假单胞菌可以通过次级代谢生产多种吩嗪类抗生素^[1]，由于这类抗生素具有环境兼容性好、毒性低等特点，因此大多具有良好的农业应用与研发前景^[2]。在假单胞菌中，一般先合成这些吩嗪衍生物的共同前体吩嗪-1-羧酸(PCA)，这一反应主要由一个较为保守的吩嗪合成基因簇phzABCDEFG负责^{[3, 4]}，之后由修饰基因负责PCA向其他吩嗪衍生物的转化^{[5, 6]}。而吩嗪衍生物的调控机制较为复杂并未被清晰阐述。现已知假单胞菌中主要存在着双元信号转导系统(TCST)，群体感应系统(QS)及小RNA控制的转录后调控系统等^[7]。其中双元调控系统一般由一组同源蛋白组成，包含一个位于细胞膜上的组氨酸激酶(Histidine kinase，HK)感应子和一个位于细胞质中的应答调控子(Response regulator，RR)。当其中的组氨酸激酶感应子被环境中的某种信号激活时，就会作用于应答调控子，应答调控子再通过调控其他基因或蛋白从而对环境变化做出应答^[8]。

绿针假单胞菌GP72是从甜椒根际土壤中分离得到的一株生防假单胞菌，主要生产PCA和2-羟基-吩嗪(2-OH-PHZ)^[9]。通过基因组分析发现GP72中存在着大量的双元调控系统，其中一组即为RpeA/RpeB。本文针对其中的应答调控子RpeB对吩嗪衍生物合成的调控作用展开研究。

根据绿针假单胞菌GP72基因组草图rpeB的基因序列设计引物(见表 1-rpeBF及rpeBR)，以GP72基因组为模板，通过PCR扩增全长的rpeB基因的编码序列。PCR反应体系为：2×GC buffer为25 µL；GP72基因组DNA (10 mg/L)为1.0 µL；dNTP (2.5 mmol/L)为4 µL；引物F1 (10 μmol/L)为1.5 µL；引物R1 (10 μmol/L)为1.5 µL；LA Taq (100 U/µL)为0.5 µL；双蒸水为16.5 µL；反应总体系为50.0 µL。PCR反应条件为：94 °C 30 s；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 50 s (1 min/kb)，30个循环；72 °C 10 min。

质粒抽提、酶反应、DNA片段回收、连接、感受态细胞制备等均参照文献^[14]或相关试剂盒说明书进行，DNA测序委托英骏生物技术有限公司完成。

采用固相滤膜杂交方法^[15]进行细菌结合转移。

OD₆₀₀值的测定及PCA的抽提和HPLC测定方法参照文献^[15]。每种样品设有3个平行样，每隔12 h取样测其OD₆₀₀值和PCA、2-OH-PHZ产量。

RNA提取，反转录cDNA，实时荧光定量PCR均使用TIANGEN公司试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行实验。选用rpoD作为看家基因^[16]，按照GP72基因组相关基因序列设计引物(表 1)，片段大小为150−200 bp。所有荧光RT-PCR 反应均重复3次。

根据绿针假单胞菌GP72基因组草图进行rpeB基因的引物设计，分别为rpeBF和rpeBR，并以基因组为模板扩增rpeB基因片段。通过NCBI基因库BLAST工具对其上下游基因进行比对。结果表明，GP72中rpeA/rpeB双元调控系统在基因组上的位置与其他已公布的假单胞菌序列排列次序一致。其中rpeB位于rpeA上游，双元调控系统上游的两个基因编码RND型外排转运系统，而其下游一个基因则编码烟酰胺酶(图 1)。

图 1　 绿针假单胞菌GP752中rpeB上下游基因图谱 Figure 1　The map of the two component system rpeA/rpeB in Pseudomonas Chlororaphis GP72

