水葫芦，学名凤眼莲(Eichhornia crassipes)，多年水生漂浮植物，因其具有极强的氮、磷吸收能力和重金属富集能力，且根部能分泌抑藻物质抑制蓝藻的生长，被广泛用于富营养化水体，特别是藻型富营养化水体的生态修复中^{[1, 2, 3, 4, 5]}。但水葫芦作为一种恶性外来入侵杂草，已经引起了一系列的生态、经济、社会问题，一些研究者担忧水葫芦的生长会威胁其他水体生物群落结构及其多样性^{[6, 7]}。有关大水面放养水葫芦对底栖动物、浮游动物以及浮游藻类群落结构与多样性的影响已有报道^{[7, 8, 9]}。而细菌是湖泊生态系统中的重要组成部分，驱动着湖泊生态系统中绝大多数生物活性元素的形态转化和地球化学循环，有关水葫芦对湖泊水体细菌群落结构及其多样性影响的研究还未见报道。

滇池位于昆明市西南(N24°23′-26°22′， E102°10′-103°40′)，是云贵高原面积最大的淡水湖，面积约300 km²，平均水深4.7 m^[8]。由于城市化进程的飞速发展，自20世纪80年代以来，排入滇池的污染物不断增加，水质恶化，整个湖泊富营养化问题十分严重，并爆发严重的蓝藻水华。近年来，水葫芦被广泛应用于滇池水污染的治理，取得了一系列实用性进展^{[1, 10]}。目前，滇池中放养的水葫芦主要有两个品种：紫根水葫芦和野生普通水葫芦。紫根水葫芦系云南省生态农业研究所诱导培育而成，叶柄短小，根系发达，根长最长可达150 cm，去污能力和抑制蓝藻的能力均显著强于普通水葫芦^{[11, 12]}。

本研究以滇池紫根水葫芦放养区、普通水葫芦放养区以及未放养水葫芦区域水体为研究对象，通过对3种水体中的可培养细菌进行分离鉴定，分析可培养细菌群落结构与多样性，初步探讨了水葫芦对水体细菌群落结构与多样性的影响，为进一步认识水葫芦对水体生物多样性的影响，科学评价其在生态修复工程中的安全性提供依据。

样品经系列梯度稀释后涂布在NA培养基上，28 °C倒置恒温培养，5 d后统计数量。挑取具有不同菌落形态的单菌落进一步纯化，纯化后的菌种转接到NA斜面，4 °C保存。

参照文献^[14]的方法提取菌株基因组DNA。以细菌16S rRNA基因通用引物PA (5'-CAGAGTTTG ATCCTGGCT-3′)和PB (5′-AGGAGGTGATCCAGC CGCA-3′)进行扩增。扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。使用EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/)在线比对序列，下载相似性最高的菌株序列。结合LPSN (http://www.bacterio.net/)在线分析各菌株的属以上分类单位。将测定序列和获得的同源序列用ClustalX进行多重比对，采用MEGA 5.0软件包中的Kimura2-Parameter Distance模型进行多序列匹配，用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，Bootstrap 1 000次检测各分支的置信值^[15]。NCBI数据库中获得序列登录号为：KJ513784-KJ513879。

定义16S rRNA基因一致性>97%作为同一分类单位，以Shannon-Wiener多样性指数(H′)评估3种水体可培养细菌的多样性。计算方法参照文献^[16]。

利用NA培养基对3种水体样品进行分离，共获得了143株菌落形态差异的细菌，其中紫根水葫芦区(ZW) 54株，普通水葫芦区(PW) 49株，未放养水葫芦区(CK) 40株。所有菌株分属于变形菌门α亚群(Alphaproteobacteria)、变形菌门β亚群(Betaproteobacteria)、变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus) 7大类群中。ZW、PW、CK 3种水体细菌的数量分别为1.35×10⁷、8.35×10⁶、2.70×10⁶ CFU/L。

定义16S rRNA基因相似性低于97%时作为不同的分类单位进行多样性计算，结果表明：分离自紫根水葫芦区的54个菌株可以划分为37个不同的分类单元，Shannon-Wiener多样性指数为3.17；分离自普通水葫芦区的49个菌株可划分为34个不同的分类单元，Shannon-Wiener多样性指数为3.07；分离自未放养水葫芦区域水体的40个菌株可划分为25个不同的分类单元，Shannon-Wiener多样性指数为2.73。在属的水平上，分离自紫根水葫芦区水体的54株细菌分属于7大类群的29个属；分离自普通水葫芦区的49株菌分属于6大类群的27个属；分离自未放养水葫芦区域水体的40个菌株分属于6大类群的20个属(图 1)。以紫根水葫芦区细菌多样性最高，普通水葫芦区次之，未放养水葫芦区域最低。

图 1　 3种不同水体细菌属水平的比较 Figure 1　 Relative abundance of bacterial genera associated with three different water in Lake Dianchi

