破囊壶菌(Thraustochytrium)是属于网粘菌门(Labyrinthulomycota)、网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)、破囊壶菌目(Thraustochytriales)、破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的一类类藻的海洋真菌。破囊壶菌广泛分布于海洋、盐水湖和红树林区域，大多数破囊壶菌在藻类及高等植物的残渣上进行腐生，少数寄生在无脊椎动物身上。破囊壶菌的形态、繁殖方式、生态、分离培养等与真菌非常相似，目前观察到的其生活史均为无性繁殖，尚未观察到有性生殖现象。

破囊壶菌细胞中积累了大量油脂，总脂肪酸含量能够达到干重的50%以上，其油脂主要成分为ω-3不饱和脂肪酸—DHA (Docosahexaenoic acid， C22:6)和饱和脂肪酸棕榈酸(C16:0)，其他脂肪酸含量甚微。DHA是细胞膜上磷脂的重要组成成分，对于婴儿大脑和视网膜的发育具有重要作用，对于抵抗疾病也有一定作用，尤其是冠状病^[1]。DHA还能作为前体合成类二十烷酸调节体内炎症反应，促进凝血，维持血压稳定。鱼油中DHA的提取受到季节、鱼类品种等诸多因素的影响，提取成本较高，而海洋真菌破囊壶菌已被证实是理想的DHA生产菌株^[2]。此外，破囊壶菌中棕榈酸可用于生物柴油的生产，解决能源危机，使其也成为了极具潜力的能源微生物^[3]。

本研究从深圳附近海域分离得到6株破囊壶菌，研究了其基本生长特性，并通过18S rRNA基因序列比对对其进行鉴定。此外，本文还研究了破囊壶菌的脂肪酸含量和组成，为后期筛选DHA和生物柴油生产菌株提供依据。

葡萄糖20 g/L，蛋白胨1.5 g/L，酵母提取物 1 g/L，KH₂PO₄ 0.25 g/L，天然本海水过滤后配制。固体培养基添加10 g/L琼脂。

1.2.1 样品采集与分离：从深圳附近海域采集海水和土壤样品，放入灭菌的密封袋中带回实验室，立即进行菌株分离。破囊壶菌的分离采用松花粉垂钓法：在无菌平板中加入2 mL海水样品和3 mL无菌海水，并加入少量松花粉(100 °C烘箱处理48 h)作为诱饵，在室温条件下培养3−7 d。取100 μL转接到新鲜的海水(含有松花粉、0.075%链霉素和0.05%氨苄西林)平板中继续培养。培养1周后，取适量培养液涂布到含有链霉素和氨苄西林的固体培养基中，室温培养1周后，取单克隆涂布到新鲜的固体培养基中，重复纯化2−3次。

1.2.2 菌种鉴定：采用18S rRNA基因测序的方法进行菌种鉴定。总基因组的提取采用Ezup土壤DNA提取试剂盒(Sigma Biotech)。18S rRNA基因的PCR (Polymerase chain reaction)扩增使用的特异性 引物为：18S001 (5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAG TA-3′)，18S13 (5′-CCTTGTTACGACTTCACCTTCC TCT-3′)^[4]。PCR反应采用50 μL反应体系，其中总基因组DNA含量为25 ng，引物含量分别为5 pmol，Taq Mix (Generay) 25 μL。扩增条件：95 °C 5 min；94 °C 1 min，50 °C 1 min，72 °C 1 min，35个循环；72 °C 20 min。PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳后，切胶分离纯化，并连接到pGEM-T载体上，转化到大肠杆菌(Promega)中扩增。挑取阳性克隆送到BGI (深圳)测序，使用的引物为M13通用引物。

使用MEGA 4.0软件将DNA测序结果与NCBI数据库中的序列比对，设置算法自检程序Bootstrap为1 000次，用最大似然法(Likeyhood)运算建树。

