2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 沈冠同, 刘亚琦, 吉南希, 张媛媛, 王钦宏
- SHEN Guantong, LIU Yaqi, JI Nanxi, ZHANG Yuanyuan, WANG Qinhong
- 生物发酵法生产L-色氨酸的研究进展
- Advances in fermentative production of L-tryptophan: a review
- 生物工程学报, 2024, 40(3): 621-643
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(3): 621-643
- 10.13345/j.cjb.230404
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文章历史
- Received: June 1, 2023
- Accepted: August 25, 2023
- Published: September 18, 2023
引用本文
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2. 中国科学院天津工业生物技术研究所, 天津 300308;
3. 国家合成生物技术创新中心, 天津 300308
2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300308, China;
3. National Center of Technology Innovation for Synthetic Biology, Tianjin 300308, China
L-色氨酸(L-tryptophan, L-Trp)是20种蛋白质氨基酸中的一种，也是哺乳动物所必需的氨基酸。色氨酸，又名α-氨基-β-吲哚丙酸，是一种在碱性条件下稳定的晶体，于1901年首次被Hopkins发现并分离得到。色氨酸共有3种同分异构体，L-色氨酸、D-色氨酸及两种异构体的消旋混合物DL-色氨酸，而只有L-色氨酸参与人体的代谢功能。L-色氨酸是构成体蛋白的重要组成部分，参与调控蛋白质的合成、脂肪代谢，同时与其他物质，如碳水化合物、维生素和微量元素等的代谢调控也有着非常紧密的关系[1]。因此，L-色氨酸是生物体内重要的代谢产物，在生理和代谢过程中具有至关重要的作用。目前L-色氨酸在医药、食品和饲料等领域被广泛应用。在医药领域，L-色氨酸可以作为药物直接在临床中使用[2]，也可以作为前体用于一些药物的生产，如紫色杆菌素[3]；在食品领域，L-色氨酸可以作为食品添加剂起到补充营养、调味和防腐的作用；在饲料领域，L-色氨酸可以作为添加剂加入到饲料中，以达到提高转化率和生长速度、降低应激性、提高免疫力等目的[4]；在其他方面，根据其性质，L-色氨酸可以应用到化妆品、环境检测和农业等领域[5-7]。截至目前，L-色氨酸的市场需求已经超过了28 000 t/年，且该产品的市场规模仍然在不断扩大。但是，较为落后的生产技术导致L-色氨酸的生产成本高、产量较低，进而限制了其更大规模的应用。因此，如何降低生产成本、提高生产效率，成为近几年该领域的研究重点。
L-色氨酸最早通过酪蛋白水解和分离提取获得，是L-色氨酸工业化生产的最早应用。但是，天然水解法生产L-色氨酸面临着成本高、污染严重和工艺复杂等问题[8-9]，导致无法实现大规模生产，而随后出现的化学合成法解决了部分问题，并取代了蛋白水解法成为L-色氨酸生产的主流工艺。由于化学合成法生产步骤繁琐，且对环境污染较大，也无法完全保证产品的安全性，因此依旧需要更好的方法进行更高效的生产。随着生物技术的发展，酶转化法、微生物转化法和微生物发酵法等实现应用[10-12]。虽然国内已有成熟的酶转化法生产L-色氨酸的相关报道[13]，但酶转化法对原料需求较大，底物L-丝氨酸价格昂贵，几乎与L-色氨酸相当[14]。同时，酶容易在生产过程中失活，不利于大规模生产，而微生物转化法的不足之处在于当转化液中前体物浓度较高时，转化率有所下降。另外，前体物价格比较贵，也不利于降低成本[12]。因此虽然以上两种转化法都已经拥有一定的工业化产业规模，但是无法有效降低生产成本，实现更大规模的应用。相比酶和微生物转化法，通过大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌等构建生产菌株并直接发酵产生L-色氨酸的微生物发酵法具有成本低、工艺环保、细胞密度高和生产效率高[15]等特点，将是未来L-色氨酸工业化生产的首选技术[16]，也是目前该领域的主要研究方向[17]。
1 L-色氨酸的合成代谢与调控由于L-色氨酸在细胞内代谢途径众多，其生物合成途径受到多水平的高度调控，很难在细胞中实现高浓度的积累，通过自然筛选难以得到具有较高产量的天然生产菌株，这也极大地提高了通过代谢改造等获得高产菌株的难度[18]。长期以来，对于高产L-色氨酸菌株的构建一直采用随机诱变和选择的方法，但这种方法产生的遗传背景往往不明确[19]。虽然目前在高效L-色氨酸菌株的构建过程中，已广泛使用了代谢工程、合成生物学等方法，并且已取得了一系列的重要成果，但L-色氨酸发酵生产仍存在菌株生产强度不高、环境耐受性差、生产效率低等突出问题，这导致其生产成本仍旧较高[20-21]。因此，需要深入认识L-色氨酸的合成代谢与调控机制，为构建高效生产菌株奠定基础。
1.1 微生物合成L-色氨酸的代谢途径虽然通过谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌生产L-色氨酸的方法均有报道，但目前依旧以大肠杆菌生产为主。在大肠杆菌中，L-色氨酸的代谢途径如图 1所示，可以分为以下3个部分的代谢途径。
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| 图 1 L-色氨酸合成代谢途径 Fig. 1 L-tryptophan synthetic metabolic pathway. PTS：碳水化合物磷酸转移酶系统；G6P：葡萄糖-6-磷酸；F6P：果糖-6-磷酸；G3P：甘油醛-3-磷酸；PEP：磷酸烯醇丙酮酸；PYR：丙酮酸；Ac-CoA：乙酰辅酶A；CIT：柠檬酸；OAA：草酰乙酸；Xu5P：核糖-5-磷酸-酮糖；E4P：赤藓糖-4-磷酸；Ru5P：核糖-5-磷酸；PPN：磷酸戊糖异构酶；PRE：磷酸核糖异构酶；CHA：分支酸；EPSP：磷酸芳香族氨基酸；S3P：3-磷酸景天庚酮糖；DAHP：3-脱氧-阿拉伯糖-7-磷酸；DHQ：3-脱氢奎尼酸合酶；DHS：3-脱氢莽草酸；SHIK：莽草酸；L-PHE：苯丙氨酸；HPP：对羟基苯丙酮酸；ANTA：醋酸蒽乙酮；L-TRP：色氨酸；L-TYR：酪氨酸；PRANT：磷酸核糖氨基苯甲酸；CDP：胞嘧啶二磷酸；IGP：印戈糖-3-磷酸；Indole：吲哚；L-TRP：色氨酸；PYR：丙酮酸；L-SER：丝氨酸 