图选项

16S rRNA序列分析表明，54株紫根水葫芦区水体细菌分属于7大类群(表 1，图 2)。其中，23株属于变形菌门α亚群(Alphaproteobacteria，35.1%)，10株属于放线菌门(Actinobacteria，18.9%)，6株属于变形菌门β亚群(Betaproteobacteria，13.5%)， 6株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria，13.5%)，6株属于拟杆菌门(Bacteroidetes，13.5%)，2株属于厚壁菌门(Firmicutes，2.7%)，1株属于异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)。

图 2　 邻接法构建的滇池紫根水葫芦区水体可培养细菌16S rRNA序列系统发育树 Figure 2　 Phylogenetic Neighbor-Joining tree based on 16S rRNA gene sequences of cultivable bacterial from water of planting water hyacinth with purple root (ZW) in Lake Dianchi Note: GenBank accession numbers are shown in parentheses. Bootstrap values were calculated from 1 000 replications of Kimura 2-parameter, and bootstrap values higher than 50% are shown. The scale bar represents 0.05 changes per sequence position.

图选项

类群Alphaproteobacteria在紫根水葫芦区水体细菌中比例最高，包括了短波单胞菌属(Brevundimonas)等11个属，是分离获得的最优势菌群。10株Actinobacteria类群的菌株，包括了链霉菌属(Streptomyces)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)和考克氏菌属(Kocuria)，是分离获得的第二优势菌群。除YIM 114与已报道菌株的16S rRNA序列相似性低于97%，其余菌株序列均与参比序列有97%-100%的相似性。YIM 114与已知菌株Niastella populi (EU877262)序列相似性最高，为94.35%，可能代表了新的分类单元，其分类地位有待于进一步的鉴定。

16S rRNA序列分析表明，分离的49株普通水葫芦区水体细菌分属于6大类群(表 2，图 3)。其中，14株属于变形菌门α亚群(Alphaproteobacteria，32.4%)，20株属于放线菌门(Actinobacteria，32.4%)，7株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria，14.6%)，4株属于拟杆菌门(Bacteroidetes，8.8%)，2株属于变形菌门β亚群(Betaproteobacteria，5.9%)，2株属于厚壁菌门(Firmicutes，5.9%)。

图 3　 邻接法构建的滇池普通水葫芦区水体可培养细菌16S rRNA序列系统发育树 Fig. 3　 Phylogenetic Neighbor-Joining tree based on 16S rRNA gene sequences of cultivable bacterial from water of planting wild-type water hyacinth (PW) in Lake Dianchi

图选项

类群Alphaproteobacteria和Actinobacteria在普通水葫芦区水体细菌中所占比例最高，均为优势菌群。其中类群Alphaproteobacteria包括了鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等9个属。10株Actinobacteria类群的菌株，包括了链霉菌(Streptomyces)等8个属。除YIM 202与已报道菌株的16S rRNA序列相似性低于97%，其余菌株序列均与参比序列有97%-100%的相似性。YIM 202与Sphingomonas changbaiensis (EU682685)序列相似性最高，为96.03%，可能代表了新的分类单元。

16S rRNA序列分析表明，分离的40株未放养水葫芦区域水体细菌分属于6大类群(表 3，图 4)。其中，14株属于变形菌门α亚群(Alphaproteobacteria，40%)，7株属于放线菌门(Actinobacteria，20%)，6株属于变形菌门β亚群(Betaproteobacteria，16%)，6株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria，12%)，3株属于拟杆菌门(Bacteroidetes，8%)，4株属于厚壁菌门(Firmicutes，4%)。

图 4　 邻接法构建的滇池未放养水葫芦区域水体可培养细菌16S rRNA序列系统发育树 Figure 4　 Phylogenetic Neighbor-Joining tree based on 16S rRNA gene sequences of cultivable bacterial from non-planting sites (CK) in Lake Dianchi

图选项

类群Alphaproteobacteria在对照区水体细菌中所占比例最高，包括了柄杆菌属(Caulobacter)等8个属，为分离菌株的最优势菌群。9株(19.2%) Betaproteobacteria类群的菌株在系统发育上与福格斯氏菌属(Vogesella)、杜檊氏属(Duganella)、噬酸菌属(Acidovorax)和Kinneretia菌属关系密切，为次优势类群。除YIM 002与已报道菌株的16S rRNA序列相似性低于97%，其余菌株序列均与参比序列有97%-100%的相似性。YIM 002与Sphingopyxis ummariensis (EF424391)序列相似性最高，为96.26%，可能代表了新的分类单元。