1.2.3 破囊壶菌的形态及生活史观察：观察破囊壶菌附着在松花粉周围的情况时，直接取一滴松花粉法培养的破囊壶菌培养液滴在载玻片上，盖上盖玻片，风干后在Olympus BX53显微镜下观察，目镜10×，物镜40×。观察时可先找到独立的松花粉，在松花粉四周可找到破囊壶菌。油镜(100×)下可清晰观察到菌体形态。

定期取不同培养时期的破囊壶菌培养液在显微镜下观察并拍照，观察培养物中单细胞及群体的生长变化及其生活史的一般过程。

1.2.4 生长曲线测定：取生长到对数期的破囊壶菌培养液，在分光光度计上进行波长扫描，绘制吸收光谱曲线，确定最大吸收峰波长。

将6株菌分别接种到20 mL M4液体培养基中，28 °C、160 r/min培养，取生长到对数期(48 h)的破囊壶菌培养液作为种子液，按5%的比例接种到 100 mL新鲜的M4液体培养基中，每个菌株设置 3个平行，置于28 °C、160 r/min摇床中培养。每隔24 h取出1 mL培养液，稀释后测得其在最大波长处的吸光值(OD值)，以OD值对应时间绘制生长 曲线。

1.2.5 尼罗红(Nile Red)荧光染色：尼罗红是一类苯吩哑嗪酮类化合物，能够与脂类物质结合并 在≤570 nm波长的激发光下发出荧光，快速地将类脂类物质与其他储藏物分离开来^[5]。尼罗红是一类脂溶性染料，难溶于水，需要借助丙酮、乙醇等有机溶剂，故尼罗红染色液配制成0.01% (质量体积比)丙酮溶液。

取1 mL不同生长时间的破囊壶菌培养液， 5 000 r/min离心收集菌体，无菌水清洗2次，1 mL体积无菌水重悬。加入100 μL尼罗红染色液于暗处染色20 min，280−300 nm紫外光下观察。

1.2.6 细胞油脂的提取与脂肪酸甲酯的制备：收集50 mL处于平台期的菌体培养液，4 000 r/min离心10 min收集菌体，冷冻干燥后用于油脂提取。菌体油脂的提取与转酯化采用一步法^[6]：称取50−100 mg冷冻干燥后的菌体，加入2 mL 4%硫酸甲醇溶液，振荡混匀20 s，在80 °C水浴1 h。待溶液冷却至室温后，加入水和正己烷各1 mL，混匀后离心，脂肪酸甲酯即溶于上层正己烷中。取上层有机相用于气相色谱分析。

1.2.7 气相色谱分析：使用7890-5975气相色谱仪(安捷伦)，FID检测器，DB-5ms毛细管柱(60 m× 250 μm×0.25 μm)。载气为He，流速3 mL/min，进样量1 μL；进样口温度280 °C，检测器温度290 °C，升温程序：70 °C保持2 min，然后以10 °C/min升温至230 °C，再以3 °C/min升温至290 °C，保持5 min。通过对比标准样品并计算峰面积来确定各组分的含量。

显微镜下可观察到一个松花粉周围附着一至多个破囊壶菌。破囊壶菌的大小一般在2−40 μm之间，菌体形态随着菌体的增殖方式不同而不同。MV培养基上的菌体形态一般为圆形至椭圆形，而在液体培养基通气培养时，可见形态多样的类似变形虫的形态。一般年轻的菌体直径4−5 μm，成熟的菌体直径15−30 μm，在营养丰富的MV培养基中还可达到50 μm。海水中破囊壶菌个体很小，直径约为2−5 μm，在10×100倍镜下，可见其为中间透亮的圆球形，有明显的细胞壁(图 1)。破囊壶菌在MV培养基上的菌落为乳白色，近似圆形，直径约为1−5 mm，表面光滑湿润，边缘不平整(图 2)。

图 1　 附着在松花粉周围的破囊壶菌 Figure 1　 Thraustochytrid attached to pine pollen

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图 2　 固体培养基上破囊壶菌的菌落 Figure 2　 Thraustochytrid strain in solid medium