PTS: Carbohydrate phosphotransferase system; G6P: Glucose-6-phosphate; F6P: Fructose-6-phosphate; G3P: Glyceraldehyde-3-phosphate; PEP: Phosphoenolpyruvate; PYR: Pyruvate; Ac-CoA: AcetyL-CoA; CIT: Citrate; OAA: Oxaloacetate; Xu5P: Ribulose-5-phosphate; E4P: Erythrose-4-phosphate; Ru5P: Ribose-5-phosphate; PPN: Phosphopentose isomerase; PRE: Phosphoribose epimerase; CHA: Chorismic acid; EPSP: 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatej; S3P: Sedoheptulose-3-phosphoserine; DAHP: 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate; DHQ: 3-dehydroquinate; DHS: 3-dehydroshikimate; SHIK: Shikimate; L-PHE: L-phenylalanine; HPP: Hydroxyphenylpyruvate; ANTA: Anorethisterone acetate; L-TRP: L-tryptophan; L-TYR: L-tyrosine; PRANT: 5-phosphoribosylanthranilate; CDP: Cytidine diphosphate; IGP: Indole-3-glycerolphosphate; L-TRP: L-tryptophan; PYR: Pyruvate; L-SER: L-serine. |
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L-色氨酸生物合成需要2个最重要的物质：赤藓糖-4-磷酸(erythrosis-4-phosphate, E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)，二者分别由作为起始物质的葡萄糖通过磷酸戊糖途径(hexose monophosphate pathway, HMP)和糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnas pathway, EMP)形成，随后，E4P和PEP在3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的催化作用下形成3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-d-arabino- heptulosonate-7-phosphate, DAHP)。一般认为，PEP和E4P这两个前体物的供给能力对L-色氨酸的代谢具有决定性作用，其直接决定了进入芳香族氨基酸共同途径(或者也称为莽草酸途径)的物质流量[7]。
1.1.2 芳香族氨基酸共同途径DAHP在共同途径中经过一系列酶催化反应，前后分别形成3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate, DHS)、莽草酸(shikimate, SHIK)和5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate, ESPS)等物质，最终形成分支酸(chorismic acid, CHA)并分别进入L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸分支途径[22]。芳香族氨基酸共同途径使植物和微生物将碳水化合物的代谢与芳香族化合物的生物合成关联，对微生物具有重要意义，也对L-色氨酸生物合成有重要的影响。
1.1.3 L-色氨酸分支途径CHA在分支途径中可以进入L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸分支途径中的一个途径，并经过各自代谢途径生成相应的芳香族氨基酸。在CHA合成L-色氨酸过程中，醋酸厌氧酮(anorethisterone acetate, ANTA)和5-磷酸核糖基邻氨基苯甲酸(5-phosphoribosylanthranilate, PRANT)依次被邻氨基甲酸合成酶-磷酸核糖转移酶复合物分别催化；邻氨基甲酸合成酶由2个亚基组成，大亚基TrpE参与CHA和氨转化为ANTA的过程，小亚基TrpD起到提供氨基和参与PRANT合成的作用；随后，trpC编码的PRANT异构酶将PRANT转化为吲哚-3-甘油磷酸(indole-3-glycerol phosphate, I3GP)，I3GP和L-色氨酸再被由trpA和trpB编码的色氨酸合成酶复合物催化生成甘油醛-3-磷酸和L-色氨酸[23]。
1.2 L-色氨酸合成的代谢调控分析L-色氨酸的相关代谢途径，发现其在细胞内的合成具有代谢途径长、代谢去路多、转运与调控机制复杂的特征。同时胞内L-色氨酸过量积累将打破细胞自身代谢平衡，导致细胞过度表达或抑制某些生物分子，从而对细胞产生毒副作用，最终抑制细胞的生长[23-24]。因此，由于过量的L-色氨酸将对细胞造成的生理毒性，L-色氨酸的大量合成进一步受到限制。
1.2.1 严谨的反馈调节如上文所述，L-色氨酸在细胞内的浓度可以通过影响细胞内酶的活性和转录的方法达到阻碍L-色氨酸进一步在细胞内合成的目的。
首先，DAHP合成酶的活性在胞内L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸浓度过高时受到抑制，反馈调节原理如图 2所示[25]。DAHP合成酶是代谢途径的限速酶，组成该酶的3个同工酶分别由aroG、aroF和aroH基因编码，它们的活性分别受到酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的调控，其中aroG对DAHP合成酶的催化活性最好，在80%左右[26]。相应氨基酸浓度过高将抑制DAHP合成酶的活性，减少进入共同途径的碳流量。此时细胞内后续的共同途径所需的前体物质将减少，最终降低L-色氨酸合成效率。其次，上述氨基酸对芳香族氨基酸共同途径中的一系列酶的活性和相关蛋白的合成都具有明显的调控作用，通过限制共同途径的代谢流量减少了多种氨基酸的过度聚集的可能。最后，单种氨基酸能够在分支途径中对相应酶活性产生反馈抑制，L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸之间的浓度关系将直接影响CHA进入不同分支途径的数量，从而避免了单一氨基酸的过度积累。
