工业的迅猛发展，尤其是制革、印染、电镀等行业的发展，导致了大量含Cr(VI)工业废水的产生。近年来发现Cr(VI)具有潜在的致癌性和基因诱变性，使得环境Cr(VI)污染问题变得倍受关注。Cr(VI)污染的处理方式是通过物理化学方法或生物方法将水体中高毒游离的Cr(VI)还原为低毒稳定的Cr(III)^{[1, 2]}。物理化学治理方法价格较贵，且容易因反应不完全而造成二次污染。因此，Cr(VI)污染的生物治理方法由于环保高效、成本低廉等特点而备受关注^[3]。目前国内外在含Cr(VI)废水微生物处理方面的研究主要利用的都是在碱性环境生长良好的菌株，而在酸性环境下微生物直接还原Cr(VI)的研究鲜见报道。电镀厂废水、矿区废水等Cr(VI)污染多为酸性环境，若用碱性菌株进行处理，则需将pH值调成碱性，提高了处理成本。因此，开发酸性条件下新型Cr(VI)还原菌种资源迫在眉睫。隐藏嗜酸菌A.cryptum是一种革兰氏阴性、兼性异养的嗜酸异化铁还原菌，属于α-变形菌纲嗜酸菌属。最适宜的生长温度为30-35 °C，耐受的pH值范围为1.9-5.9，因其在酸性环境下还原高价金属离子的能力，而成为酸性Cr(VI)还原菌株的最佳候选之一^[4]。该菌对Cr(VI)的还原与一种I型细胞色素c (ApcA)的作用有关，其基因编号为Acry_2099^[5]。本研究考察了该菌还原Cr(VI)的特性和最佳工艺，并通过RT-qPCR探究Acry_2099的差异表达与Cr(VI)还原速率的相关性，为Cr(VI)污染环境的修复提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株：Acidiphilium cryptum XTS为本实验室从酸性矿坑水中分离得到，已由本实验室保存。

1.1.2 培养基：9K基础培养基(g/L)^[6]：(NH₄)₂SO₄ 3.00，KCl 0.10，K₂HPO₄ 0.50，MgSO₄·7H₂O 0.50，Ca(NO₃)₂ 0.01。菌株的富集、活化及扩大培养时采用向上述9 K基础培养基中加入质量体积比为1%的葡萄糖作为外源能源物质，用硫酸调pH至3.5。各组分充分溶解后于1×10⁵ Pa灭菌30 min。

1.2 Cr(VI)的测定：

采用二苯碳酰二肼分光光度法(GB/T 15555.5-1995)测定Cr(VI)的浓度^[7]。

1.3 A. cryptum XTS对Cr(VI)的还原

将实验所需菌株A. cryptumXTS传代活化，培养至生长活性最高的对数期，再以5%接种量转接到新鲜的50 mL含有重铬酸钾的液体培养基，于最适生长温度30 °C恒温170 r/min振荡培养。取样时，吸取500 μL菌液，12 000 r/min离心取上清液，取200 μL上清液至50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，混匀，加入3 mL含混合酸的DPCI溶液，摇匀，静置5 min，用30 mm比色皿，在540 nm的波长下用紫外可见分光光度仪测吸光度。

1.4 A. cryptum XTS对Cr(VI)的还原条件研究 1.4.1 A. cryptum XTS对Cr(VI)的还原能力：分别设置加菌组与不加菌组，每隔一定时间取样，测定Cr(VI)还原率情况。设立3组平行实验同时测定。

1.4.2 不同pH对A. cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：分别设置pH 1.9、2.9、3.9、4.9、5.9的梯度，每隔一定时间取样，测定Cr(VI)还原率情况。设立3组平行实验同时测定。

1.4.3 不同初始Cr(VI)浓度对A. cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：分别设置初始Cr(VI)浓度为20、40、60、80和100 mg/L 5个梯度，每隔一定时间取样，测定Cr(VI)还原率情况。设立3组平行实验同时测定。

1.4.4 Fe(III)的加入对A.cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：在初始Cr(VI)浓度均为50 mg/L的前提下设置不含Fe(III)和Fe(III)浓度为50 mg/L两个梯度，每隔一定时间取样，测定Cr(VI)还原率情况。设立3组平行实验同时测定。

