2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 刘欣悦, 耿文超, 孙瑨原, 陈泽华, 崔颖璐, 吴边
- LIU Xinyue, GENG Wenchao, SUN Jinyuan, CHEN Zehua, CUI Yinglu, WU Bian
- 基于结构信息的MHET降解酶挖掘及温和温度下的酶级联塑料降解
- Structure motif guided mining of MHET hydrolase and development of a two-enzyme cascade for plastics depolymerization at mild temperature
- 生物工程学报, 2024, 40(3): 773-785
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(3): 773-785
- 10.13345/j.cjb.230358
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文章历史
- Received: May 12, 2023
- Accepted: July 10, 2023
引用本文
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2. 中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室 中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室, 北京 100101;
3. 南开大学化学学院, 天津 300071;
4. 中国科学院天津工业生物技术研究所 中国科学院系统微生物工程重点实验室, 天津 300308
2. CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3. College of Chemistry, Nankai University, Tianjin 300071, China;
4. CAS Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
合成简单、成本低、耐用性高和/或透明度高的塑料给现代生活带来了极大的便利[1-3]。然而，随之而来的是大量不可降解的塑料废物出现在生态系统中，携带各种有毒化学物质，对生态环境造成持久和深层的伤害[4]。聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)是应用最广泛的聚酯塑料之一，尤其在纺织和包装行业。生态友好型的生物降解是解决PET废料污染的理想处理方法。过去20年的研究已发现，酯酶、脂肪酶和角质酶在较高温度下产生了理想的降解效果，实现了高效生物催化降解PET[5-13]。但它们的实际应用需要大量能源，且不能用于降解难以收集的塑料废物，如污水中的微塑料。因此，开发在温和的温度条件下的PET酶降解具有重要价值。酶水解PET的主要降解产物包括对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)、乙二醇(ethylene glycol, EG)、对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯[mono(2-hydroxyethyl) terephthalate, MHET]和对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯[bis(2-hydroxyethyl) terephthalate, BHET][14-15]。由于PET降解是一个异相催化过程，PET降解酶对可溶性中间产物的亲和力高于不溶性PET。水解过程中释放的降解中间物(BHET和MHET)是PET降解酶的竞争性抑制剂。酶催化过程的动力学分析表明，PET水解酶效率的限速步骤是MHET水解为TPA[16-17]。
2016年，Yoshida等分离出一种新的细菌大阪伊德氏杆菌(Ideonella sakaiensis) 201-F6，能够以PET为主要能源和碳源，在30 ℃下生长[13]。这种细菌利用双酶级联系统将PET解聚为TPA和EG，其中IsPETase将PET裂解为BHET和MHET，而产物MHET被IsMHETase催化水解，生成TPA和EG。IsMHETase可用于降解PET降解过程中产生的MHET，有助于提高PET生物降解应用中的降解效率。然而，尽管生物降解PET的研究已有近20年，IsMHETase是唯一高效催化MHET水解的酶。IsMHETase属于单宁酶家族，水解其他脂肪族或芳香族酯类的活性低于该家族的其他酶，而对MHET表现出高度的底物特异性[13]。虽然已有实验表征IsMHETase，但远未理解MHET降解酶序列、结构和功能之间的关系。目前仅通过多序列比对分析确定了2个活性低很多的MHET降解酶同系物[18]。通过酶挖掘探索，不仅有可能发现更好的MHET降解酶，而且有助于了解IsMHETase的催化机制。由于蛋白质的结构和功能密切相关，结构特征已被广泛引入酶的挖掘中[19-20]。例如，在以前的研究中，通过结合序列和结构分析，报道了一个具有互补底物选择性、完全覆盖了天然l-氨基酸的转氨酶工具箱[21]。
