PCR技术操作简单、反应迅速，是目前实验室里使用最广泛的核酸扩增方法，具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点^[1-3]。短短十几年，PCR技术就被广泛应用于定点诱变、基因分型、DNA测序、体外诊断、产前诊断、病毒携带者检测，以及DNA多态性研究等医学和生物学的各个方面的研究。目前市场上最常见的PCR反应的催化酶是Taq DNA聚合酶，而聚合酶的效率在PCR反应中是一个非常关键的影响要素，如何获得效率更高、错配更低的聚合酶，就成了发展PCR工艺的重要研究目标。

Taq DNA聚合酶具有以下几个主要的性质^[4-7]：(1) 热稳定性。Taq DNA聚合酶能够耐受高温，并在高温下保持其酶活性，这使得它能够承受PCR反应中高温变性和退火步骤的要求。(2) 5′→3′ DNA聚合酶活性。Taq DNA聚合酶能够在DNA模板上以5′→3′方向合成新的DNA链。(3) 缺乏3′→5′外切酶活性。Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切酶活性，这意味着它不能修复DNA链上的错误碱基。(4) 碱基特异性。Taq DNA聚合酶对于DNA模板上的碱基具有特异性，只在配对的碱基存在时才能进行DNA链的合成。Taq DNA聚合酶除具有DNA聚合酶的活性外，还具有逆转录酶的活性。

大肠杆菌素是含有大肠杆菌素pCOL的大肠杆菌所分泌的一种具有毒性的蛋白质，最初于1925年被Gratia发现，并于1946年命名为大肠杆菌素(colicin)^[8-10]。大肠杆菌素能够破坏被感染的细胞。以维生素BtuB为易位受体的大肠杆菌素被称为E组大肠杆菌素(colicin E, CE)，包括CE1−CE9，其中CE2、CE7、CE8和CE9具有DNase活性。本实验室改造了dCE系列标签^[11-13]，并对其进行了各个方面性质的探索，最终发现dCE蛋白标签是一种能够耐受高温，且具有DNA结合能力的蛋白质，具体表现为：(1) dCE2、dCE7、dCE8和dCE9均具有与线性单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA)、线性双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)、质粒DNA和RNA结合能力；(2) 与质粒DNA结合能力的强弱顺序为dCE9 > dCE8 > dCE7 > dCE2；与线性dsDNA结合能力的强弱顺序为dCE8 > dCE9 > dCE2 > dCE7；(3) 与线性ssDNA结合能力的强弱顺序为dCE9 > dCE7 > dCE2 > dCE8；(4) 与RNA结合能力的强弱顺序为dCE9 > dCE2 > dCE8 > dCE7；(5) 融合dCE7蛋白的Pfu和KOD DNA聚合酶的进行性显著提升。

Taq DNA聚合酶同时具有逆转录活性和催化PCR反应的DNA聚合酶活性，一直以来都是研究的热点，研究人员花了大量的时间和精力对Taq DNA聚合酶进行改造。本研究将Taq和ΔTaq与dCE2、dCE7、dCE8、dCE9融合，找出融合后效率最高的突变体，最终得到PCR活性和逆转录效率都获得提升的优良突变体。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要生化试剂

PCR酶PrimeStar Max、DNA Marker DL 2000和DL 1 kb购自TaKaRa公司；Page Ruler^TM Prestained Protein Ladder、Ribo Lock RNase inhibitor、Purple loading dye和T5 Exonuclease购自Thermo Fisher Scientific；Plasmid Miniprep Kit和Gel Extraction Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；Bradford Protein Concentration Assay Kit购自碧云天公司。