1.4.5 氧气含量对A.cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：在初始Cr(VI)浓度均为50 mg/L的前提下设置好氧与厌氧两种培养条件，厌氧组平行处理12份，塞紧橡胶塞，充氮气5 min除氧后密封，分别于培养的4、18、23、27、41、48、65、75、89、113、137和151 h取出一瓶进行取样，测定Cr(VI)还原率情况。设立3组平行实验同时测定。

1.4.6 正交试验表的设计^[8]：由上述实验结果可知，初始Cr(VI)浓度、pH值和Fe(III)加入浓度这3个因素对A.cryptum XTS还原Cr(VI)具有显著影响，而氧气的含量则对A. cryptum XTS还原相同起始浓度的Cr(VI)的影响不大，因此选取初始Cr(VI)浓度、pH值和Fe(III)加入浓度3个因素，每个因素3个水平，设立3组平行实验同时测定。选用L₉(3⁴)作为该考察试验指标的正交表，因素水平试验分配方案见表 1。

1.5 Real time-qPCR 1.5.1 Real time-qPCR的引物设计：引物16S-F、16S-R、2099-F、2099-R以National Center for Biotechnology Information Institute (NCBI)网站上的A.cryptum JF-5全基因组序列为模板，由Primer Premiers 6.0软件设计^{[9, 10]}，上海生工生物工程有限公司合成，引物情况见表 2。

1.5.2 总DNA的提取及目的基因的PCR扩增：使用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取XTS菌株的基因组DNA，使用美国Bio-Rad公司的基因扩增仪进行扩增。PCR反应体系(50 μL)为：模板DNA 2.0 μL、2×Pfu PCR Master Mix 25.0 μL、表 2引物F和引物R (5 pmol/L)各2.0 μL、ddH₂O 19.0 μL。PCR扩增条件为：94 ºC 5 min；94 °C 45 s，55 ºC 45 s，72 ºC 90 s，共32个循环；72 ºC 10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下切胶回收，使用北京天根公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的片段。

1.5.3 目的基因的克隆及序列比对：PCR产物经凝胶纯化后连接到pGM-T载体上，16 °C水浴过夜。连接体系为：10×T4连接 Buffer 1.0 μL，pGM-T载体1.0 μL，PCR产物7.0 μL，T4 DNA连接酶1.0 μL。连接产物转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞，在LB固体培养基上进行蓝白筛选。将得到的白色菌落接种至含有终浓度为100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C、200 r/min振荡培养过夜后提取质粒，用通用引物T7 (5′-TAATACGACTCACTATA GGG-3′)，反向引物SP6 (5′-TACGATTTAGGTGAC ACTATAG-3′)进行PCR扩增。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果用BLAST进行序列比对。

1.5.4 总RNA提取及cDNA合成：使用RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(北京天根公司)进行总RNA的提取及纯化。cDNA的合成使用反转录试剂盒FastQuant RT Kit (with gDNase)(北京天根公司)。分别用NanoDrop^®微量分光光度计测定其纯度和浓度。

1.5.5 RT-PCR检测：利用iCycler iQ的Real-time PCR仪进行RT-PCR检测。使用SuperReal PreMix (SYBR Green)试剂盒(北京天根公司)进行实时定量PCR检测。RT-PCR反应体系(50 μL)为：cDNA模板2.0 μL、2×SuperReal PreMix 25.0 μL、表 2引物F和引物R (5 pmol/L)各2.0 μL、ddH₂O 19.0 μL。RT-PCR扩增条件为：94 ºC 3 min；94 ºC 30 s，57 ºC 30 s，72 ºC 1 min，共40个循环；95 °C 1 min；55 °C 1 min；55 °C 10 s，共80个循环，每个循环时按0.5 °C递增，直到95 °C循环结束。

1.5.6 数据处理：使用Pfaffl法^[11]来计算基因的相对表达量，相对表达量由未知样本和内参基因的E值和C_t值推导出，公式为：

Rratio=Etarget^{ΔCttarget(control-sample)}/Erefere^{ΔCtreference(control-sample)}

Etarget为目的基因的扩增效率，Erefere为内参基因16S rDNA的扩增效率，ΔC_ttarget为参照体系中目的基因的C_t减去待测样品中目的基因的C_t，ΔC_tref为参照体系中内参基因的C_t减去待测样本中内参基因的ΔC_t。计算结果表示，目的基因在实验组的表达量为对照组中表达量的倍数。