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通过NCBI的BLAST比对，GP72中的rpeB基因与Pseudomonas protegens Pf-5及Pseudomonas fluorescens Pf0-1的相似度分别为92%及90%。通过蛋白结构分析，rpeA/rpeB双元调控系统中的RpeA具备一个ATP结合位点及一个磷酸化位点，通过同源性分析可归类为组氨酸激酶(HK)感应子；而RpeB具备一个DNA结合位点及一个磷酸化位点，通过同源性分析可归类为应答调控子。这表明RpeA/RpeB可能具备双元调控系统的基本特性，其中RpeB应该作为应答调控子主要发挥调控作用。

基因突变使用双亲杂交进行抗性片段插入染色体失活，具体方法为：以rpeB1和rpeB2为引物，以GP72基因组DNA为模板，扩增基因组中的相应片段。以km1和km2为引物，扩增卡那霉素抗性基因片段。分别将PCR产物与pMD19T载体相连接，转化大肠杆菌后提取质粒验证，获得质粒pMD19TB和pMD19TK，将这两种质粒分别使用BamH I酶切，经过DNA纯化试剂盒纯化，使用T4连接酶连接，获得质粒pMD19TBK，验证成功后通过EcoR I-Xba I双酶切与pEX18Tc相连接，得到质粒pEX18TcBK。将质粒转化进入SM10，与GP72进行双亲杂交，通过含有15%蔗糖的抗性平板(Tc，Sp)进行第一次筛选，第二次筛选出在含Km、Sp的平板上生长，而在含Tc、Sp平板上不生长的单克隆，即为双交换菌株。通过PCR及测序验证突变结果。PCR结果如图 2所示，测序结果用NCBI的BLAST程序比对分析，结果证明，序列正确，突变株GP72BN构建成功。

图 2　 双亲杂交构建rpeB突变株GP72BN的物理图谱(A)及PCR验证电泳图谱(B) Figure 2　 Physical map of the rpeB gene with inserted Kmr gene cassette (A), confirmation of the rpeB mutant GP72BN by PCR (B) 注：M：DNA marker；1：野生型GP72中rpeB基因的PCR扩增片段；2：质粒pEX18TcBK中rpeB基因之抗性基因插入后的扩增片段；3：突变株GP72BN中rpeB基因之抗性基因插入后的扩增片段. Note: M: DNA marker; 1: PCR product of rpeB of GP72WT; 2: PCR product of the rpeB gene with inserted Kmr gene cassette of plasmid pEX18TcBK; 3: PCR product of the rpeB gene with inserted Kmr gene cassette of GP72BN.

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PCA及2-OH-PHZ均是生防假单胞菌GP72产生的重要吩嗪类抗生素。本研究通过菌株发酵验证了rpeB突变对于菌株生长及两种抗生素合成的影响。分别将野生型菌株GP72与rpeB突变菌株GP72BN在KMB培养基中活化后，28 °C、220 r/min振荡培养，每隔12 h取样，测定细胞密度OD₆₀₀，并利用高效液相色谱(HPLC)测定样品中PCA及2-OH-PHZ的浓度变化。每个样品均是3个平行样。

实验结果如图 3所示。图 3A中，在整个测定周期，rpeB的突变可以使菌体密度增加，生长状况变好。说明RpeB对于绿针假单胞菌GP72的生长存在着一定影响。96 h时PCA及2-OH-PHZ测定结果如图 3B所示，当rpeB突变后，PCA及2-OH-PHZ的产量均有所下降，其中PCA产量下降显著，由230.1 mg/L下降为113.2 mg/L，下降了50.5%。2-OH-PHZ产量由55.0 mg/L下降到37.0 mg/L，下降了32.7%。结果表明，rpeB基因对于PCA及2-OH-PHZ的合成均起正调控作用。

图 3　 假单胞菌GP72和GP72BN菌株细胞生长曲线及吩嗪类抗生素的产量 Figure 3　 Cell growth (OD600) and phenazines production of the wild-type GP72 strain and GP72BN strain in KMB broth