1.1.2 菌株和质粒

本研究使用pET23a载体作为源表达载体，通过将目的基因片段克隆到pET23a载体上，实现对目的基因的高效表达。ΔTaq、dCE2、dCE7、dCE7和dCE7序列数据NMDCX0000232存储在国家微生物科学数据中心(National Data Center for Microbial Sciences, NMDC)，链接为https://nmdc.cn/resource/genomics/attachment/detail/NMDCX0000232。其中单基因采用双酶切(Not I/Sac I)，T4 DNA连接的方式克隆到载体上，融合蛋白则通过搭桥PCR构建，然后同样的用双酶切(Not I/Sac I)，T4 DNA连接的方式克隆到表达载体上。本实验中的大肠杆菌表达菌株为Escherichia coli BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，由本实验室保藏。本实验所用大肠杆菌克隆菌株为E. coli DH5α感受态细胞，由本实验室保藏。本实验所涉及的质粒如表 1所示。

1.2 方法 1.2.1 测试PCR速率

将dCE2-ΔTaq、dCE7-ΔTaq、dCE8-ΔTaq和dCE9-ΔTaq配制dCE-Taq PCR反应体系，反应体系：lambda-FN，0.3 μL (10 μmol/L)；lambda-RN，0.3 μL (10 μmol/L)；Lamda DNA，1 ng；PCR酶PrimeStar Max，1 μL (5 U)；dNTPs，0.1 μL (2.5 mmol/L)；10×reaction buffer，1 μL；ddH₂O，补齐至10 μL。引物序列和扩增产物的大小见表 2。首先将延伸时间设定为20 s，初步测试dCE-ΔTaq的延伸速率。

本次测试采用两步法PCR，反应程序如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性20 s，72 ℃退火加延伸20 s，20个循环；72 ℃延伸5 min；12 ℃保存。反应结束后，取等量PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

将延伸时间延长至1 min，进一步测试dCE-ΔTaq的PCR速率，确定PCR速率最快的突变体，本次测试仍然采用两步法PCR，反应程序除72 ℃退火加延伸1 min外，其他程序同上，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 测试谷氨酸钾浓度和Mg²⁺浓度对延伸速率的影响

向配制好的dCE-Taq PCR反应体系中分别加入终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14、16 mmol/L的谷氨酸钾溶液，混合后进行两步法PCR扩增；向配制好的dCE-Taq PCR反应体系中分别加入终浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mmol/L的MgCl₂，混合后进行PCR扩增。取等量PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 测试温度对逆转录效率的影响

配制dCE-Taq逆转录反应体系：20nt-F (CG AAAACGGCATTATATGAT)，0.3 μL；10×reaction buffer，1 μL；51nt-RNA，1 ng；Taq，1 μL；dNTPs，0.1 μL；DTT，1 μL；RI，1 μL；DEPC Water，补足至10 μL。其中51nt-RNA的序列为CGAA AACGGCAUUAUAUGAUGCUAUUCCGAGAA GGUCAUGGAAGUUGGAC。

将配制好的dCE-Taq逆转录反应体系分别放置在PCR仪中设定了不同温度梯度的槽位中，进行2 min的恒温逆转录反应，PCR温度梯度分别设置为：54、56、59、61、63、66、68、69、70 ℃；然后取等量逆转录产物，加入0.5 μL的RNaseA，37 ℃消化10 min，以去除体系内的RNA模板；最后将体系与2 μL 6×RNA loading混合，进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测。

2 结果与分析 2.1 重组表达载体的构建

委托武汉金开瑞公司进行了ΔTaq的全基因合成，并进一步构建了2种融合重组蛋白的表达载体，见图 1。第一种载体将dCE系列蛋白与ΔTaq的N端(DLPLEVDFAKRR)融合，分别命名为pET23a-dCE2-ΔTaq、pET23a-dCE7-ΔTaq、pET23a-dCE8-ΔTaq和pET23a-dCE9-ΔTaq。第2种载体将dCE系列蛋白与ΔTaq的C端(GIGEDWLSAKE)融合，分别命名为pET23a-ΔTaq-dCE2、pET23a-ΔTaq-dCE7、pET23a-ΔTaq-dCE8和pET23a-ΔTaq-dCE9。经过构建和测序验证，以上载体被成功转化到大肠杆菌BL21菌株中。