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| 图 2 L-色氨酸在细胞内反馈调节原理 Fig. 2 Feedback regulation of L-tryptophan in cells. |
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有报道指出[27-29]，邻氨基苯甲酸合成酶(TrpED)、分支酸异构酶(PheA)和预苯酸脱水酶(TyrA)在分支途径中控制CHA的代谢去向，分别起到催化作用并受到L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的反馈抑制。这些催化酶在氨基酸合成中起到调控作用，限制了大量氨基酸在胞内的大量累积。
另外，有研究指出[30-31]，色氨酸操纵子是大肠杆菌将CHA转化为L-色氨酸的主导调控因子，trpR基因是这个操纵子的上游基因之一，编码trpR阻遏蛋白。在菌体中的L-色氨酸浓度过高时，通过trpR阻遏蛋白的作用，操纵子的转录效率将被降低。同时，色氨酸操纵子的序列中包含了一段衰减子序列，在菌体内的L-色氨酸浓度过高时，这段序列将通过改变二级结构抑制操纵子的转录。
在细胞内L-色氨酸浓度过高时抑制相应酶的转录和活性是菌体对自身的一种保护机制，避免了氨基酸的过度聚集扰乱细胞的代谢平衡，从而保持细胞的代谢活性。但是，这也加大了提高细胞内L-色氨酸积累的难度，通过解除某个单一酶的来自L-色氨酸的反馈抑制作用，无法实现L-色氨酸产量的大量提升。
1.2.2 降解途径众多L-色氨酸在胞内的代谢去路众多，这与其在细胞内的重要功能有关。L-色氨酸在蛋白质内的含量低于1%，但对蛋白质的合成至关重要，因而蛋白质合成是L-色氨酸的主要分解途径之一。此外，L-色氨酸在细胞中的代谢产物对细胞的正常代谢起到重要作用，与细胞增殖等基本功能有直接关系，如合成5-羟色胺及褪黑素、犬尿氨酸-烟酸途径分解代谢途径，都会消耗大量L-色氨酸，使得L-色氨酸的积累困难。
细胞对L-色氨酸合成代谢的另一重要调控途径在于，当细胞内L-色氨酸浓度过高时，色氨酸酶(tnaA基因编码)会起到降解L-色氨酸的作用，使得L-色氨酸在细胞内的积累变得困难。
1.2.3 转运系统限制L-色氨酸往往被细胞高效的吸收系统吸收，同时细胞缺乏高效的L-色氨酸外排系统，使L-色氨酸的胞外积累受到影响。在大肠杆菌中，有3个转运基因可以对L-色氨酸的吸收起到调控作用，分别是mtr、tnaB和aroP基因，其中，mtr和tnaB基因分别编码两种亲和性不同的通透酶，这两种酶对L-色氨酸都具有专一性。由aroP基因编码的转运酶对L-色氨酸没有专一性，它也可以转运L-酪氨酸和L-苯丙氨酸。同时，谷氨酸棒杆菌对L-色氨酸的吸收完全由aroP基因调控。但是目前对L-色氨酸的外排系统的研究仍未能清楚解析其机理，调控方法尚不可知。
2 L-色氨酸生产菌株构建为构建高效生产L-色氨酸的菌株，研究者针对限制L-色氨酸合成的主要因素，采用传统的诱变育种和多种代谢工程策略对菌株进行了系统改造优化，目前已经取得了一系列卓有成效的成果。
2.1 增强前体物质合成上文提到，L-色氨酸在细胞内拥有多步骤且复杂的合成途径，所需要的前体物质众多。然而，这些前体物质在细胞内又广泛参与各种物质的代谢反应。因此，增强细胞内前体物质的合成或限制前体物质在其他代谢途径中的消耗是增强L-色氨酸合成能力的有效方法(图 2)。Li等[32]通过优化前体供应和调节辅助因子平衡的方法将大肠杆菌L-色氨酸生产菌的产量提升了276%；陈立平[33]通过对大肠杆菌L-色氨酸生产菌进行诱变筛选，使L-色氨酸产量达到55.1 g/L；熊博[34]通过对大肠杆菌L-色氨酸工程菌的代谢优化，得到一株40 h内L-色氨酸产量达到约42 g/L、糖酸转化率达到约0.23 g/g的L-色氨酸生产菌。
2.1.1 促进DAHP合成DAHP合成速率的提升是增加进入共同途径的碳流量的关键(图 2)，也是促进L-色氨酸在细胞内过量累积的可行方法。
作为DAHP合成的前体物质，通过促进PEP和E4P的合成可以提升DAHP的合成速率。在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中，磷酸转移酶系统(carbohydrate phosphotransferase system, PTS)起到葡萄糖转运和磷酸化过程的作用，吴晨等[35]和吴涛等[36]通过对PTS系统的改造加强了对葡萄糖的转运，分别将L-丙氨酸的产量提高到59.00 g/L、L-色氨酸的产量提升25.9%。作为重要的中间代谢物，PEP在细胞内的代谢途径众多，流入芳香族氨基酸共同途径的PEP数量较少，故研究人员主要改造工作集中在减少PEP在其他代谢途径的流出，及增加PEP在芳香族氨基酸共同途径的流入。由于细胞内E4P的合成较少，远低于PEP，故提升E4P的合成是改造的重要策略。细胞中PEP合酶(ppsA基因编码)直接作用于PEP的合成，碳贮存调节因子(csrA)则通过抑制ppsA的活性从而降低PEP的合成速率，转酮醇酶(TktA)是合成E4P的关键酶。Xiong等[21]通过重新分配中心碳代谢的方式，提升了大肠杆菌L-色氨酸生产菌的PEP和E4P含量，最终得到发酵40 h时L-色氨酸产量达到41.7 g/L的生产菌株。Tatarko等[37]通过敲除csrA基因和过表达tktA基因的方式，分别使下游的L-Phe的产量提高2倍和1.4倍。Du等[38]通过修改大肠杆菌的中心代谢途径，增强了PEP的浓度，将菌株的L-色氨酸产量提升至约49 g/L。Yakandawala等[39]和路丽君等[40]则分别证明了抑制csrB基因的表达可以分别提升细胞内L-Phe和L-色氨酸的产量。在这一过程中，部分研究忽视了代谢副产物对细胞代谢平衡的影响[41]，这一途径的过度优化带来的后果是否能被细胞控制仍需要考虑。pykA和pykF是丙酮酸激酶的两种同工酶，其中pykF起到了主要作用，其活性远大于pykA[42]。Siddiquee等[43]通过敲除pykF基因降低了大肠杆菌中丙酮酸通向PEP的流量。Li等[44]通过破坏pykA和pykF保存了丙酮酸以生产4-HPA。Liu等[45]通过敲除pykA和pykF基因以增强SA的合成。在合成DAHP的过程中，E4P和PEP的消耗呈固定比例，因为单一物质过多合成将导致代谢副产物的不必要积累。为了解决这一问题，可以调节E4P和PEP的供应比例。Guo等[46]分别用高表达启动子表达aroG和tktA，用中等表达启动子表达ppsA，最终使得改造菌株色氨酸产量提高16.4%，也证明了调节前体物的供应是提高L-色氨酸产量的重要方式。