本研究利用生物信息学方法，根据IsMHETase的序列和结构信息，挖掘具有降解MHET潜力的酶。结果发现了一种来自伯克霍尔德菌科细菌(Burkholderiaceae bacterium)的MHET降解酶，即BurkMHETase，其与IsMHETase具有相似的高效MHET降解活性，为这一相对罕见的酶类增加了一个新成员。对BurkMHETase的基础酶学性质进行了表征，并与PET降解酶联用降解PET薄膜，提升了PET降解效果，确定其可以用于构建PET降解双酶系统。此外，对关键残基的结构分析和定点突变，加强了对MHET降解酶催化作用的理解，有助于后续挖掘出更多活跃的MHET降解酶。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌(Escherichia coli) C41和BW25113购自北京天根生化有限公司，挖掘到的基因由安徽通用生物系统有限公司合成。
1.1.2 主要试剂和仪器2×Primer STAR酶购自北京TaKaRa公司；Dpn I酶购自New England Biolabs公司；质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；MHET购自河南阿尔法化工有限公司；PET薄膜购自上海顾特服贸易有限公司。
高通量多功能读板仪，购自上海帝肯贸易有限公司；HisTrap亲和柱及HiPrep 26/10脱盐柱，购自GE公司；超滤浓缩管、C18色谱柱，购自北京绿百草生物科技有限公司；蛋白纯化仪，购自上海永联生物科技有限公司；高效液相色谱仪，购自岛津仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 生物信息学挖掘以IsMHETaase (NCBI登录号：WP_054022745.1)作为模板序列，在Mgnify[22]、nr[23]和UniRef90[24]数据库中搜索，E-value阈值设置为0.001，获取每个数据库中前1 000条最相似的序列。去除冗余序列后，使用Biopython中的序列比较模块，根据限制的氨基酸位点筛选同源序列，选择候选序列进行下一步的表达验证。
1.2.2 重组表达载体构建根据大肠杆菌的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化，其中BurkMHETase基因被克隆到pBAD载体的Nco I和Xho I位点之间，其他序列被插入到pET-21a载体的Nde I和Xho I位点之间，在C端添加上6×His-tag标签，以便于后续镍柱纯化。
1.2.3 同源蛋白表达和纯化将含目的基因的pET-21a载体转化至E. coli C41，涂布在含50 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜。然后将这些菌株培养在250 mL含90 μg/mL氨苄青霉素的2YT液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养。当OD600达到0.6−0.8时，加入终浓度为90 μg/mL的异丙基硫代-β-半乳糖苷诱导，20 ℃培养20 h。BurkMHETase使用E. coli BW25113感受态细胞，用20%的l-阿拉伯糖诱导表达。8 000 r/min、4 ℃离心10 min收集菌体，用15 mL缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬。35%功率超声破碎约15 min后，获得均一、清澈状态的菌液。14 000 r/min、4 ℃离心40 min收集上清，用0.22 μm滤膜过滤。将过滤后的上清转移至HisTrap HP柱中，洗涤缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、45 mmol/L咪唑(pH 8.0)。除去杂蛋白后，增加缓冲液中的咪唑量，洗脱目标蛋白。再将洗脱下的蛋白转移至HiPrep 26/10脱盐柱，使用保存缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, pH 7.5)对其脱盐。用50 kDa的超滤管浓缩洗脱的蛋白后，储存在保存缓冲液中。用SDS-PAGE检测纯化蛋白分子量和纯度，BCA蛋白测定方法检测蛋白浓度。
1.2.4 同源蛋白酶活测定以MHET为底物，利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测TPA的产生来测定同源酶的活性。反应在30 ℃，含45 mmol/L磷酸钠、90 mmol/L氯化钠、10% (体积分数)二甲基亚砜、1 mmol/L MHET、5 nmol/L酶的缓冲液(pH 7.5)中进行[18]，检测2 h内的酶活性。通过向在10 μL反应液中加入20 μL二甲基亚砜来终止反应。使用HPLC在260 nm处定量分析TPA浓度。反应物由30%溶剂A (乙腈)和70%溶剂B (0.1%体积分数甲酸的水溶液)组成的流动相分离，流速为0.8 mL/min，每次10 μL进样。每分钟释放1 μmol TPA的酶量被定义为一个单位(U)的MHET降解酶活性。
