2015, Vol. 42扩展功能
文章信息
- 张传志, 康振, 堵国成, 陈坚, 余晓斌
- ZHANG Chuan-Zhi, KANG Zhen, DU Guo-Cheng, CHEN Jian, YU Xiao-Bin
- 重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸培养基的优化
- Optimization of the medium for L-phenylalanine production by recombinant Corynebacterium glutamicum
- 微生物学通报, 2015, 42(1): 74-84
- Microbiology China, 2015, 42(1): 74-84
- 10.13344/j.microbiol.china.140335
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文章历史
- 收稿日期: 2014-04-21
- 接受日期: 2014-07-11
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2014-07-30
2. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家重点实验室 江苏 无锡 214122
3. 江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122
4. 食品安全与营养协同创新中心 江苏 无锡 214122
5. 江南大学 生物工程学院 江苏 无锡 214122
2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China
3. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education,Jiangnan
4. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Wuxi, Jiangsu 214122, China
5. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)是一种必需氨基酸，人与动物自身不能合成，必须从外界摄取。L-Phe也是一种重要的医药和食品化学品中间体，在医药行业中，L-Phe是复配氨基酸输液的重要成分和氨基酸类抗癌药物苯丙氨芥、甲酰溶肉瘤素的合成原料；在食品行业中，L-Phe作为食品添加剂，广泛应用于功能性食品的氨基酸平衡方面，补充人体所需，尤其应用于低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)的合成，随着阿斯巴甜的应用日益广泛，L-Phe的市场需求量也迅速 增加[1, 2, 3, 4]。
目前，L-Phe的主要生产方式是微生物发酵法，菌株主要有大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等[2, 3, 5, 6, 7, 8]，其中最主要的菌株是大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌[7]。虽然大肠杆菌发酵生产L-Phe已达到较高的水平，但是依然存在一些难以解决的问题，如容易感染噬菌体迫使发酵终止造成巨大的经济损失[8, 9]。近年来随着分子生物学技术的发展，谷氨酸棒杆菌基因组测序已完成，基因操作工具也已成熟[5, 10, 11, 12]，谷氨酸棒杆菌作为生产菌株被应用到越来越多的次级代谢产物[13, 14, 15]及蛋白的合成[16, 17, 18]中。另外代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L-Phe已取得了明显的效果[7, 19, 20, 21, 22]。为此作者在分析谷氨酸棒杆菌中L-Phe生物合成途径和代谢调控机理的基础上，构建了一株产L-Phe的谷氨酸棒杆菌重组菌株并对其培养基优化，确定了最佳种子培养基以及发酵培养基，为进一步放大实验提供依据。
1 材料与方法 1.1 菌株本实验室构建重组谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ΔptsI:: iolT2-ppgK ΔaroP ΔaceE Δldh 携带pSUTL和 pSDTL质粒。菌株特性：C. glutamicum ATCC13032在pts I位点敲入iolT2-ppgK基因，敲除aroP，ldh以及aceE基因。重组质粒特性：pSUTL (pECXK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA)和pSDTL (pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL)。