2 结果与分析 2.1 A.cryptum XTS对Cr(VI)的还原条件研究 2.1.1 A. cryptum XTS对Cr(VI)的还原能力：其他培养条件相同的情况下，加入细菌与不加细菌组对Cr(VI)的还原情况如图 1所示。可以看到，初始Cr(VI)浓度同样为50 mg/L的条件下，加菌组对Cr(VI)的还原速率很快，151 h内，98.60%的Cr(VI)被还原；而不加菌组对Cr(VI)浓度的影响则很小。可见Cr(VI)浓度降低的原因主要来自细菌对其的还原能力，与培养基中所含的其他物质无关。

2.1.2 不同pH对A.cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：本实验组前期研究发现^{[4, 12]}，隐藏嗜酸菌A. cryptum的生长适宜pH值为1.9-5.9，最适pH为3.0-3.5。其他培养条件相同，初始Cr(VI)浓度为 50 mg/L的条件下，A.cryptum XTS在pH为1.9、2.9、3.9、4.9和5.9条件下对Cr(VI)的还原情况如图 2所示。可以看到，在开始的5 h内，细菌对Cr(VI)的平均还原率为39.22%，在pH为1.9时还原率最高，达到了73.41%。pH为1.9时，A. cryptum XTS对Cr(VI)的还原速率最快，在41 h内还原率达到了100%；而相同时间内，pH为5.9的条件下，Cr(VI)仅被还原了39%。可见，pH对Cr(VI)的还原具有重要的影响，该菌在其生长适宜的pH范围内都能有效地还原Cr(VI)，但最适Cr(VI)还原的pH却和该菌的最适生长pH不同^[13]。

2.1.3 不同初始Cr(VI)浓度对A.cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：其他培养条件相同，初始pH为2的条件下，Cr(VI)浓度分别为0、20、40、60、80和100 mg/L时，A.cryptum XTS菌株在151 h内对Cr(VI)的还原率如图 3所示。在开始的27 h内，细菌对Cr(VI)的还原速率很快，还原率平均为48.19%，其中20 mg/L浓度的还原率最高，达到了68.52%。在137 h时，20 mg/L的Cr(VI)被还原完全；在151 h时，40 mg/L的Cr(VI)被还原完全，而60、80和100 mg/L的Cr(VI)还原率分别为93.37%、92.17%和83.38%。可见A. cryptum XTS虽然能够直接还原Cr(VI)，但其还原速率和还原率有限，且Cr(VI)浓度越高，该菌还原能力呈现递减趋势。其原因是否是具有毒性的Cr(VI)部分抑制了微生物活性，阻碍了其生物代谢过程所致，还有待进一步 研究。

2.1.4 Fe(III)的加入对A.cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：Li等^[14]在文献中提到，Fe(III)的加入可以促进垃圾渗滤液中的Cr(VI)还原成Cr(III)。它可能是通过一种称为“Electron shuttle (电子穿梭)”的机制促使细菌首先还原Fe(III)，Cr(VI)接受Fe(III)还原成Fe(II)所提供的电子，从而使自身还原为Cr(III)。

Cr(VI)+3Fe(II)→Cr(III)+3Fe(III)

从图 4中可以看出，其他培养条件相同，初始pH为2.0的条件下，加Fe(III)组的Cr(VI)还原率与还原速率均高于不加Fe(III)组，还原率达到74.09%，比不加Fe(III)组高出30.68%。这证明，Fe(III)的存在确实能促进A. cryptum XTS对Cr(VI)的还原，而该过程究竟是采取电子穿梭机制还是Fe(III)的加入能影响Acry_2099基因表达水平，还有待后续实验进一步研究。