1.2.5 pH和温度对BurkMHETase活性的影响配制45 mmol/L柠檬酸钠，pH 4.0−6.0；45 mmol/L磷酸钠，pH 6.0−8.0；45 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0−9.0；45 mmol/L甘氨酸-NaOH，pH 9.0−10.0缓冲液，按照方法1.2.4在30 ℃下测定BurkMHETase的酶活。在最适pH，45 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中反应，温度范围设置为20−55 ℃，按方法1.2.4测定BurkMHETase的酶活。将酶活最高者设定为100%。
1.2.6 金属离子对BurkMHETase活性的影响在含有1 mmol/L MHET和0.5 mmol/L或5 mmol/L金属离子(CoCl2, MgCl2, NiSO4, CaCl2, ZnSO4, FeSO4, CuSO4, MnCl2)的45 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，按方法1.2.4在30 ℃下检测金属离子对BurkMHETase活性的影响。以不加金属离子的对照样品计算相对活性。
1.2.7 BurkMHETase的动力学参数测定在pH 7.5、30 ℃下，以不同浓度(2.5−100 μmol/L)的MHET为底物，BurkMHETase浓度为0.2 nmol/L，按方法1.2.4测定12 min内BurkMHETase的酶活。利用Origin 2022b按Michaelis-Menten方程进行非线性拟合计算动力学参数。
1.2.8 双酶联用降解PET效果测定将直径为8 mm的圆形商业PET薄膜(结晶度为7%)作为底物，加入不同量的IsPETase，在总体积为500 μL的45 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中于30 ℃下反应。通过测量1 h的产物量来确定该条件下的最大IsPETase酶载量。然后，在最大IsPETase酶量下进行双酶联用。将IsPETase: MHET降解酶(BurkMHETase或IsMHETase)按10:1添加量混合后，在30 ℃下反应，按方法1.2.4检测PET薄膜的降解情况。
1.2.9 单点突变构建突变体PCR反应体系：10 μL 2×Primer STAR，0.8 μL质粒DNA，1.5 μL上游和下游引物(表 1)，加ddH2O补充至20 μL。PCR程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共25个循环；72 ℃ 10 min。添加Dpn I在37 ℃下消化模板DNA。将PCR产物转化到E. coli DH5α，由天一辉远公司测序后，获得目标质粒。
| Primers | Sequences (5′→3′) |
| G145R-F | GCGACCGGAAGTATCCGTGGCGGTCAGATCGCC |
| G145R-R | GATACTTCCGGTCGCCGCTGAGAGAGAGCC |
| M192Q-F | CAGGCACGCTTAGACCAGGGCTACAACTCCTAT |
| M192Q-R | GTCTAAGCGTGCCTGGGGATCGAGACCAAA |
| S260A-F | CCGAAGGCCGGAATTGCGGGCGCGTGGACCACC |
| S260A-R | AATTCCGGCCTTCGGCAACTGATATCCCGGT |
| R418S-F | ATCTGGTTTCTCAGCGTCTAGCTGGCTGGTGGA |
| R418S-R | CGCTGAGAAACCAGATACACGTTGTGCGTT |
| D423L-F | CGGAGCTGGCTGGTGCTGTTTGCTACCCCGCCG |
| D423L-R | CACCAGCCAGCTCCGCGCTGAGAAACCAGA |
| R145G-F | GCACTGGGCGATCTGGGTGGTAGTCATGCAAGC |
| R145G-R | CAGATCGCCCAGTGCCGGACTCAGAACGCC |
| Q192M-F | ATCCGCAGGCACGTCTGGATATGGGCTATAATGCATATG |
| Q192M-R | ATCCAGACGTGCCTGCGGATCCATGCCAAAACTCAC |
| A260S-F | CCGAAAGCCGGTATTAGCGGTGGTTGGACCACC |
| A260S-R | AATACCGGCTTTCGGCAGCTGATAACCCGG |
| S418R-F | AATGGCTTTAGCGCCCGCAGTTGGCTGGTGCTG |
| S418R-R | GGCGCTAAAGCCATTCACGCGCTGTGCA |
| L423D-F | AGTAGTTGGCTGGTGGATTTTGCAACCCCGCCGG |
| L423D-R | CACCAGCCAACTACTGGCGCTAAAGCCATT |