1.2 培养基 1.2.1 种子活化培养基：LBG固体(g/L)：葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠10.0，营养琼脂15.0。 1.2.2 种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆17.5，硫酸铵5.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，尿素2.0，氯霉素17 mg/L，卡那霉素25 mg/L，pH 6.8-7.0，装液量20 mL/250 mL。 1.2.3 发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，根据需要添加抗生素：氯霉素17 mg/L，卡那霉素25 mg/L，pH 6.8−7.0，装液量20 mL/250 mL。 1.3 培养方法 1.3.1 菌株活化：甘油管接种划线LBG平板30 oC培养36 h。 1.3.2 种子培养：接种一环LBG平板种子于种子培养基，置于巡回式摇床(200 r/min)上，30 oC培养18 h。 1.3.3 发酵培养：按10%接种量将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.0 mmol/L IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床(200 r/min)上，30 oC发酵培养72 h。 1.4 分析方法 1.4.1 菌体生长测定：取0.2 mL发酵液用 2.0 mol/L盐酸稀释到合适浓度，使用分光光度计测定，1.0 cm光程600 nm测OD。 1.4.2 葡萄糖测定：采用SBA-40C型乳酸－葡萄糖生物传感分析仪进行分析。 1.4.3 L-Phe含量：采用高效液相色谱分析仪 测定[23]。 1.5 实验设计 1.5.1 单因素试验筛选关键因素：采用单因素试验考察种子培养基中葡萄糖、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、硫酸镁和磷酸二氢钾以及发酵培养基中葡萄糖、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、柠檬酸钠和碳酸钙对谷氨酸棒杆菌产L-Phe的影响，筛选出影响L-Phe产量的关键因素。 1.5.2 Box-Behnken中心组合实验设计：响应面分析法(Response surface analysis)是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，响应面优化法的优点：(1) 考虑了试验随机误差；(2) 响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法；(3) 与正交试验相比，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续的对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。最常用的是Box-Behnken的中心组合设计原理，单因素试验确定了极显著的4个因素，以及最大响应区域，各因素取3个水平，以(−1，0，1)编码进行实验分析，使用软件Design-Expert.V8.0.6，对数据进行二次回归拟合，最终根据回归方程来绘制响应面立体分析图，得出响应面分析结果，进而确定最优的发酵培养基。
2 结果与分析 2.1 种子培养基单因素试验种子培养基的目的是为种子生长提供优良环境条件，一个良好的种子培养基是保证菌体生长旺盛，发酵产酸稳定的重要条件，因此对种子培养基的优化至关重要。碳源是提供细胞生长所需能量以及产物合成碳骨架的来源；氮源是提供细胞合成蛋白质、多肽、核酸等含氮物质的来源；无机盐作为一些酶的辅基，可以促进胞内酶活。选用单因素试验考察种子培养基中碳源：葡萄糖；有机氮源：玉米浆和酵母粉；无机氮源：硫酸铵；无机盐：硫酸镁和磷酸二氢钾，考察不同种子培养基组分对谷氨酸棒杆菌产L-Phe的影响，每个因素取5个水平，其他培养基组分与优化培养基成分相同，筛选出影响L-Phe产量的关键因素如图 1所示。
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图 1
种子培养基单因素试验发酵结果
Figure 1
L-Phe production by recombinant C.glutamicum in the seed medium with single factor experiment