2.2 重组蛋白的表达和验证

将BSA浓度梯度与融合了dCE的ΔTaq DNA聚合酶共同进行SDS-PAGE检测，检测结果如图 2所示。

重组Taq DNA聚合酶纯度良好，大于80%，可用于后续的实验。同时结果显示：C端融合dCE标签的重组Taq DNA聚合酶的表达量要明显高于N端融合dCE标签的重组Taq DNA聚合酶，但在初步的蛋白活性测试中，C端融合dCE标签的蛋白的酶活性与野生型蛋白相比无明显提高，因此后续实验中不再研究C端融合dCE标签的重组蛋白。

2.3 融合dCE蛋白质的ΔTaq的PCR速率

将纯化后的dCE2-ΔTaq DNA聚合酶、dCE7-ΔTaq DNA聚合酶、dCE8-ΔTaq DNA聚合酶和dCE9-ΔTaq DNA聚合酶，以lambda DNA为模板，延伸时间为10 s，延伸温度72 ℃，反应21个循环，分别PCR扩增大小为200、500、1 000、2 000、4 000 bp的片段，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 3所示。

由图 3可知，与未融合dCE标签的ΔTaq相比，dCE2-ΔTaq DNA聚合酶、dCE7-ΔTaq DNA聚合酶、dCE8-ΔTaq DNA聚合酶和dCE9-ΔTaq DNA聚合酶的逆转录检测条带中有比ΔTaq更长的扩增产物，说明融合了dCE标签的ΔTaq蛋白具有更快的PCR速率。

为了进一步验证效率提升最高的重组蛋白组合，延长延伸时间至1 min，来观察其延伸长度的极限，如图 4所示。dCE8-ΔTaq展示出了更好的PCR活性，在1 min的延伸时间内，dCE8-ΔTaq延伸出了最大的片段，其大小约为8 kb，因此，认为dCE8-ΔTaq拥有更高的延伸速度。此外，目标产物测序结果显示dCE8-ΔTaq的碱基突变率为7.7×10⁻⁶，与原始的Taq碱基突变率(8.0×10⁻⁶)相近。

2.4 谷氨酸钾浓度对dCE8-ΔTaq的PCR效率的影响

使用lambda DNA作为模板，将谷氨酸钾溶液加入体系内，稀释至0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 mmol/L的终浓度，进行两步法PCR，其中延伸时间为10 s，延伸温度为72 ℃，反应进行21个循环，琼脂糖凝胶电泳结果见图 5。

如图 5所示，谷氨酸钾浓度为0 mmol/L时条带的亮度和产物大小相比谷氨酸钾为2、4、6、8、10、12、14、16、18 mmol/L时的PCR效率并无明显变化，表明体系内谷氨酸钾的浓度对于dCE8-ΔTaq DNA聚合酶的活性没有明显的影响。因此，在后续实验中，未向反应体系中添加谷氨酸钾。

2.5 Mg²⁺浓度对dCE8-ΔTaq的PCR效率的影响

以lambda DNA为模板，在体系内分别加入终浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mmol/L的MgCl₂，进行两步法PCR，延伸时间为10 s，延伸温度为72 ℃，反应21个循环。用琼脂糖凝胶电泳对反应结果进行检测，结果见图 6。

如图 6所示，4−7 mmol/L Mg²⁺的条带亮度最高，7 mmol/L Mg²⁺后的条带逐渐变弱，而1 mmol/L Mg²⁺、2 mmol/L Mg²⁺对应的泳道未观察到目的产物的条带，这说明当体系内Mg²⁺浓度较低时(1 mmol/L和2 mmol/L)，体系内几乎没有PCR产物，而4−7 mmol/L Mg²⁺对应的条带最亮，后续随着体系内的Mg²⁺浓度升高，条带变弱则说明PCR产物的量有所减少，由此可以得出结论：ΔdCE8-Taq的活性并不呈随着Mg²⁺浓度的增加而增加的线性关系，而是Mg²⁺浓度在4−7 mmol/L时酶的活性最好。

因此可以推断：(1) 二价金属离子是反应中不可或缺的成分，缺少二价金属离子不能进行正常的聚合酶催化反应；(2) 反应体系中Mg²⁺的最适浓度约为4−7 mmol/L，Mg²⁺浓度过高或过低都会降低dCE8-ΔTaq的PCR产量。