根据IsMHETase的晶体结构和突变实验[18, 25-26]，该酶是丝氨酸水解酶，有一个由S225-H528-D492组成的催化三联体。IsMHETase对底物的识别强烈依赖于MHET的苯环和羧基。位于MHET苯环两侧的F415和F495是通过疏水接触结合底物的关键，能够通过π-叠加作用从而稳定MHET的苯环结构[25-26]。R411和S416可以与MHET的羧基形成氢键，所有已报道的R411-S416的IsMHETase双突变体水解活性都很小，推测两者可能在MHET的结合中发挥重要作用[25]。据此，限制IsMHETase的同源物应该具有S225-H528-D492催化三联体，在415位和495位有不带电的芳香族氨基酸F、Y或W，411位有碱性氨基酸R或K，416位有带羟基的氨基酸S或T (图 1)。
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| 图 1 MHET降解酶的挖掘流程图 Fig. 1 Mining of MHET degrading enzymes. |
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基于上述原则筛选到4条序列，分别是来自假食酸菌属(Pseudacidovorax sp.)的序列(NCBI登录号：MBP6895731.1)、硫氧基单胞菌(Comamonas thiooxydans)的序列(NCBI登录号：WP_034389536.1)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga sp. PML113)的序列(NCBI登录号：WP_083293388.1)和Burkholderiaceae bacterium的序列(BurkMHETase, NCBI登录号：MBP8102505.1)，与IsMHETase的序列相似性分别为99%、82%、73%和68%。其中，来自C. thiooxydans和Hydrogenophaga sp. PML113的同源物已被确定具有催化MHET的降解活性[18]。该搜索方法成功地获得了已有表征的活性酶，表明所发现的其他序列具有进一步的研究价值。之后，为了扩大候选序列的多样性，并研究415位和495位对活性的重要性，放宽了同时对415位和495位的芳香族氨基酸的限制，从获得的序列中随机选择了5个序列(表 2)。AlphaFold2预测的结构表明，这些酶都采用了典型的α/β-水解酶的折叠方式，有1个催化中心和1个主要由α-螺旋组成的盖子结构域，与IsMHETase有相似的整体结构和关键位点。
| No. | Accession ID in the NCBI | Organism | Identity to IsMHETase (%) | Restricted site | Enzyme activity at 30 ℃ (U/mg) | |||
| 411 | 415 | 416 | 495 | |||||
| IsMHETase | WP_054022745.1 | Ideonella sakaiensis 201-F6 | 100 | R | F | S | F | 22.7 |
| 1 | MBP6895731.1 | Pseudacidovorax sp. | 99 | R | F | S | F | 20.2 |
| 2 | WP_034389536.1 | Comamonas thiooxydans | 82 | R | F | S | F | 15.0 |
| 3 | WP_083293388.1 | Hydrogenophaga sp. PML113 | 73 | R | F | S | F | 3.3 |
| 4 | MBP8102505.1 | Burkholderiaceae bacterium | 68 | R | F | S | F | 23.3 |
| 5 | WP_213773718.1 | Bradyrhizobium sp. dw_78 | 57 | R | A | S | F | 3.8 |
| 6 | KZY02578.1 | Sulfitobacter sp. HI0023 | 47 | K | L | S | F | 2.2 |
| 7 | GAM06779.1 | Novosphingobium sp. MBES04 | 40 | R | F | S | H | 4.1 |
| 8 | MXY23288.1 | Acidobacteria bacterium | 36 | R | F | S | L | n.r. |
| 9 | WP_106000063.1 | Sphingopyxis lindanitolerans | 34 | R | F | S | I | n.r. |
| n.r.: No reaction (the formation of TPA was below the detection limit of high-performance liquid chromatography analysis). | ||||||||