注：A：种子培养基中不同葡萄糖浓度对L-Phe产量的影响；B：种子培养基中不同玉米浆浓度对L-Phe产量的影响；C：种子培养基中不同酵母粉浓度对L-Phe产量的影响；D：种子培养基中不同硫酸铵浓度对L-Phe产量的影响；E：种子培养基中不同硫酸镁浓度对L-Phe产量的影响；F：种子培养基中不同磷酸二氢钾浓度对L-Phe产量的影响. Note: A, B, C, D, E, F displayed the effect of glucose, corn steep liquor, yeast extract, (NH4)2SO4, MgSO4, KH2PO4 in seed medium on L-Phe in recombinant C. glutamicum, respectively. |
从图 1发酵结果可知，种子培养基葡萄糖浓度选择10.0−30.0 g/L，葡萄糖提供菌体生长的碳骨架，随着葡萄糖浓度的升高，L-Phe产量进一步得到提高，最高达到7.46±0.04 g/L，葡萄糖浓度进一步提高L-Phe产量反而下降，说明种子培养基中初始葡萄糖浓度过高可能使菌体生长过于旺盛，产生过多的副产物，后续接种引入到发酵培养基，从而影响L-Phe的积累产生，因此选择葡萄糖浓度为25.0 g/L。玉米浆中存在丰富的氮元素包括多肽，同时又能够提供多种必需的生长因子如氨基酸等，是微生物合成酶所必需的，玉米浆浓度选择5.0−25.0 g/L，由发酵结果可知随着玉米浆浓度的增加，L-Phe产量进一步提高，玉米浆浓度在20.0 g/L时，L-Phe浓度最高达到7.21±0.16 g/L，过高的玉米浆浓度对L-Phe的积累产生不利的影响，因此确定最优玉米浆浓度为20.0 g/L。酵母粉浓度考察0−4.0 g/L，酵母粉作为有机氮源，提供菌体生长的氮元素及生长因子，随着酵母粉浓度的增加，L-Phe产量反而下降，说明添加有机氮源酵母粉不利于L-Phe的积累，因此选择不添加有机氮源酵母粉。硫酸铵浓度确定选择0−20.0 g/L，硫酸铵是无机氮源能够被微生物迅速利用，对微生物的生长极为重要，随着硫酸铵浓度的增加L-Phe产量得到提高，L-Phe产量最高达到7.61±0.23 g/L，进一步提高硫酸铵浓度时，L-Phe产量反而下降，因此硫酸铵浓度确定为15.0 g/L。无机盐硫酸镁浓度考察0−4.0 g/L的添加量，镁离子对L-Phe合成途径的多个酶具有激活作用，如L-Phe合成途径的第一个关键酶3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(3-Deoxy-D-arabino- heptulosonate-7-phosphate synthase，DS酶)、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(Phosphoenolpyruvate synthase，PpsA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，Ppc)、莽草酸激酶(Shikimate kinaseII，AroL)、分支酸合酶(Chorismate synthase，AroC)具有激活作用，当硫酸镁浓度在1.0 g/L时，L-Phe产量最高达到7.54± 0.15 g/L，因此选择硫酸镁为1.0 g/L。磷酸二氢钾添加0−4.0 g/L，钾离子也对L-Phe合成途径的多个酶具有激活作用，如L-Phe合成途径中中心代谢途径的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及5-烯醇式莽草酸-3磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase，AroA)，由发酵结果可知磷酸二氢钾添加量为2.0 g/L时，L-Phe产量最高达到7.58±0.18 g/L。通过单因素试验结果进行各因素的方差分析：葡萄糖，玉米浆，酵母粉，硫酸铵，硫酸镁，磷酸二氢钾各因素的方差分别为：2.93、2.73、0.25、1.00、0.24、1.23，各因素的方差越大对L-Phe产量影响波动越大，可以确定影响L-Phe积累的4个关键因素分别为葡萄糖、玉米浆、硫酸铵和磷酸二氢钾，并且确定了4个因素的中心水平：葡萄糖25.0 g/L，玉米浆20.0 g/L，硫酸铵15.0 g/L，磷酸二氢钾 2.0 g/L，为采用正交试验进一步优化种子培养基提供依据。
2.2 种子培养基正交试验通过单因素试验确定了种子培养基的4个关键影响因素：葡萄糖、玉米浆，硫酸铵和磷酸二氢钾，设计种子培养基正交试验4因素水平表(表 1)，正交试验结果如表 2所示。
| 培养基成分 Medium (g/L) | 水平1 Level 1 | 水平2 Level 2 | 水平3 Level 3 |
| 葡萄糖 Glucose | 20 | 25 | 30 |
| 玉米浆 Corn steep liquor | 15 | 20 | 25 |
| (NH4)2SO4 | 10 | 15 | 20 |
| KH2PO4 | 1 | 2 | 3 |