DAHP合成酶的3个同工酶活性分别受到相应氨基酸的抑制，Hagino等[47]发现当L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸同时存在时，其对DAHP合成酶的抑制作用可以达到接近90%，高于任何一种氨基酸单独存在的情况。因此，解除或部分解除氨基酸对DAHP合成酶的抑制是提高L-色氨酸产量的重要途径。郝大利等[48]通过对aroG基因进行定点突变，降低了苯丙氨酸对aroG的抑制作用，得到一株色氨酸产量提升1.4倍的大肠杆菌。李晓萍等[49]通过DNA改组(DNA shuffling)构建了一株部分解除苯丙氨酸反馈抑制的aroG的大肠杆菌。李明明[50]通过定点突变aroG基因并过量表达ppsA和tktA基因的方式将莽草酸浓度提升6.22倍。
2.1.2 强化共同途径中的酶活性在共同途径中，SHIK、EPSP及CHA等物质都是重要中间代谢物之一(图 2)。虽然已经有通过提升PEP和E4P产量的方式提高共同途径效率的案例[50]，但共同途径中一系列酶的活性受限仍然是阻碍其合成效率的重要因素。部分研究通过加强相关基因的表达增加了下游物质的累积，而也有部分研究通过减弱部分基因的表达减少了相关物质沿莽草酸途径的代谢，也从反面证明了这些基因的表达蛋白在共同途径中起到重要作用。Vitayakritsirikul等[51]通过过表达委内瑞拉链霉菌的aroB和aroK基因，提升了CHA的产量，最终实现了氯霉素产量的提高；Liu等[52]通过过表达aroA和aroD基因使SA的产量达到原菌株的两倍，其中aroD对SA产量的提升效果最为明显；马延和等[53]通过减弱aroE基因表达，实现了对DHS的代谢抑制；聂立斌等[54]敲除了谷氨酸棒杆菌的aroK基因，阻止SHIK形成S3P，实现莽草酸的积累；Pan等[55]通过过表达ydiB、aroK和yjgB (编码醛还原酶)基因，实现了L-苯丙氨酸的过量生产；Schoenenberger等[56]对aroL基因重组，提高了S3P的合成效率；汪莉等[57]通过敲除大肠杆菌的aroL和aroK基因，为细胞直接发酵生产SHIK奠定了基础；Fujiwara等[58]通过过表达AroC和AroD基因增加了莽草酸途径的碳流量，使得下游产物粘康酸产量提升。
2.2 增强L-色氨酸分支途径在共同代谢途径后，L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸代谢途径都可以作为CHA的代谢途径。因此，要提高L-色氨酸的产量，需要通过代谢调控的方法使尽可能多的CHA流向L-色氨酸代谢途径。
2.2.1 阻断L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的代谢途径上文提到，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的合成途径分别受到pheA基因和tyrA基因的限制，而这两种酶的活性又分别被L-苯丙氨酸和L-酪氨酸反馈抑制。因此，阻断L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的代谢途径不仅可以使更多的CHA流向L-色氨酸途径，同时也可以减少这两种氨基酸在共同途径和中心代谢途径中的反馈抑制，而弱化pheA基因和tyrA基因的表达或降低这两种酶的活性是阻断L-苯丙氨酸和L-酪氨酸代谢途径的主要方法。有文章报道[59]通过向谷氨酸棒杆菌的tyrA基因座中插入aroG-pheA基因，从而降低酪氨酸产量，提高L-苯丙氨酸的产量；Tanemura等[27]通过将鼠伤寒沙门氏菌的pheA和tyrA基因突变，减少了其trpD基因突变带来的影响，增加了L-色氨酸的产量；王钦[60]通过敲除大肠杆菌的pheA基因，将该工程菌的L-酪氨酸的产量由3.12 g/L提高到4.42 g/L；Xu等[61]证明了在缺少pheA基因的情况下L-酪氨酸的产量可以得到显著提升；蒋婕[62]通过敲除大肠杆菌的pheA和tyrA基因，显著提高了trpD和trpE基因的表达量。但是，上述部分报道也发现由于代谢途径的阻断，生产菌成为营养缺陷型菌株或细胞无法正常生长，因此，在减少这些分支代谢途径时，应尽量保证维持细胞生理活性的正常代谢不受干扰。
2.2.2 疏通L-色氨酸分支代谢途径除了去除以上两个分支代谢途径，也有研究通过增强L-色氨酸代谢途径的方式增加L-色氨酸的产量，主要的增强途径包括相应合成酶的反馈抑制解除和过表达。Zhao等[6]通过解除trpED和aroF的反馈抑制并敲除pheA和tyrA等基因，将L-色氨酸的产量提升至13.3 g/L；郝大利等[48]将aroG基因与trpBA基因串联实现过表达，使大肠杆菌的L-色氨酸产量提高823%；Chen等[63]通过设计分析，发现提升L-谷氨酰胺细胞内的浓度有利于在一定程度上有效解除L-色氨酸的生物合成限制。另外，为了防止细胞中的L-色氨酸被合成为吲哚，应当降低tnaA基因的表达以减少色氨酸酶(TNase)的产生。Ding等[19]分析了大肠杆菌色氨酸生产菌的遗传特征，发现tnaA的缺失是最主要影响因素之一。在胞内L-色氨酸浓度过高时，色氨酸操纵子通过降低相应基因的转录和酶的活性减少CHA流入色氨酸途径，trpR是色氨酸操纵子中的关键基因之一。因此，敲除该基因有利于L-色氨酸在细胞内的进一步积累。李剑欣等[28]向trpR和tnaA双基因缺失的大肠杆菌中加入抗反馈抑制的aroG及trpED基因，最终L-色氨酸含量为0.168 g/L；Aiba等[64]以trpR/tnaA双基因缺失的大肠杆菌为模板构建L-色氨酸生产菌株，产量达30 g/L。
2.3 改造转运系统胞内L-色氨酸浓度过高时，会扰乱细胞代谢平衡，对细胞产生生理毒性。因此，降低L-色氨酸在细胞内的含量是提升L-色氨酸产量的关键因素之一。但是，由于目前对L-色氨酸的分泌机理仍不清楚，因此对转运系统的修饰主要集中在吸收途径的阻断。
马温华等[65]敲除了北京棒杆菌的aroP基因，将L-色氨酸的积累量提高了65%；Liu等[66]破坏了aroP基因，将大肠杆菌的L-色氨酸产量提高了13.3%；陈巧红[67]构建了trpR/tnaB双基因敲除菌并优化培养基，将L-色氨酸产量提高到145.3%；古鹏飞[68]通过构建AroP/TnaB双敲除菌株将L-色氨酸的产量提升至2.44 g/L，但mtr/AroP双基因敲除菌和mtr/tnaB双基因敲除菌的L-色氨酸产量下降明显；李晶等[69]通过敲除mtr基因，将工程菌的L-色氨酸产量提高到35.87 g/L，是出发菌株的132%；赵志军等[70]通过敲除mtr. tnaB和mtr. aroP基因，L-色氨酸产量较出发菌株分别提高17%和9%，但将mtr、tnaB、aroP这3个基因全部敲除后，菌体正常调控受到破坏，L-色氨酸产量急剧下降。