对候选序列进行重组表达和纯化，以进行后续实验表征。将目标基因片段克隆到pET-21a或pBAD载体中，在C末端融合His6标签，并在E. coli C41或BW25113中表达。使用HisTrap HP柱纯化后得到可溶性蛋白，测定其催化MHET的水解效率。除了来自酸杆菌(Acidobacteria)和耐林丹鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis lindanitolerans)的同源蛋白未表现明显的MHET降解活性外，其余与IsMHETase具有高序列一致性的酶，即来自Pseudacidovorax sp.、C. thiooxydans、Hydrogenophaga sp. PML113、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.) dw_78、亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter sp.) HI0023和新鞘氨醇菌属(Novosphingobium sp.) MBES04的同源蛋白都具有MHET降解活性(2.2−20.2 U/mg) (表 2)。特别是BurkMHETase (分子量62.4 kDa) (图 2A)，表现出与IsMHETase相似的MHET降解活性(23.3 U/mg)，这表明结合序列和结构信息的生物信息学方法可以快速有效地获得具有目标活性的酶，并大大减少了实验工作量。此外，这种基于结构特征的同源物序列搜索可以发现与野生型仅有40%序列一致性的功能序列。因此，该方法可以避免仅根据序列相似性排序筛选序列所造成的对潜在功能序列的忽视。
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| 图 2 BurkMHETase的酶学特性 Fig. 2 Enzymatic properties of BurkMHETase. A: SDS-PAGE analysis of BurkMHETase (62.4 kDa). M: Marker; Lane 1: BurkMHETase. B: Relative enzyme activity of BurkMHETase at different pH at 30 ℃ in citrate buffer (squares; pH 4.0−6.0), phosphate buffer (diamonds; pH 6.0−8.0), Tris-HCl buffer (triangles; pH 7.0−9.0), and glycine-NaOH buffer (circles; pH 9.0−10.0). C: Relative enzyme activity of BurkMHETase in 45 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5) at different temperatures. D: Relative enzyme activity of BurkMHETase in the presence of different metal ions. E: Michaelis-Menten kinetics curve of 0.2 nmol/L BurkMHETase at 30 ℃ and pH 7.5. The standard deviation of the three replicates was shown by error bars. |
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按照酶活测定方法在30 ℃下测定了pH对蛋白质活性的影响。如图 2B所示，在相同pH条件下，磷酸盐缓冲液更适合BurkMHETase对MHET的催化反应。该酶在pH 7.5时显示出最佳活性，在pH为7.0−10.0时活性超过最大活性的80%。与IsMHETase在pH 6.0时仍表现出高活性不同[25]，当pH值低于7.0时，BurkMHETase的活性迅速下降。
在最适pH 7.5下研究了温度对BurkMHETase活性的影响。结果表明(图 2C)，BurkMHETase在30−45 ℃时较稳定，酶的活性能保持在70%以上。BurkMHETase在30 ℃下具有比IsMHETase更高的活性[25]，这有利于它在低温下与中温PET降解酶IsPETase结合。当温度上升至45 ℃以上，酶活迅速下降为最大活性的25%。所以BurkMHETase的最适温度确定为40 ℃。
2.3.2 金属离子对BurkMHETase的影响二价金属离子可能通过与氨基酸残基协调改变蛋白质结构，从而对催化效率产生积极或消极的影响。单宁酶家族中的大多数酶可以被Mg2+激活，而BurkMHETase没有表现出这种现象[27-32]。如图 2D所示，在0.5 mmol/L浓度下，Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Fe2+、Co2+、Cu2+和Zn2+对BurkMHETase的活性影响较小，仅有少量抑制作用，仍保留了86%−96%的活性。而5 mmol/L的Cu2+、Fe2+、Zn2+对BurkMHETase有一定的抑制作用，使其活性分别下降至初始活性的19%、69%、76%。
对于难以收集的大量塑料垃圾，如污水中的微塑料，在室温下进行原位降解是一种更实用、更有前途的处理方法。考虑到环境中二价金属的浓度远低于0.5 mmol/L[33]，上述表征结果表明，BurkMHETase在温和条件下降解环境微塑料方面很有前景。