| 试验号 Test No. | 因素 Factors | 结果 Results | |||
| 葡萄糖 Glucose (A) | 玉米浆 Corn steep liquor (B) | (NH4)2SO4 (C) | KH2PO4 (D) | L-Phe (g/L) | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 6.67 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 6.93 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 6.71 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 7.13 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 7.46 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 7.64 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 6.87 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 6.96 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 7.03 |
| K1 | 6.770 | 6.890 | 7.090 | 7.053 | |
| K2 | 7.410 | 7.114 | 7.030 | 7.147 | |
| K3 | 6.953 | 7.127 | 7.013 | 6.933 | |
| R | 0.640 | 0.237 | 0.077 | 0.214 | |
对正交试验结果使用“正交设计助手II v3.1”进行4因素3水平的实验设计，并进行数据分析，结果见表 2。由表 2可以看出，种子培养基4种组分含量的不同对产酸有一定的影响，培养基中营养成分物质过于丰富，菌体生长过快，以致发酵后劲不足；而如果营养物质缺乏，种子生长缓慢，代谢活性低，也对后续产酸产生不利的影响。由极差分析法得出各个影响因子对菌株积累L-Phe的影响程度极差R的大小顺序为R(A)＞R(B)＞R(D)＞R(C)即影响L-Phe积累的主次关系为：葡萄糖＞玉米浆＞磷酸二氢钾＞硫酸铵。
根据正交试验方差分析结果(表 3)，由F值可知，考察的4种因素对菌株积累L-Phe的影响大小依次为：葡萄糖＞玉米浆＞磷酸二氢钾＞硫酸铵。结合表 3的均值分析确定最佳培养基为A2B3C2D2，即最佳种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆干粉25.0，硫酸铵15.0，硫酸镁1.0，磷酸二氢钾2.0，尿素2.0，pH 6.8−7.0。为进一步确认计算结果，按照最佳条件进行验证，最高产量达到8.10±0.06 g/L。处于实验点较高水平，试验结果较为理想，较优化前的最高7.46±0.14 g/L提高了8.6%。
| 变异来源 Source of variation | 平方和 Sum of squares | 自由度 Degree of freedom | F值 F value |
| 葡萄糖 Glucose (A) | 0.652 | 2 | 3.112 |
| 玉米浆Corn steep liquor (B) | 0.107 | 2 | 0.511 |
| (NH4)2SO4 (C) | 0.010 | 2 | 0.048 |
| KH2PO4 (D) | 0.069 | 2 | 0.329 |
| 误差Deviation | 0.840 | 8 |
发酵培养基需要满足菌体生长，繁殖的同时有利于目的代谢产物的过量积累，因此发酵培养基的成分以及配比对菌株的生长、代谢产物的积累、以及最终产品的质量和产量都有相当大的影响。初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，硫酸铵25.0，玉米浆6.0，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5，碳酸钙20.0，pH 6.8−7.0。单因素试验确定因素水平范围，考虑到L-Phe氨基供体来源于谷氨酸，故在发酵培养基中添加不同量的谷氨酸，考查其对L-Phe产量的影响。研究表明在培养基中添加柠檬酸钠能够改变一些代谢途径关键酶的活性，可以降低糖酵解中6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，从而减弱糖酵解途径，强化磷酸戊糖途径[24]有利于芳香族氨基酸L-Phe的合成。碳酸钙在发酵过程中起到稳定pH的作用，为微生物发酵提供一个pH缓冲体系，不至于发酵过程中pH变化太大，从而对微生物代谢的酶具有稳定的作用。所以对发酵培养基进行单因素试验时，考察培养基中葡萄糖、玉米浆、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、谷氨酸和碳酸钙对谷氨酸棒杆菌产L-Phe的影响，每个因素取5个水平，其他培养基组分与未优化前培养基成分相同，筛选出影响L-Phe产量的关键因素，如图 2所示。