以上研究表明，虽然弱化L-色氨酸的转运酶调控基因的表达有利于部分解除反馈抑制，但过度的转运功能确实会导致细菌难以正常生长，其基本生理功能被破坏，反而导致L-色氨酸产量下降。因此，通过建立一定的模型确定相应基因敲除或弱化的方式，可以进一步提高L-色氨酸的产量。
yddG基因编码的分泌蛋白是一种内膜蛋白(inner membrane proteins, IMP)，是目前少数已知的大肠杆菌中可以分泌芳香族氨基酸的蛋白之一，yddG基因的过表达有利于提升L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸的产量[71-72]。Liu等[73]通过过表达yddG基因，将培养基中L-苯丙氨酸浓度增加，提高了L-苯丙氨酸的产量；Wang等[74]通过敲除大肠杆菌pta-mtr基因并过表达yddG基因，使L-色氨酸的产量较出发菌株提高了48.68%；Liu等[75]通过基于tddG和aroP基因的修饰，使L-色氨酸生物合成途径的代谢通量重新分布，其L-色氨酸产量达到了36.3 g/L。
以上增强前体物质合成等三种改造策略主要集中在大肠杆菌等细菌中，改造策略主要汇总见表 1。
| Starting strain | Engineering strategy | Titer | Reference |
| E. coli KW001 (Tetr, PH5a1) | BSglnA replaces the original gene glnA, : : icD-: : gdhA with J23119 promoter, : : prs with trc promoter, serAmut, serAmut-thrAmut, : : sthA-pntAB with J23119 promoter, pXlltS | 1.71 g/L (shake flask) |
[31] |
| E. coli DJ-4322 (amino acid breeding room of Dacheng Biochemical Group) | UV mutagenesis | 55.1 g/L | [32] |
| E. coli MG1655 (Lab stock) | ∆tnaAB, tyrR : : Ptrc-aroGS180F-serAH344A, N364A, trpE : : Ptrc-trpES40F, yjiV : : Ptrc-trpBA, yncI : : Ptrc-trpES40F, yeeP : : PJ23106-ywkB, yghX : : Ptrc-xfpk (Bifidobacterium adolescentis), ptsG : : PM1-12-glf (Zymomonas mobilis), ycjV : : PM1-12-glk, ∆pykF, ylbE : : Ppck-pck, mbhA : : Ptrc-pycP458S (Corynebacterium glutamicum) |
41.7 g/L | [33] |
| E. coli SA01 (CGMCC) | ptsHIcrr–, pMG43 Ptac-glf-glk | 38.5 g/L | [35] |
| E. coli W3110 (Lab stock) | ΔlacI, ΔtnaA, Δmtr, Ptrc-trpE* : : trpLE, Ptrc-aroG* : : tyrR, ΔpykA, Δppc, Ppck-pck : : ycjV, PcitT-citT : : poxB, Plac-acnBA-icD : : yghx, Plac-pyc : : yjiV |
49 g/L | [37] |
| E. coli W3110 overexpressed aroGfbr, trpEDCBA | ΔtrpR, Δattenuator, ΔpykF, ΔptsH, M1-37 : : galP, M1-93 : : glk, inhibit pta |
39.7 g/L | [40] |
| E. coli JM109 | pEtac-aroGfbr-tac-trpBA | 19.5 mg/L (shake flask) |
[46] |
| E.coli WSH-Z06 (pAP-B03) | pAP-B03–, ΔpheA/tyrR, pAP-aroGfbr-tyrAfbr | 55.54 g/L | [58] |
| E. coli W3110 (Lab stock) | ΔlacU169 gal490λCI857 Δ(cro-bioA), rpsL (StrR), ΔaroF, ΔaroG, Δmtr, ΔtnaA, ΔtnaB, Δλa, ΔaroH : : PJ23119-rpsL-tac-(aroGS180F-serAH344A/N364A), Ptrc-trpES40FDCBA | 40.3 g / L | [62] |
| E. coli FEC-01 | ∆trpR, ΔtnaB | 38.0 g/L | [65] |
| E. coli W3110 (Lab stock) | ∆trpR : : FRT, ∆tnaA : : FRT, ∆ptsG : : FRT, ∆trpL : : 5CPtacs, pTAT, pMCAB | 14.4 g/L | [66] |
| E. coli W3110 (Lab stock) | ∆mtr, pTrp-01, pACYC177-Ptac-yddG | 41.01 g/L | [67] |
| E. coli W3110 (Lab stock) | ∆trpR, ∆tnaA, ∆mtr, ∆tnaB | 12.2 g/L | [68] |
| Para (ΔtrpR, ΔtnaA/pSV-709/pMEL03) | Δpta, Δmtr, overexpress yddG | 48.68 g/L | [72] |
| E. coli TRTH (TUST Industrial Culture Collection Center) | yddG+CmR | 36.3 g/L | [73] |
截至目前，色氨酸工程菌株所受到的合成支路反馈抑制、色氨酸分解以及转运问题已经在一定程度上得到解决[76-77]，目前限制直接发酵法生产L-色氨酸的生产水平的一个重要因素是L-色氨酸在胞内过量积累会对细胞产生生理毒性，因此提高菌株对高浓度L-色氨酸的耐受性对L-色氨酸的发酵生产具有重大意义。由于缺少高效转运蛋白，通过加速胞内L-色氨酸的外排从而减少胞内L-色氨酸的毒理作用的方法受到限制。而且高浓度L-色氨酸对菌株产生生理毒性的机制及其耐受机理未知，无法通过理性改造的方法提高菌株对高浓度L-色氨酸的耐受能力。适应进化(adaptive evolution)被广泛应用于提高菌株对产物的耐受性，并且通过比较基因组学等方法还可解析所得菌株的耐受机制，从而为菌株理性改造提供新策略和新靶点。以丝氨酸为例，Mundhada等[24]对菌株进行适应性进化，使菌株对丝氨酸的耐受性由3 g/L提高到100 g/L，丝氨酸积累量为37 g/L，较出发菌株提高了3倍，对进化菌株进行全基因组测序发现thrA基因突变对减缓丝氨酸的细胞毒性有重要的作用。