2.3.3 BurkMHETase的动力学参数因计划将BurkMHETase在温和的条件下与IsPETase联合使用降解PET，所以在30 ℃和pH 7.5条件下，以不同浓度MHET为底物反应，测定了其动力学参数。如图 2E所示，BurkMHETase催化的MHET水解过程符合Michaelis-Menten方程。使用Origin 2023b软件非线性拟合计算出BurkMHETase的Km和kcat值分别为(1.8±0.2) μmol/L和(24.2±0.5) s–1。BurkMHETase具有与IsMHETase相似的催化活性和kcat值，但Km值比已报道的IsMHETase的Km值(7.3 μmol/L)低[13]，这表明BurkMHETase对MHET有着更高的结合亲和力。
2.4 BurkMHETase与IsPETase联用降解PET由于BurkMHETase可以有效地催化MHET的水解，随后研究了BurkMHETase与IsPETase联用降解PET的情况。由于PET的降解是一个非均相反应，PET上的酶可进入的位点是有限的[34]。先使用结晶度为7%的商业PET薄膜，确定反应体系中最大IsPETase酶负荷为35 μg/mL。按照10:1的添加量将IsPETase与IsMHETase或BurkMHETase联合使用。从结果可知(图 3)，MHET降解酶的添加催化了反应中产生的MHET的完全水解。当与IsPETase联用时，BurkMHETase对PET的降解效率显示出与IsMHETase相似的改善效果，可以用于构建双酶PET降解系统。
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| 图 3 双酶联用降解PET Fig. 3 Dual-enzyme degradation of PET. Depolymerization performance of PET in the presence of different enzymes at 30 ℃. The concentrations of IsPETase and MHET-degrading enzyme (BurkMHETase or IsMHETase) were 35 μg/mL and 3.5 μg/mL, respectively. The standard deviation of the three replicates was shown by error bars. |
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通过比较BurkMHETase的AlphaFold2预测结构和IsMHETase的晶体结构(PDB ID: 6JTT)来进行结构分析。除了个别柔性区域外，两者的主链结构几乎完全重合。分析底物结合位点8.0 Å以内的局部结构，BurkMHETase的活性位点与IsMHETase的活性位点高度相似，但在IsMHETase的G145、M192、S260、R418、D423位点处有差异。随后定点突变了BurkMHETase和IsMHETase，把145、192、260、418位和423位的残基分别突变为对方的残基(图 4A)。
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| 图 4 IsMHETase与BurkMHETase的结构分析及突变体活性 Fig. 4 Structural analysis and the activity of mutants of IsMHETase and BurkMHETase. A: Comparison of the active site structures of IsMHETase and BurkMHETase. B: Comparison of the activity of wild-types and mutants of IsMHETase and BurkMHETase. Error bars showed standard deviation of three replicates. |
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IsMHETase的突变体G145R、M192Q、S260A和D423L的活性约下降了10%以上(图 4B)，这表明IsMHETase的145、192、260、423位的原始残基可能对于保持高活性有着重要作用。与IsMHETase类似，5个BurkMHETase的突变体的降解活性也都有所降低。因此，这些位置对MHET水解活性的作用是相互依赖的，只适用于特定的骨架结构，并不单纯由某一特定的氨基酸决定。在IsMHETase和BurkMHETase中，这5个位点处的氨基酸在水解MHET过程中可能会存在协同影响作用或者会与离活性部位更远的氨基酸存在相互作用。