如图 2发酵培养基单因素结果可知，发酵培养基初糖选择80.0−120.0 g/L，葡萄糖是细胞的碳源，是细胞以及产物合成的代谢碳骨架来源，不同葡萄糖浓度对L-Phe产量影响较大，由图 2可知过低初糖浓度不利于发酵L-Phe的积累，随着葡萄糖浓度的提高，L-Phe产量逐渐提高，葡萄糖浓度达到 110.0 g/L时，L-Phe产量最高达到8.52±0.21 g/L，随着葡萄糖浓度提高，L-Phe产量反而下降，说明过高的初始葡萄糖浓度对L-Phe的合成不利，一方面可能是由于葡萄糖浓度过高对菌体生长产生抑制，另一方面过高的糖浓度使得菌体代谢产生的副产物过多，对菌体合成L-Phe不利，因此选择初始
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图 2
发酵培养基单因素试验确定因素水平范围确定最优区域
Figure 2
Single factor experiment optimized fermentation medium for L-phenylalanine production by recombinant C.glutamicum
注：A：种子培养基中不同葡萄糖浓度对L-Phe产量的影响；B：种子培养基中不同玉米浆浓度对L-Phe产量的影响；C：种子培养基中不同硫酸铵浓度对L-Phe产量的影响；D：种子培养基中不同硫酸镁浓度对L-Phe产量的影响；E：种子培养基中不同磷酸二氢钾浓度对L-Phe产量的影响；F：种子培养基中不同柠檬酸钠浓度对L-Phe产量的影响；G：种子培养基中不同谷氨酸浓度对L-Phe产量的影响；H：种子培养基中不同碳酸钙添加量对L-Phe产量的影响. Note: A, B, C, D, E, F，G and H displayed the effect of glucose, corn steep liquor, (NH4) 2SO4, MgSO4, KH2PO4, sodium citrate, glutamic acid and CaCO3 in the seed medium on the production of L-Phe, respectively. |
葡萄糖浓度为110.0 g/L。玉米浆浓度选择 2.0−18.0 g/L，玉米浆是有机氮源，能够为细胞代谢提供丰富的氮元素以及生长因子，由发酵结果可知，随着玉米浆浓度的增加，L-Phe产量先升高后降低，最高达到8.21±0.11 g/L，说明一定浓度玉米浆引入的生长因子有利于L-Phe的积累，过高的玉米浆浓度引入的生长因子过多，反而不利于L-Phe的积累，因此确定玉米浆浓度为6.0 g/L。硫酸铵浓度确定选择10.0−30.0 g/L，硫酸铵属于无机氮源，能够被很快地利用，随着硫酸铵浓度的增加，L-Phe产量得到提高，最高达到8.38±0.02 g/L，硫酸铵浓度进一步提高时L-Phe产量反而下降，因此最佳硫酸铵浓度选择25.0 g/L。一定浓度的硫酸镁能够对L-Phe合成代谢酶起到激活作用(DS酶，PpsA，Ppc，AroL，AroC)，硫酸镁浓度考察0−2.0 g/L，硫酸镁浓度在1.0 g/L时，L-Phe产量最高达到8.43±0.07 g/L，因此最佳硫酸镁浓度选择1.0 g/L。钾离子也对L-Phe合成途径的酶AroA具有激活作用，考察磷酸二氢钾浓度0−4.0 g/L，磷酸二氢钾添加量为 1.0 g/L时，L-Phe产量最高达到8.31±0.09 g/L，因此最佳磷酸二氢钾浓度选择1.0 g/L。柠檬酸钠浓度的确定，考察0−4.0 g/L柠檬酸钠对L-Phe的影响，柠檬酸钠添加量在2.0 g/L时，L-Phe积累量最高达到8.52 g/L；谷氨酸浓度的确定，考察添加0−4.0 g/L的谷氨酸对L-Phe产量的影响，当添加量为1.0 g/L的谷氨酸时，L-Phe最高达到8.12±0.13 g/L，因此谷氨酸添加量选取1.0 g/L；考察碳酸钙添加量为10.0−30.0 g/L，碳酸钙添加量为25.0 g/L时，L-Phe积累量最高达到8.43±0.14 g/L，因此确定最佳碳酸钙添加量为25.0 g/L。由单因素试验发酵结果结合各因素的方差分析，各因素葡萄糖、玉米浆、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、谷氨酸和碳酸钙的方差分别为5.44、3.50、6.65、2.18、1.56、0.21、0.22和0.07。因素的方差越大说明对L-Phe产量影响波动越大，因此确定影响L-Phe积累的3个关键因素为葡萄糖、玉米浆和硫酸铵，并确定了中心水平为：葡萄糖 110.0 g/L，玉米浆6.0 g/L，硫酸铵25.0 g/L。通过对发酵培养基单因素试验，确定关键因素的最优水平，为后续响应面实验提供参考。发酵培养基(g/L)：葡萄糖110.0，玉米浆6.0，硫酸铵25.0，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁1.0，柠檬酸钠2.0，谷氨酸1.0，碳酸钙25.0，pH 6.8−7.0。
