。高分辨质谱的分子加钠离子峰[M+Na]⁺为m/z246.158 5，比化合物1要小42，其分子式被确定为C₁₅H₁₉NO₂。化合物3的核磁共振氢谱(图 6)非常类似于化合物1的核磁共振氢谱，不同之处是化合物3缺失了乙酰基的甲基信号(表 1)。因此，化合物3被鉴定为1的去乙酰基衍生物^{[20, 21]}(图 3)。化合物4的紫外吸收光谱和红外光谱基本与上述化合物相同，表明该化合物与上述化合物为类似物。高分辨质谱的分子加钠离子峰[M+Na]⁺为m/z232.125 4，分子式被确定为C₁₄H₁₇NO₂。化合物4的核磁共振氢谱(图 7)非常类似于化合物2的氢谱，同样缺失了乙酰基的甲基信号(表 1)，因此化合物4被鉴定为化合物2的去乙酰基衍生物^{[20, 21]}(图 3)。

图 6　 代谢物3的核磁共振氢谱 Figure 6　 The 1H NMR of compound 3

图选项

图 7　 代谢物4的核磁共振氢谱 Figure 7　 The 1H NMR of compound 4

图选项

通过检索发现分离鉴定的化合物均从其他两株致病杆菌Xenorhabdus bovienii得到分离鉴 定^{[20, 21]}，这从侧面证实了该菌株属于Xenorhabdus bovienii。并且发现化合物1和2对条件致病真菌新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)分别在25 mg/L和50 mg/L的浓度时有很好的抑制作用，该类真菌为人类的条件致病菌，通常会导致严重的新型隐球菌脑膜炎，目前关于真菌感染的疾病一直是临床治疗的难点和热点问题^[22]。化合物3和4则在浓度为12 mg/L对植物病原真菌灰霉菌(Botrytis cinerea)有很好的抑制作用。该类真菌又称灰葡萄孢菌，一种广寄主性的、能够引起200多种已知植物灰霉病的坏死营养型病原真菌^[23]。因此，该组化合物有潜力作为微生物农用抗生素进行更为深入的研究和开发。另外，基于对微生物药物研究的兴趣，我们对化合物1-4的其他抗菌活性，尤其是产生临床疾病的模式菌株进行了活性测试，结果表明该组化合物对临床上引起肺炎等疾病的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、覃状芽孢杆菌(Bacillus anthracis)以及引起结核病的结核分枝杆菌的实验室模式菌株耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc²155)均表现出非常微弱的活性。然而，鉴于这组化合物作为该类菌株中的主要代谢产物，在嗜线虫致病杆菌的生活史中可能具备特殊的作用，如抗植物病原真菌等。因此，根据我们的实验结果分析，有必要对该类化合物进一步进行深入的研究，确定它们在其生活史中的真实作用，以期能够开发新的微生物抗生素，尤其是抗植物病原真菌和临床用的抗真菌类抗生素。