2.1.5 氧气含量对A.cryptum XTS还原Cr(VI)的影响：比较菌株A.cryptum XTS分别在好氧以及微厌氧条件下培养82 h后的Cr(VI)还原效果，结果如图 5所示。其他培养条件相同的情况下，氧气含量对A. cryptum XTS还原相同起始浓度的Cr(VI)的影响不大，这表明Cr(VI)的还原不是一个依赖氧气的过程，氧气不是必需的电子受体。Timothy等^{[5, 15]}提出，A. cryptum还原Cr(VI)的机制可能是I型细胞色素c(ApcA)充当一种在呼吸复合物和电子受体金属之间的中间电子运输体，通过其¹H、¹³C和¹⁵N骨架、侧链和血红素的化学位移形成氧化和还原两种状态，从还原醌类接受电子，而将Cr(VI)还原为Cr(III)(图 6)。氧气在整个电子循环过程中并未起到关键作用。

2.1.6 动力学分析：ApcA催化方程反应机理符合Michaelies-Menten方程，则可根据M-M方程：

r_S=$\frac{{{k_{ + 2}}{c_{E0}}{c_S}}}{{{K_S} + {c_S}}}$=${\frac{{{r_{\max }}{c_S}}}{{{K_S} + {c_S}}}_{}}$

进行积分，得到：

r_maxt=(c_S0-c_S)+K_mln$\frac{{{c_{S0}}}}{{{c_S}}}$

对该式进行整理，分别得到下式：

$\frac{{\ln \frac{{{c_{S0}}}}{{{c_S}}}}}{{{c_{S0}} - {c_S}}} = \frac{{{r_{\max }}}}{{{K_m}}}\frac{t}{{{c_{S0}} - {c_S}}} - \frac{1}{{{K_m}}}$

$\frac{1}{t}\ln \frac{{{c_{S0}}}}{{{c_S}}} = \frac{{{r_{\max }}}}{{{K_m}}} - \frac{1}{{{K_m}}}\frac{{{c_{S0}} - {c_S}}}{t}$

由图 2-5实验，测出c_S −t系列数据，并代入上述各式，分别以$\frac{{\ln ({c_{S0}}/{c_S})}}{{{c_{S0}} - {c_S}}}$与$\frac{t}{{{c_{S0}} - {c_S}}}$为纵、横坐标对应作图，结果使用Oringin 8.0可拟合为一直线，这表明该反应符合M-M方程，得到动力学回归方程及K_m值如表 3所示。

K_m是酶的特征常数，反映了酶同底物亲和力的大小。当K_m值较大时，酶与底物的结合力弱，易解离，表示酶对底物的亲和力小；当K_m值较小时，酶与底物的结合力强，不易解离，表示酶对底物的亲和力大。由表 3可知，Fe(III)的加入和氧气的存在与否对ApcA酶动力学参数K_m的影响不明显，而A. cryptum XTS在不同pH下还原Cr(VI)的K_m值则有显著性差异。在pH为2.9时，有最大K_m；pH为3.9时，K_m最小，表明pH 3.9有明显激活ApcA活性的作用。对A. cryptum XTS在不同初始Cr(VI)浓度下还原Cr(VI)的K_m值进行比较，也可以看到，Cr(VI)浓度为80 mg/L时有最大K_m；当初始Cr(VI)浓度为40 mg/L时，K_m最小，表明初始Cr(VI)浓度对ApcA的催化反应有显著影响，Cr(VI)浓度为 40 mg/L能明显激活ApcA活性。

2.2 正交试验结果 2.2.1 正交试验数据处理及结果：使用24 h内被还原的Cr(VI)浓度作为衡量指标，每组设置3次平行，按照表 4进行数据处理。

2.2.2 极差分析：从极差(R)的大小可见该指标下各影响因素的主次，极差分析见表 5。

试验结果经过极差分析，得到的结果为T₁>T₂>T₃。即：在变化的水平范围内，因素1 (即初始Cr(VI)浓度)对结果造成的影响最大，其次为因素2 (pH值)，因素3 (Fe(III)浓度)对结果造成的影响最小。反之，T越小，与之对应的那一列的因素试验的结果影响越小。

试验结果为：D₃₁>D₂₁>D₁₁，D₂₂>D₃₂>D₁₂，D₃₃>D₂₃>D₁₃，D值为Cr(VI)还原量，一般希望Cr(VI)还原量越大越好，因此根据D值的大小很快可以确定对应因素水平组合，即配合比为A₃B₂C₃的试验结果是最优化配合比，即初始Cr(VI)浓度为80 mg/L，pH为2.9，Fe(III)浓度为100 mg/L是最优化配合比。在该条件下处理24 h，Cr(VI)的还原率达到67.48%。