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破囊壶菌以孢子的形式繁殖，成熟营养体可以直接通过向心分裂的方式产生孢子，成为一个游动孢子囊，为Ⅰ型方式。也可能先经过变形阶段，再向心分裂产生孢子，称为Ⅱ型方式^[7]。变形阶段经历的时间很短，大概1 min。这两种方式都是破囊壶菌比较常见的繁殖方式。在营养条件较丰富的培养基中，破囊壶菌主要以向心分裂为主，而在营养贫乏时会出现短暂的形变阶段，形变阶段一般很短，显微镜下很难捕捉到。

破囊壶菌的孢子为规则的圆形，具有很厚的细胞壁包裹(图 3A)，在条件适宜的环境下可长成为营养体，生长过程中，菌体内部会逐渐出现圆而透亮的类似水滴状圆形结构。经过一段时间的生长，可成为成熟的营养体。营养体细胞为圆形至椭圆形，直径大小约为10−15 μm，边缘平整清晰，较小的营养体内几乎不含颗粒状内含物，长大的过程中颗粒状内含物逐渐增多，细胞壁逐渐变薄，成熟的营养体内充满颗粒物，为规则的圆形。处在成熟期菌体的特征是具有薄而清晰的细胞壁，细胞内部为密密麻麻的颗粒状，内质边缘光滑平整(图 3B)。菌体开始产生孢子的特征是内质的边缘开始有小的凹陷，变得不平整(图 3C，箭头所指处为产生凹陷处)，继而开始快速向心分裂，可见清晰的孢子的轮廓(图 3D)。在孢子释放时，孢子囊裂开一个口子，孢子开始释放，随后细胞壁开始溶解，孢子释放完成(图 3F)。

图 3　 破囊壶菌生活史 Figure 3　 Life cycle of thraustochytrid

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经分子生物学鉴定显示，6株菌主要属于3个属：Aurantiochytrium sp.、Schizochytriumsp.和Thraustochytriumsp.。其中Mn15和Mn35从属于Schizochytrium sp.，Mn11和Sw7从属于Aurantiochytriumsp.，而Mn16和Sw8从属于Thraustochytrium sp.。利用MEGA 4.0软件分析绘制系统进化树(图 4)，可见本实验分离得到的6株菌都属于破囊壶菌，根据其亲缘关系的远近，可将其分为两组，第一组中包括Mn11和Mn16，第二组则包括Mn15、Mn35、Sw7和Sw8。

图 4　 6株破囊壶菌的系统进化树 Figure 4　 Phylogenetic tree of six thraustochytrid strains 注：括号内序号为该物种序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的序列号，分支点上的数字表示该分支的支持率，标尺为该长度所表示的物种序列间核苷酸变化率. Note: Numbers in brackets are serial numbers in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Numbers on branch points are approval ratings of each branch. Scaleplate means changes observed between two sequences.

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使用尼罗红荧光染色的方法对破囊壶菌生长过程中油脂积累情况进行定性检测，所得结果见图 5。接种后第1天，破囊壶菌仍处于对数生长期(图 6)，细胞以分裂生长为主，油脂的积累量较少。尼罗红染色显示荧光较弱，细胞内的油脂粒呈现微弱的黄色荧光，数量较少，细胞壁呈现红色荧光，边缘较厚且清晰可见。第2天开始细胞逐渐进入平台期，细胞开始积累油脂，尼罗红染色可见细胞内油脂粒的数量明显增多，细胞内黄色荧光强度增加，细胞壁的红色荧光减弱。第3天细胞中油脂粒的荧光强度继续增强，至第4天，细胞中的油脂积累量达到最大，整个细胞都呈现亮黄色，细胞内不可见单个的脂肪粒，不可见明显的细胞壁。Morita等^[8]对破囊壶菌不同生长时期细胞内脂肪粒的数量进行研究，发现其在生长的最初4 h内，细胞直径逐渐变大，但是细胞内的脂肪粒数目却逐渐变少甚至消失，随后细胞内才开始重新形成脂肪粒。这可能是由于细胞在最初生长时需要消耗体内储存的脂肪粒作为能量来源，随后才能重新积累脂肪粒。