2.4.1 传统适应进化适应进化是结合人工选择压力和模拟自然进化中的编译和选择过程，在实验室条件下实现微生物的定向进化，达到从进化群体中筛选优良性状个体的方法(图 3)。
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| 图 3 L-色氨酸生产相关前体物质合成的重要基因 Fig. 3 Key genes involved in the synthesis of precursor for L-tryptophan production. |
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适应进化在微生物进化研究领域作为一种强有力的手段，为研究影响工业生产菌株的部分因素(如表型、生产性能以及遗传稳定性等)作出了巨大贡献。相较于代谢工程需要明晰菌体复杂的代谢网络，适应进化只需设计实验目标对应的干扰因素，具有广泛的微生物适用性和极强的实用性，在发现新机制、实现表型优化发挥着重要作用，在筛选特定表型、生产性能和遗传稳定性的工业生产菌株等实验中被广泛采用，成为了微生物学研究的强大工具。适应进化根据使用需求不同，其主要应用可以分为以下4个方面：(1) 微生物代谢途径激活；(2) 微生物特定表型优化；(3) 特定底物的高效利用；(4) 毒性产物的耐受性优化[78]。
但是在一定条件下，适应进化方法并不能得到有效发挥，比如适应进化在提高目标产物的生产时，会由于缺乏合适的筛选方法而难以实现[79]；另外，在适应性进化的过程中，尤其是当利用适应进化的方法提高菌株对目标产物的耐受性时，菌株合成目标产物的能力常常会部分或全部丢失[24]。细胞对目标产物的耐受机制是促使细胞降低产物合成，这可以作为造成这种现象的一种解释。为解决类似问题，有学者[79]设计建立菌株生长和代谢物合成相偶联的算法，经过in silico预测后进行适应性进化实验，产率都得到了有效提高。还有研究将生物传感器和生长耦合并通过空间分离的方法改进进化策略，通过适应进化的方法提高目标产物的积累[78]。
为了得到具有高L-色氨酸耐受性的生产菌株，同时保证菌株的L-色氨酸产量性状不发生丢失，可以选择采用高L-色氨酸压力筛选-发酵测定得到产量性状保持菌株-更高L-色氨酸压力的进化方式完成对L-色氨酸生产菌株的进化和筛选，得到相应的高产菌(图 4)。同时可以通过测定进化菌的基因改变情况，解析其高产机理，最终回归理性的代谢改造得到更高产量的L-色氨酸生产菌株。
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| 图 4 适应进化L-色氨酸生产菌的实验流程示意 Fig. 4 Schematic diagram of adaptive evolution of L-tryptophan producing strains. |
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适应进化虽然可以在一定程度上解决色氨酸生产菌株产量性状丢失和耐受难以提高的问题，但目前仍面临随机性较强、工作量过大的困难。因此，要快速通过实验室适应进化提升菌株对L-色氨酸的耐受能力，本质上在于寻找一种高效筛选的方法，以减少通过常规发酵验证产量所需要的时间，从而大大减少得到具有目标形状菌株的时间。由于色氨酸是细胞代谢过程中的必需氨基酸，因此一些常用的筛选方法能起到一定作用，例如通过划线分离的方法寻找生长速度较快的菌株，避免分离得到营养缺陷型或渗漏缺陷型的菌株，从而得到具有正常产量性状的菌株。但是，由于色氨酸生产菌中色氨酸的累积量本身就存在过量的现象，且对细胞生长产生一定的毒性作用，同时除色氨酸外影响细胞生长速率的因素众多，难以排除其他因素的干扰，因此有可能对筛选产生明显的干扰作用。由此，得到一种可以直接耦连细胞特定性状和色氨酸产量性状的方法十分必要。
生物传感器是合成生物学中广泛应用的元件，其可以通过感受相应物质的浓度大小从而调整下游基因的表达方式[80]。通过将合成生物学元件与适应进化相结合，有利于细胞根据胞内色氨酸浓度的差异而表达不同强度的特定性状，从而为高效筛选提供条件。例如，张大伟等[81]以tanC基因作为胞内色氨酸浓度的传感器，将荧光蛋白基因和生物传感器进行结合，使得荧光蛋白基因的表达与细胞的色氨酸产量关联。根据实验现象，L-色氨酸在细胞内累积程度的提升将促进tanC基因的表达，从而促进绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的形成，最终导致荧光蛋白GFP在细胞内浓度的增加，从而作为筛选条件之一。为了快速完成后续的筛选工作，确定可能具有产量性状提升的L-色氨酸生产菌株，实验采用了流式筛选的高通量筛选方法，并以荧光值作为筛选条件进行筛选。最终，得到了一株L-色氨酸生产菌，相较于出发菌株，其L-色氨酸产量提升了约500%。总言之，上述实验的总体流程为：向出发菌株加入生物传感器和荧光蛋白基因的组合质粒后经过诱变育种，随机进行单细胞分离并根据菌液的荧光强度初步筛选可能具有高产性状的菌株，并进行进一步发酵验证。该实验以一株经过改造的色氨酸生产菌作为出发菌，同样经过常温等离子体(atmospheric room temperature plasma, ARTP)诱变这种非理性的诱变方法，证明了将生物传感器作为筛选的辅助工具，表达特定生物性状，有利于生产菌株在非理性改造后的筛选。
除了荧光蛋白外，也可以使用菌落颜色等因素作为特定性状进行筛选。此类方法可以大大减少科研人员的工作量，并达到高效筛选的目的。但是，由于筛选过程仍需细胞的分离和纯化，同时快速筛选需要使用高通量筛选设备，因此虽然可以提升筛选速率，但仍较为烦琐。为简化筛选流程并得到具有相关产量性状的菌株，本实验室将目光聚集于菌株产量性状与生长性状的直接耦连。目前本实验室提出通过将生物传感器和抗生素基因结合的方法，即在细胞内色氨酸浓度提高的同时，细胞相应抗生素抗性也得到明显提高，即在适应性进化后，以特定抗生素作为选择性培养基的关键成分，以细胞能否正常生长作为筛选依据和结果，以此达到筛选目标性状菌株的目的。该实验方案解决了初步筛选过程中遇到的工作量过大的问题，同时将液体培养基中培养的菌液直接加入另一液体培养基中，在大大提高了筛选效率的同时，使后续的菌株富集与筛选在同一步骤中完成。通过此实验方案，有望建立一套针对生产菌株产量性状的更高效筛选方法，同时实现菌株耐受性的提升和产量性状的稳定，希望在未来能取得一定效果。