本文以传统的纯培养方法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对滇池晖湾紫根水葫芦放养区、普通水葫芦放养区以及未放养水葫芦对照区的3种水体可培养细菌群落结构进行研究。共分离纯化获得细菌143株，其中紫根水葫芦区54株，普通水葫芦区49株，未放养水葫芦区40株，所有菌株分属于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Deinococcus-Thermus等7大类群的 48个属(图 1)。进一步统计分析发现，放养水葫芦区域可培养细菌无论从数量还是多样性指数均相对未放养水葫芦区域较高，其中紫根水葫芦区最高，普通水葫芦区次之，未放养水葫芦区域最低，结果并未显示出水葫芦对于湖泊水体可培养细菌多样性的不利影响。分析其主要原因可能是放养水葫芦显著提高了水体中氮、磷的含量^{[8, 9, 10]}，因为氮、磷是细菌增殖的限制因子，氮、磷的增加能促进湖泊中细菌的增殖^[17]。其次，由于水葫芦具有极强的竞争性和分泌化感物质，可以抑制浮游植物的生长，而浮游植物群落可以显著影响水体浮游细菌的多样性^{[7, 18]}。此外，水葫芦在生长过程中能吸收水体中的有毒有害污染物质，且根系分泌的代谢产物及根脱落物中含有大量有机质，为微生物提供了丰富的营养来源，为其增殖创造了条件^{[9, 16]}。

分离自紫根水葫芦区水体的54株细菌分属于7大类群的29个属，其中短波单胞菌属(Brevundimonas)、固氮螺菌属(Azospirillum)、下水道球菌属(Amaricoccus)、红长命菌属(Rubrivivax)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、贪噬菌属(Variovorax)、砂单胞菌属(Arenimonas)、希万氏菌属(Shewanella)、农研所丝杆菌属(Niastella)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、土地杆菌属(Pedobacter)和异常球菌属(Deinococcus) 12个属的菌仅在该区域分离得到。分离自普通水葫芦区的49株菌分属于6大类群的27个属，其中根瘤菌属(Rhizobium)、Croceicoccus、简单螺旋形菌属(Simplicispira)、藤 黄单胞菌属(Luteimonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、壤霉菌属(Agromyces)、壤球菌属(Agrococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、微小杆菌属(Exiguobacterium) 11属为该区域特有。而分离自未放养水葫芦区域水体的40株细菌也有7个属的菌为其特有(图 1)。3种水体仅有鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、红细菌属(Rhodobacter)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、新鞘脂菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微杆菌属(Microbacterium)、链霉菌属(Steptomyces)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)等10个共有菌属。说明放养水葫芦确实对水体可培养细菌的群落结构产生了较大的影响，而且两种水葫芦对水体细菌群落结构的影响也不相同。这可能与植物对根际微生物具有选择性有关；另外，紫根水葫芦的根系发达，根长及根系密度远大于普通的野生水葫芦，也可能是产生不同影响作用的原因之一。

吴根福等^[19]对杭州西湖水域浮游可培养异养细菌的研究结果表明，革兰氏阴性菌在杭州西湖水域浮游异养细菌中占到95%，为绝对优势菌群。Glockner F.等^[20]分析了澳大利亚、俄国、德国的3个淡水湖泊中细菌的16S rRNA序列，共获得190个序列，可分为16个类群，其中有15个类群为革兰氏阴性菌。本研究中分离获得的143株细菌中革兰氏阳性菌占到69%左右，为绝对优势菌群，这与有关报道结果相似，但革兰氏阴性菌所占比例相对较低。推测这一结果可能与放养水葫芦有关，有待于进一步的研究证实。

本研究也获得了一批潜在的菌种资源。如鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、希万氏菌属(Shewanella)、节杆菌属(Arthrobacter)、微球菌属(Micrococcus)等类群的微生物被报道具有广泛的溶藻能力^{[21, 22]}。本研究中也分离到大量这些属的细菌，这些细菌可能具有一定的溶藻活性，有望应用于蓝藻的微生物控制中，值得进一步的研究。另外，16S rRNA序列分析结果表明，Y IM 002、YIM 114、YIM 202这3株菌与已知菌株的相似性均低于97%，可能代表了潜在的新微生物菌种资源，其分类地位有待于进一步的鉴定。

本文首次对滇池两种水葫芦放养区水体细菌进行了分离，并以未放养水葫芦区水体为对照，研究了放养水葫芦对水体可培养细菌群落结构的影响。结果表明，放养水葫芦确实对水体可培养细菌群落结构造成了一定的影响，细菌数量和多样性均有所增加。应该看到，尽管纯培养方法在研究环境微生物中具有不可替代的重要作用^[14]，但由于培养方法的限制，环境中只有0.1%-1.0%的微生物通过常规分离方法能培养，仅占环境中微生物的极小部分，应用传统的纯培养方法研究环境微生物群落结构将导致严重的微生物多样性丢失^[16]。因此，在今后的研究中，有必要应用不依赖纯培养的分子生物学方法如高通量测序技术^[23]、T-RFLP技术^[24]、PLFA分析^[25]对富营养化湖泊放养水葫芦水体生态系统微生物多样性进行研究， 以便更为全面的认识微生物的群落结构，为评价水葫芦在富营养化湖泊生态修复中的安全性提供更为充足的依据。