图 5　 尼罗红荧光染色结果 Figure 5　 Nile Red staining result

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图 6　 6株破囊壶菌在液体培养基中的生长曲线 Figure 6　 Growth curve of six thraustochytrid strains in liquid medium

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破囊壶菌是一类脂肪酸含量较高的微生物，其脂肪酸主要包括饱和脂肪酸(C14:0，C15:0，C16:0，C17:0，C18:0，C20:0)、单不饱和脂肪酸(C16:1，C18:1)和长链多不饱和脂肪酸(C20:4，C20:5，C22:6)(图 7)。其中DHA (C22:6)的含量占总脂肪酸(TFA)的15%到42%不等，与Gupta等^[9]从澳大利亚分离得到的破囊壶菌的DHA含量相当。Sw7是6株菌中DHA含量最高的菌株(42.01% TFA)，其次是Mn35和Mn16，DHA含量分别为39% TFA和37% TFA (图 8)。目前用于商业化生产DHA的Schizochytrium limacinum SR21菌株的DHA含量仅为30% TFA^[10]，而Chang等^[3]分离获得的Aurantiochytrium sp.经优化后DHA含量则达到了57.4% TFA。经摇瓶扩大培养后，Mn16的DHA产量最高，达到1.29 g/L，Sw7次之，为1.26 g/L。Kumon等^[11]从日本濑户内海分离得到的两株高产DHA破囊壶菌(Labyrinthula sp.)经优化后DHA产量仅为0.67 g/L。

图 7　 6株破囊壶菌的脂肪酸分布 Figure 7　 Fatty acid profile of six thraustochytrid strains

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图 8　 6株破囊壶菌的总脂肪酸和DHA占细胞干重的百分比 Figure 8　 TFA and DHA percentages of six thraustochytrid strains

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DHA作为重要的婴儿食品添加剂和成人保健品^[12]，具有很大的市场需求，是一种高附加值的代谢产物。除此之外，破囊壶菌中的单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸还可成为生物柴油的原料。相比于多不饱和脂肪酸，单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的氧化稳定性使得其更适合用来生产生物柴油^[13]。由图 7可见，破囊壶菌中除DHA以外的多不饱和脂肪酸的含量甚微。C20:5与C20:4的含量之和均少于1% TFA，Mn35和Sw8甚至不含有这两种多不饱和脂肪酸(表 1)。棕榈酸(C16:0)是破囊壶菌中最主要的饱和脂肪酸，其占据了总脂肪酸的50%以上，Mn11的棕榈酸含量甚至高达73% TFA，与Gupta等^[9]获得的生物柴油生产菌株相似。

本次实验分离得到的6株破囊壶菌中，Mn11和Mn15具有较高的饱和脂肪酸含量，但Mn11的总脂肪酸含量偏低。Mn15不仅总脂肪酸含量很高，而且饱和脂肪酸的含量也远远高于其他菌株，故Mn15最适合作为生物柴油生产菌株。Mn16和Sw7在总脂肪酸和DHA含量方面均具有较高的优势，适合用于DHA的生产。此外，通过进一步优化培养条件和菌种，如发酵条件优化、添加诱导因子、诱变育种等方法，可改变或调控破囊壶菌的代谢，使其代谢过程向着有利于目的产物积累的方向改变，成为特定的生物柴油或DHA生产菌株。

破囊壶菌作为自养微生物，与异养的藻类相比具有诸多优势。首先，破囊壶菌的生长速度比藻类快很多，在发酵条件下，破囊壶菌48 h即可达到平台期，而藻类的生长周期一般需要一周时间^[14]；其次，破囊壶菌细胞结构与组成比藻类简单，在提取发酵产物时更方便快捷。此外，破囊壶菌还能利用粗甘油^[15]等有机废料作为碳源，节约生产成本。因此，本实验中得到的6株破囊壶菌具有进一步研究利用的价值。