2.6 dCE8-ΔTaq在逆转录反应中的延伸温度

为了测试dCE8-ΔTaq DNA聚合酶的逆转录活性及最适反应温度，以51 nt RNA为模板，设定引物延伸的温度梯度为54、56、59、61、63、66、68、69、70 ℃，延伸2 min，用核酸PAGE对扩增产物进行检测，观察改造的Taq DNA聚合酶的最适反应温度，所得结果见图 7。

如图 7所示，泳道1−9中均有对应中间产物以及全长产物的明显条带，且全长产物所对应条带的亮度随温度梯度的升高而变高。结果表明改造后的Taq DNA聚合酶在54−70 ℃的区间内均有良好的逆转录活性，并且越接近70 ℃，逆转录活性越好。逆转录产物有2条条带，可能是发生了副反应，产生了额外的中间产物，属于部分逆转录产物。

3 讨论与结论

Taq DNA聚合酶是实验室中常用且应用量较大的工具酶，提高其效率可以提高分子生物学以及生物化学实验的效率。此外，Taq DNA聚合酶由于其本身所具有的聚合酶活性以及逆转录酶活性，在核酸检测中有很大的应用空间^[14-17]。目前，实时PCR是临床环境中最常用的核酸检测工具，已经有研究人员描述了一种被称为MeltArray的方法，它具有多样性、多功能性、简单性和可访问性的综合优点，也许可以在临床环境中广泛应用。因此，此方向的研究对于分子生物学学科的研究以及日常生活中的医疗诊断、法医鉴定等方面均有重要意义，更快速的RT-PCR在核酸检测中的应用将提高核酸检测的效率，减轻医疗保障体系的负担。

本研究通过总结前人研究的结果，找到了新的研究道路，拓宽了研究思路。对Taq DNA聚合酶进行了两个方面的改造。首先，将Taq DNA聚合酶改造为ΔTaq DNA聚合酶。即根据前人已有的研究，将Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶结构域去除，得到了ΔTaq DNA聚合酶。其次，通过融合标签来对ΔTaq DNA聚合酶进行进一步的改造，使其获得更好的酶学活性。将核酸结合蛋白dCE系列标签与ΔTaq DNA聚合酶相融合，利用dCE的核酸结合能力使ΔTaq DNA聚合酶的PCR效率提高，同时使其逆转录酶活性得到了提升，并发现其中效果提升最大的融合蛋白是dCE8-ΔTaq。

本文对Taq DNA聚合酶进行了一系列的改造，提高了Taq DNA聚合酶的PCR效率以及逆转录效率，然而此改造对活性影响的机制尚不明确。后续的研究可以着手于研究点突变改造对Taq DNA聚合酶活性发生影响的机制原理，阐明dCE结合DNA时的构象，其在逆转录或是PCR反应中所扮演的角色，承担何种功能，以及是否可以将这些原理系统化，更高效地对蛋白质进行改造，从而更准确、更高效地提高蛋白质的活性，并将Taq DNA聚合酶改造为更加优良的聚合酶和逆转录活性的工具酶。

本研究虽然对Taq DNA聚合酶进行改造使其获得了更加优良的性能，但仍有许多的拓展方向有待探索，除了提高Taq DNA聚合酶的酶学活性之外，后续对Taq DNA聚合酶仍有许多可行的改造方向，如可以对dCE的点突变位点进行探索，以找到转录速度更快、拥有能延伸更长的DNA链的逆转录活性的新型Taq DNA聚合酶；或是对Taq DNA聚合酶进行改造，使Taq DNA聚合酶的热稳定性进一步提高，以满足在更高温度条件下长时间进行PCR或逆转录工作的需求；也可以向提高抗逆性的方向进行改造，使Taq DNA聚合酶可以适应各种极端的工作环境，如强酸、强碱、毒性(如甲酰胺等)环境，或高浓度的盐离子环境等，使Taq DNA聚合酶可以适应更多的应用环境。