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为了进一步验证GP72BN菌株中抗生素产量的下降是由于rpeB基因突变带来的，因此构建了含有rpeB基因的pMMB207RB重组质粒。将pMMB207空质粒分别电转化进入GP72野生型菌株以及GP72BN突变菌株，pMMB207RB重组质粒电转化进入GP72BN突变菌株，验证成功后进行发酵实验。在菌体OD₆₀₀为0.1时添加IPTG至终浓度为1 mmol/L。发酵结果如图 4所示，结果证明，rpeB基因在rpeB突变株中的回补表达可以在一定程度上回复PCA及2-OH-PHZ的产量，说明rpeB突变株中吩嗪类抗生素产量的下降是由于rpeB基因的突变引起，进一步证实了rpeB正调控PCA及2-OH-PHZ的合成。

图 4　 rpeB基因回补对吩嗪类抗生素产量的影响 Figure 4　 Effect of rpeB complementation on phenazines production

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为了进一步检测RpeB在转录水平对于吩嗪合成相关基因的影响，选取了群体感应系统调控基因phzI/phzR，吩嗪合成基因簇基因phzE以及PCA转化为2-OH-PHZ的修饰基因phzO，进行荧光定量PCR实验。据文献^{[17, 18]}报道，在绿针假单胞菌30−84中，phzI/phzR作为群体感应系统的调控基因，通过phzI产生N-AHL信号分子，信号分子与PhzR结合从而激活phz基因簇的表达。实验结果如图 5所示。

图 5　 rpeB突变对吩嗪类抗生素合成相关基因转录水平的影响 Figure 5　 Effect of rpeB on phenazines biosynthesis gene transcription compared with GP72 wild type

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结果表明，在rpeB突变株中，phzI基因的转录水平仅为野生株的11%，phzR为野生型的33%，phzE为野生型的40%，这3个基因表达均有显著下调。说明rpeB正向调控phzI/phzR以及phz基因簇的表达。而phzO基因表达量下调小于1.5倍，变化并不显著，说明rpeB突变对于phzO基因没有显著影响，2-OH-PHZ的产量下降主要可能是由于其合成前体PCA的产量下降导致，而这一结果也解释了为何2-OH-PHZ的产量下降幅度小于PCA的产量下降幅度。

在绿针假单胞菌GP72中，RpeA/RpeB是一组重要的双元调控系统，其中RpeA为组氨酸激酶(HK)感应子，而RpeB作为应答调控子(RR)，直接对其他基因进行调控。本文通过实验发现，在KMB培养基中，RpeB对吩嗪衍生物PCA及2-OH-PHZ的合成均起到正调控作用。结合荧光定量PCR实验结果及现有报道^{[17, 18]}中phzI/phzR对于吩嗪合成基因簇调控作用的研究，我们推测rpeB可能是通过正向调控群体感应系统的phzI/phzR基因，促进phzI/phzR的表达，增加N-AHL信号分子及PhzR的数量，从而进一步激活phz基因簇的表达，达到对PCA合成的正向调控；而rpeB对于phzO的调控作用并不显著，说明其对2-OH-PHZ的正向调控作用主要是通过对其前体PCA的调控来达到的。

目前为止，因吩嗪衍生物合成调控的复杂机制，RpeB对于吩嗪衍生物合成的详细调节机制还并不完善。研究表明，吩嗪诱导蛋白Pip及σ因子RpoS对群体感应系统均存在调控作用^[19]，因此，在假单胞菌GP72中，RpeB与Pip及RpoS之间是否存在相互作用可以成为进一步研究的目标。此外，之前的研究表明rpeA对于吩嗪合成起负调控作用^[15]，而一般情况下双元调控系统中的双组分起到同样的调控作用，这一现象是如何产生的，也可以作为今后进一步的研究内容。假单胞菌中吩嗪衍生物合成调控网络的进一步完善，将为提高吩嗪类抗生素的产量打下坚实的基础。