2.4 发酵培养基Box-Behnken Design实验设计根据Box-Behnken中心组合设计原理，在单因素试验的基础上，确定少于4个因素为自变量，L-Phe产量为响应值，本实验以发酵单因素确定的葡萄糖、玉米浆和硫酸铵分别以A、B、C代表作3因素3水平的响应面分析试验，产物L-Phe的浓度为Y，各因素的浓度分别为XA、XB、XC，各自变量水平见表 4，实验设计以及结果见表 5。
| 试验设计 Experiment design | 葡萄糖 Glucose (A) (g/L) | 玉米浆 Corn steep liquor (B) (g/L) | (NH4)2SO4 (C) (g/L) |
| −1 | 100.00 | 4.00 | 20.00 |
| 0 | 110.00 | 6.00 | 25.00 |
| +1 | 120.00 | 8.00 | 30.00 |
| 试验设计序号 Experiment design number | A | B | C | 实验值 Experimental value | 预测值 Predicted value |
| 1 | 0 | 1 | −1 | 8.45 | 8.60 |
| 2 | 1 | 0 | 1 | 8.57 | 8.61 |
| 3 | 1 | −1 | 0 | 7.69 | 7.80 |
| 4 | −1 | 1 | 0 | 8.62 | 8.50 |
| 5 | −1 | 0 | 1 | 7.93 | 8.01 |
| 6 | 1 | 1 | 0 | 8.75 | 8.67 |
| 7 | 0 | 1 | 1 | 8.71 | 8.74 |
| 8 | 0 | −1 | −1 | 7.70 | 7.67 |
| 9 | −1 | 0 | −1 | 8.29 | 8.25 |
| 10 | 0 | −1 | 1 | 7.82 | 7.66 |
| 11 | 0 | 0 | 0 | 9.02 | 8.96 |
| 12 | −1 | −1 | 0 | 7.29 | 7.36 |
| 13 | 0 | 0 | 0 | 8.91 | 8.96 |
| 14 | 0 | 0 | 0 | 8.94 | 8.96 |
| 15 | 1 | 0 | −1 | 8.34 | 8.26 |
利用Design-Expert.V8.0.6软件，对表 5中L-Phe产量实验数据进行多元回归拟合，建立二次响应面回归模型，进而寻求最优响应因子水平，L-Phe对葡萄糖、玉米浆和硫酸铵的多元二次回归方程如下，分析结果见表 6。
Y=−45.57+0.794 08×XA+2.008 13×XB+0.252 42× XC−3.375×10−3×XA×XB+2.95×10−3×XA×XC+3.50× 10−3×XB×XC−3.783 33×10−3×XA×XA−0.122 71×XB×XB− 0.011 833×XC×XC
| 变异来源 Sources of variation | 平方和 Sum of squares | 自由度 Degree of freedom | 均方 Mean square | F值 F value | P值 P value |
| 模型 Model | 3.858 482 | 9 | 0.428 720 | 19.055 640 | 0.002 3 |
| A-A | 0.186 050 | 1 | 0.186 050 | 8.269 501 | 0.034 8 |
| B-B | 2.030 113 | 1 | 2.030 113 | 90.233 910 | 0.000 2 |
| C-C | 0.007 813 | 1 | 0.007 813 | 0.347 248 | 0.581 3 |
| AB | 0.018 225 | 1 | 0.018 225 | 0.810 060 | 0.409 4 |
| AC | 0.087 025 | 1 | 0.087 025 | 3.868 064 | 0.106 4 |
| BC | 0.004 900 | 1 | 0.004 900 | 0.217 794 | 0.660 4 |
| A2 | 0.528 503 | 1 | 0.528 503 | 23.490 740 | 0.004 7 |
| B2 | 0.889 541 | 1 | 0.889 541 | 39.538 090 | 0.001 5 |
| C2 | 0.323141 | 1 | 0.323 141 | 14.362 890 | 0.012 8 |