3 色氨酸衍生代谢物生物合成进展以L-色氨酸为底物，在不同酶的催化作用下可生成多种具有特殊功能的色氨酸衍生物，如生长素、5-羟色胺、靛红和靛蓝等(图 5)，这些衍生物对人体健康都具有重要作用，它们的产业化生产和应用具有极高的经济价值和社会效益。在较长的一段时间内，由于前体L-色氨酸在胞内难以累积，此类物质难以通过微生物大量合成，因此通过微生物发酵法进行工业生产受到限制。但是，经过上述对L-色氨酸生产菌的改造，大肠杆菌在细胞内累积L-色氨酸的问题已经得到部分解决，从而为通过大肠杆菌发酵生产L-色氨酸奠定基础，而如何进一步提高L-色氨酸衍生物产量是未来应关注的重点。
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| 图 5 部分L-色氨酸衍生物的结构式 Fig. 5 Part of the structural formulas of L-tryptophan derivatives. L-色氨酸、吲哚、靛红、靛蓝、生长素、5-羟色胺、褪黑素 L-tryptophan, indole indole, indatin indirubin, indigo indigo, auxin, 5-hydroxytryptamine, melatonin. |
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色氨酸经色氨酸5-羟化酶(tryptophan 5-hydroxylase, TPH)催化生成5-羟色氨酸，再经色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase, TDC)催化生成5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)，5-HT又名血清素，它在动物中可作为神经递质，具有抗氧化、抗炎和抗动脉粥样硬化功能，药用价值非常丰富。Park等[82]通过在大肠杆菌中异源表达TDC和色胺5-羟化酶(T-5H)这两个关键生物合成酶，制备了5-HT，结果表明，该菌株可生产24 mg/L的5-HT。TyrR由tyrR基因编码，可以抑制芳香族氨基酸共同代谢途径的合成效率。N-肉桂酰血清素则是血清素的一种衍生物，Lee等[83]通过在敲除了tyrR基因的生产菌中过表达T-5H，使得其合成血清素而不进一步合成N-肉桂酰血清素。这些研究都为以L-色氨酸为前体合成5-HT提供了借鉴和参考。
3.2 靛红和靛蓝生物合成进展吲哚是细胞内L-色氨酸的主要代谢途径之一，因此在L-色氨酸生产菌中，常常减弱tnaA的表达或敲除该基因，以减少吲哚在细胞内的合成，促进L-色氨酸在细胞内的累积。靛蓝和靛红都是吲哚的重要衍生物之一，具有广泛的应用。
人类利用靛蓝已经具有悠久的历史，产靛蓝的植物在传统医学中发挥重要作用，同时靛蓝本身也能作为一类天然的染料，对服饰、器物等进行染色[84]。但靛蓝的生产工艺从最早的天然提取到以化学合成为主，虽然解决了成本较高、杂质难以去除的问题，但由于部分危险化学物质残留，导致产品的安全性无法保证[85]。靛红作为另一种吲哚衍生物，不仅在抗艾滋病、抗细菌等方面有重要活性，也与其他吲哚衍生物的合成有重要关系。
色氨酸是吲哚的前体物质，因此吲哚衍生物的合成在含有较高浓度的L-色氨酸时具有更高的效率。Gui等[86]构建了一株含有fmo基因的大肠杆菌生产菌，该生产菌株能在含有2 g/L色氨酸的培养基中产生223.6 mg/L的靛蓝，同时在加入0.36 g/L的半胱氨酸时，细胞的靛红产量大大提升。Du等[87]通过增加fmo基因和tnaA基因的产物浓度，完成了靛红的合成，随即通过敲除trpR基因、过表达tktA基因等方法，使细胞通过葡萄糖发酵生产靛蓝素的产量达到0.056 g/L。
3.3 褪黑素生物合成进展褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)在生物体中分布广泛，同时具有促进人体睡眠、抗衰老等功能，受到越来越广泛的关注[88]。褪黑素在生物体内合成途径众多，但作为吲哚杂环类小分子，其合成途径都以L-色氨酸为前体，同时每条合成褪黑素的途径都会经过5-羟色胺这一中间代谢产物，因此5-羟色胺的浓度将直接影响褪黑素的合成效率[89]。Luo等[90]通过向大肠杆菌中导入异源芳香氨基酸脱羧酶基因ddc，并定向进化编码色氨酸羟化酶的基因trpH，得到的生产菌株褪黑素产量达到2 g/L，同时，通过敲除yddG基因并外部补充L-色氨酸的实验，证明了L-色氨酸浓度的增加对褪黑素的高效合成具有重要作用。
4 L-色氨酸发酵生产优化通过代谢工程的方法对L-色氨酸生产菌进行理性代谢改造或通过实验室适应进化等方法进行非理性改造，这些都是基于细胞代谢途径的角度，除此之外，优化培养基或培养条件、优化提取工艺等方法也被广泛使用以增加L-色氨酸的产量(表 2)。
| Reporters | Modalities for improvement | Results | References |
| ZHU Xiaowen et al. |
Optimization of the culture medium used for fermentative production of L-tryptophan by Escherichia coli and optimization of the feeding mode | L-tryptophan yield reached 24 g/L, an approximately 35% increase | [91] |
| ZHANG Zhen | Optimization of the fermentation inoculum size and the amount of potassium dihydrogen phosphate added, and use of mixed fermentation process | Accumulation of by-products decreased, and L-tryptophan yield increased by approximately 31.2%. | [92] |
| SU Jianmin | Optimization of the extraction process and conditions such as decolorization, reaction, and crystallization | The yield on the separation and purification of L-tryptophan increased to 61% | [93] |
| ZOU Chun et al. | Determination of the specific growth rate and inorganic salt concentration to optimize fermentation conditions | L-tryptophan production increased by 141.6% | [94] |