2.3 RT-qPCR 2.3.1 目的基因的序列比对及相关引物质量评估：以XTS基因组DNA为模板PCR结果如图 7，内参基因引物对16S-F和16S-R的扩增产物片段在 150 bp左右，目的基因引物对2099-F和2099-R的扩增产物片段在100 bp左右，与预期引物扩增产物长度148 bp和105 bp相符。相关基因阳性质粒菌体PCR产物经由BLAST比对结果证实，其序列与模式菌A. cryptumJF-5的同源功能基因序列一致性达到了99.7%，可用于后续实验研究。

2.3.2 总RNA和cDNA质量分析：总RNA经NanoDrop^®微量分光光度计检测分析如图所示，紫外吸收光谱曲线平滑，260 nm处有最大吸收值，为典型的RNA紫外吸收峰，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.90-2.15之间，另一纯度指标OD₂₆₀/OD₂₃₀比值在2.00-2.30间，以上数据表明总RNA样品的纯度高。反转录所得的cDNA经NanoDrop^®微量分光光度计检测，吸光光谱曲线平滑，260 nm处有最大吸收峰，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.75-1.85之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值约为1.90-2.10，以上数据表明，反转录得到的cDNA样品纯度高，可用于后续实验。(提取RNA所用的RNAprep Pure Cell/ Bacteria Kit购自天根生化科技(北京)有限公司，反转录所用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司)。

2.3.3 RT-qPCR结果与分析：从图 8可以看出，Acry_2099基因的表达差异与A. cryptum XTS Cr(VI)还原速率成正相关，pH值越低，Acry_2099基因的表达量上调倍数越多。这是由于，ApcA还原Cr(VI)是一个依赖于pH的反应，较低的pH有利于完成蛋白的再氧化。同时，低pH也能促进ApcA传递电子给Cr(VI)，从而完成Cr(VI)的催化还原。由图 9可以看出，在Cr(VI)浓度为80 mg/L时，Acry_2099基因的表达量上调倍数最多，表明该浓度的Cr(VI)能够最大程度地促进细菌对Cr(VI)还原作用。Acry_2099基因的表达量与其接受的电子数量成正比，而由图 10可以看出，Fe(III)的加入与否对Acry_2099基因的表达量上调倍数影响不大，这表明，在Fe(III)存在下，一种间接的机制主导着Cr(VI)的还原。Fe(III)被酶促还原为Fe(II)，快速将得到的电子传递给Cr(VI)，将其还原为Cr(III)。动力学上可知，细菌还原Fe(III)比直接还原Cr(VI)来得快，而由Fe(II)还原Cr(VI)的化学反应也会比一般的酶促反应快得多。由图 11可以看出，在氧气充足和缺乏氧气的环境中，Acry_2099基因的表达量上调倍数差别不大，这表明氧气的存在与否并不是影响细菌还原Cr(VI)的关键因素。

3 结论

(1) pH对A. cryptum XTS还原Cr(VI)具有重要影响作用，该菌还原Cr(VI)的最适pH与其最适生长pH并不相同，较低pH能够促进ApcA传递电子给Cr(VI)，有助于细菌六价铬的还原；

(2) 随着初始Cr(VI)浓度的增高，A. cryptum XTS对Cr(VI)的还原能力呈现递减趋势；这可能是由于具有毒性的Cr(VI)部分抑制了微生物活性，阻碍了其生物代谢过程所致；

(3) Fe(III)的存在下，A. cryptum XTS能够通过“电子穿梭”机制加速细菌对六价铬的还原，但Fe(III)的加入对Acry_2099基因表达水平没有显著的影响；

(4) 好氧与微厌氧条件对细菌还原Cr(VI)的影响相差不大，这说明细菌还原Cr(VI)，是ApcA充当中间电子运输体，通过其化学位移形成氧化和还原两种状态而还原Cr(VI)，氧气并不是充当主要的最终电子受体，其存在与否并不是还原Cr(VI)的关键因素；

(5) 正交试验结果显示，初始Cr(VI)浓度为 80 mg/L，pH为2.9，Fe(III)浓度为100 mg/L是A.cryptum XTS还原Cr(VI)的最优化配合比。