| 残差 Residual | 0.112 492 | 5 | 0.022 498 | ||
| 失拟项 Lack of fit | 0.106 025 | 3 | 0.035 342 | 10.930 410 | 0.085 0 |
| 纯误差 Pure error | 0.006 467 | 2 | 0.003 233 | ||
| 总和 Cor total | 3.970 973 | 14 |
由表 6回归模型的方差分析和显著性检验可知，该二次模型显著(p＜0.05)，失拟项大于0.05不显著，经过计算分析，该模型决定系数R2=0.971 7大于80%，说明实际值和预测值之间的相关性较好，同时Adj R2=0.920 7，说明有92.07%的变异能够由该模型解释，因此认为该模型可以用来代替真实实验点对实验结果进行分析和预测。由表 6回归系数的显著性检验可知，因素A、B对L-Phe的线性效果显著，C对L-Phe线性效果不显著；因素AB、AC、BC之间对L-Phe的交互效应均不显著；因素A、B和C对L-Phe的曲面效应均显著，如图 3−5所示。
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| 图 3 葡萄糖和玉米浆对L-Phe产量的响应面分析 Figure 3 Three-dimensional response surface plots for the effect of L-Phe production between glucose and corn steep liquor by recombinantC. glutamicum |
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| 图 4 葡萄糖和硫酸铵对L-Phe产量的响应面分析 Figure 4 Three-dimensional response surface plots for the effect of L-Phe production between glucose and (NH4)2SO4 by recombinantC. glutamicum |
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| 图 5 玉米浆和硫酸铵对L-Phe产量的响应面分析 Figure 5 Three-dimensional response surface plots for the effect of L-Phe production between corn steep liquor and (NH4)2SO4 by recombinant C. glutamicum |
由响应面三维曲面图可知，该模型具有最大值。用该组图可以对影响L-Phe合成的任何2种因素的交互效应进行分析和评估，并确定最佳因素的水平范围。根据二次回归方程计算预测：葡萄糖108.64 g/L，玉米浆7.05 g/L，硫酸铵25.33 g/L，考虑实际培养基的配制，最终确定3个因素的水平分别为：葡萄糖 110.0 g/L，玉米浆7.0 g/L，硫酸铵25.0 g/L。最佳发酵培养基(g/L)：葡萄糖110.0，玉米浆7.0，硫酸铵25.0，硫酸镁1.0，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，谷氨酸 1.0，碳酸钙25.0，pH 6.8− 7.0，L-Phe最高达到9.09 g/L。根据预测的进行设计实验验证，发酵最终产量为9.14±0.27 g/L，与实验预测比较接近，进一步说明模型建立的可靠。
3 结论通过对重组谷氨酸棒杆菌种子培养基以及发酵培养基进行优化，最终确定了最佳种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆干粉25.0，硫酸铵15.0，硫酸镁1.0，磷酸二氢钾2.0，尿素2.0，pH 6.8−7.0。通过对发酵培养基单因素试验，确定关键因素的最优水平，为后续响应面实验提供参考。最佳发酵培养基(g/L)：葡萄糖110.0，玉米浆7.0，硫酸铵25.0，硫酸镁1.0，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，谷氨酸1.0，碳酸钙25.0，pH 6.8−7.0。通过对重组谷氨酸棒杆菌种子培养基优化，L-Phe产量由7.46 g/L提高到8.10 g/L，提高了8.6%。进一步通过对发酵培养基进行优化，L-Phe产量由8.10 g/L提高到 9.14 g/L，提高了12.8%。本实验通过对重组谷氨酸棒杆菌培养基的优化使L-Phe产量提高了22.5%，说明培养基组分及含量对L-Phe的合成有一定的影响，同时为进一步放大实验提供了依据。
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