| YANG Mengchen et al. |
Change fermentation medium to clear medium | Significantly reduced the metabolic flow of by-products | [95] |
| MENG Shuaishuai | Optimization of media formulation | L-tryptophan production increased by 17.7% | [96] |
| ZHANG Leipeng et al. |
Optimization of media formulation | Increased tryptophan yield to 55.7 g/L, 21.88% higher yield, shorter fermentation cycle to 36 h | [97] |
| LI Rongjie et al. | Glucose solution made from cassava as a carbon source in the fermentation medium and sugar solution flowed during replenishment | Tryptophan production reached 40 g/L | [98] |
| LIU Xiaodu | Addition of trace element chelators to the fermentation medium of Escherichia coli | Enhancement of maximum bacterial volume and L-tryptophan production by about 14% each | [99] |
| LI Jing et al. | Realization of cell recycling process for L-tryptophan fermentation process | Increased L-tryptophan yield, shortened fermentation cycle and reduced accumulation of metabolic by-products | [100] |
| LIU Zhenyu et al. |
Coupled fermentation and membrane separation extraction process | Reduced accumulation of metabolic by-products and extended production cycles. | [101] |
| LI Rongjie et al. | Addition of nonylphenol polyoxyethylene ether-10 improves the permeability of the cell membrane of the bacterium | Fermentation cycle 45−50 hours, tryptophan yield reached 35−40 g/L, glucose-to-tryptophan conversion greater than 14% | [102] |
| LU Yu et al. | Process mode of constant temperature culture+low temperature crystal incubation+constant temperature culture | Acid production increased to over 51%, conversion rate increased to over 19.5% | [103] |
由于工程菌株的代谢通路被改变，原先使用的培养基和培养条件可能会造成代谢副产物过多、pH与溶氧等条件不适宜、营养元素不足等问题，导致生产菌活力下降、生产效率降低，不适用于生产发酵环境。因此，探索更为合理的发酵条件有利于L-色氨酸在发酵液中的进一步积累，为提高L-色氨酸产量、促进L-色氨酸工业生产打下基础。朱晓雯等[91]优化了大肠杆菌发酵生产L-色氨酸时使用的培养基，优化了补料模式，其产量达到24 g/L，提高了约35%；张震等[92]通过优化发酵接种量和底物磷酸二氢钾的添加量、使大肠杆菌在高密度发酵培养时副产物积累减少，L-色氨酸产量提高约31.2%，并通过混菌发酵工艺，进一步减少了乙酸、乳酸等代谢副产物的积累。
4.2 提取工艺优化相较于化学法，由于发酵原料组成相对简单且不含危险化学品，生物直接发酵法的提取物一般可以保证产品的安全性，但是仍然需要解决发酵液中产品含量较低的问题。近年来，从发酵液中提取和纯化L-色氨酸的工艺逐步成熟，所需成本更低，产物纯度更高，如苏建民[93]通过对发酵液进行分析后优化提取工艺和脱色、反应、浓缩结晶等条件，最终将L-色氨酸分离提纯的收率提高到61%，大大降低了生产L-色氨酸的成本，提高了经济效益。
5 总结与展望目前对于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的色氨酸生产菌改造已取得了一定成效(图 6)，但是由于菌株对高浓度L-色氨酸的耐受机理不清，仍然无法较好地解除L-色氨酸对菌株的生理毒性，由此造成的生产菌株生产强度、低菌株鲁棒性较差等问题是如今L-色氨酸工业化大规模生产面临的主要困难。适应进化虽然实用性强大，但是存在费时费力等问题。因此，通过生物传感器结合适应性进化的方法可以有效提高进化效率，通过对生产菌株L-色氨酸耐受机理的深入研究、降低L-色氨酸的毒性作用并找到将L-色氨酸高效排出菌体的方法将促进理性代谢改造的进一步发展。同时，L-色氨酸的衍生物(如生长素、褪黑素等)具有较高的经济效益，但目前这些产品仍然主要依靠天然提取法等方法获取，通过微生物发酵法得到这些衍生物的报道较少，距离工业化应用仍有相当长的距离，其中L-色氨酸在胞内浓度较低是导致这一现象的重要因素。希望随着L-色氨酸在胞内累积问题的解决和对L-色氨酸衍生物的合成机理的逐步明晰，通过微生物发酵法生产相应衍生物的方法逐步成熟并在未来尽快得到应用。
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| 图 6 L-色氨酸生产菌株构建与优化策略总结 Fig. 6 Summary of the strategies used for construction and optimization of L-tryptophan production strains. |
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