分子动力学模拟研究[35]表明，IsMHETase可以在封闭和开放形式之间发生构象变化。与封闭构象相比，在开放构象中M192的氢键占比明显降低。因此，推测M192Q突变会与T133和N134产生2个新的氢键(图 5A)，这可能限制了局部构象的变化。此外，IsMHETase存在12个在开放和封闭形式的氢键网络调节中起着关键作用的氨基酸位点(S136、S138、T179、P186、D198、F415、A417、D446、P449、W453、Q461和D465)。而值得注意的是，BurkMHETase的这12个氨基酸中，有6个位置与IsMHETase不同(图 5B)，这可能会导致氢键网络的重塑。这部分解释了为什么从IsMHETase转移到BurkMHETase的突变会导致酶活性的降低。
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| 图 5 IsMHETase的192位氨基酸及氢键网络 Fig. 5 The 192-position amino acid and hydrogen bonding network of IsMHETase. A: Carbon atoms in the mutated Q192 were highlighted in pink. Hydrogen bonds shown in yellow dashed lines. B: Cα and side chain atoms of key residues of MHETases in the H-bond network shown as spheres and sticks, respectively. |
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IsMHETase与配体的晶体结构显示，F415表现出两种不同的构象，其中F415和R418之间的阳离子-π相互作用，与F415和配体形成的π-π相互作用竞争。然而，在BurkMHETase中，在这个位置是一个Ser残基而不是Arg残基，这使得F415与配体可以形成更稳定的π-π相互作用，从而降低了BurkMHETase的Km值(图 6A)。此外，来自Novosphingobium sp. MBES04的同源蛋白，在495位拥有Phe到His的突变，仍然表现出明显MHET的水解活性，这可能是由于在495位需要一个能产生共轭作用的基团来稳定反应过程中的电子离域(图 6B)。因此，BurkMHETase的结构功能分析表明，有必要进一步研究其动态变化，才能够全面了解导致这种高特异性的配体-酶相互作用的原因。
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| 图 6 IsMHETase与同源蛋白的局部结构对比 Fig. 6 Comparison of the local structures of IsMHETase and homologous proteins. A: Comparison of the structures of IsMHETase and BurkMHETase. B: Comparison of the structures of IsMHETase and the homologous protein from Novosphingobium sp. MBES04. |
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PET塑料废物的堆积给全球塑料污染治理带来了巨大的挑战。不会造成二次污染、成本低的生物降解作为绿色环保的回收处理方式具有广阔的前景。2016年发现的IsPETase和IsMHETase双酶体系为温和条件下PET微塑料降解带来了新的契机。高效水解MHET的IsMHETase能快速解除MHET对PET水解酶的竞争性抑制作用，但目前确认这是唯一一个特异性MHET降解酶，对其结构功能关系仍需深入了解。本研究利用IsMHETase的序列和结构分析来挖掘MHET降解酶。挖掘出的BurkMHETase在低温下高效催化MHET降解，为相对稀缺的MHET降解酶家族提供了一个成员，并能与IsPETaase联用有效加速PET的降解。
基础酶学表征显示，该酶在pH 7.5、40 ℃下展示出最佳活性，在低温下有着较好的活性。5 mmol/L的Cu2+强烈抑制BurkMHETase的催化活性，但在环境金属离子浓度下基本无影响。此外，MHET的苯环结构与附近氨基酸的π-π相互作用，可能导致BurkMHETase对MHET具有更高的底物亲和力。定点突变实验显示，495位的能产生共轭作用的氨基酸对于MHET水解活性是必需的。MHET结合口袋中的大多数位置是保守的，或强烈依赖于蛋白质中其余位置的氨基酸残基。这加深了对IsMHETase催化作用的结构基础认识，并有助于后续探索MHET降解酶的进化、结构和功能的研究。
BurkMHETase可以有效地催化MHET的水解，因此，Burkholderiaceae bacterium可能含有一种降解PET的酶。这种细菌的基因组值得探索，以确定是否存在新的在低温条件下有活性的PET降解酶。由于MHET水解酶的底物降解是一个非静态的过程，因此，后续应更加注重对该酶的动态分析或协同研究，这可能有助于识别出更多活跃的MHET水解酶。此外，在实验室条件下，BurkMHETase可以通过双酶联用来降解PET。然而，PET大多存在于现实环境中的污水和海水中。因此，可以通过模拟这些水环境进行后续研究，以促进实际应用。
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