2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 蔡奇应, 张思琪, 刘华鹃, 刘滨磊
- CAI Qiying, ZHANG Siqi, LIU Huajuan, LIU Binlei
- 溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒在肿瘤中的复制及表达
- Replication and expression of oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ in tumors
- 生物工程学报, 2024, 40(2): 585-595
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(2): 585-595
- 10.13345/j.cjb.230619
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文章历史
- Received: September 8, 2023
- Accepted: November 16, 2023
- Published: December 2, 2023
引用本文
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2. 武汉滨会生物科技股份有限公司, 湖北 武汉 436000
2. Wuhan Binhui Biotechnology Co., Ltd., Wuhan 436000, Hubei, China
癌症是世界范围内的主要公共卫生问题。自2000年以来，中国癌症病例数和死亡人数逐渐上升[1]。传统的手术切除[2]和放化疗技术[3]可以达到较好的治疗效果，而利用生物技术手段治疗肿瘤的方案被证实对癌症患者的生存时间和生活质量有显著改善，已经成为肿瘤治疗的重要手段之一[4]。
目前已有较多应用生物技术手段的药物被批准用于临床治疗肿瘤[5]。如白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)是一种能够活化肿瘤微环境的细胞因子[6]，它能够通过刺激T细胞和自然杀伤细胞的增殖和分化来诱导抗肿瘤免疫反应[7]；程序性死亡蛋白-1 (programmed cell death-1, PD-1)及其配体PD-L1属于免疫检查点抑制剂，它通过增强T细胞对肿瘤的识别提升机体的抗肿瘤免疫作用[8]；嵌合抗原受体-T细胞(chimeric antigen receptor, CAR-T)疗法对于治疗白血病或淋巴瘤具有显著疗效，它通过生物技术手段改造患者自身T细胞，达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的，但CAR-T细胞疗法对治疗实体瘤具有一定的局限性[9]；溶瘤病毒是一种能够靶向杀伤肿瘤细胞且对患者没有明显毒副作用的抗肿瘤药物[10]，通过生物技术手段进行改造后能够增强病毒对肿瘤细胞的杀伤作用，并且降低病毒在正常细胞中的复制能力[11]。目前研究进展最快的病毒是疱疹病毒，以疱疹病毒为载体的溶瘤病毒T-VEC[12]、G47Δ[13]已被批准用于肿瘤治疗。疱疹病毒的优势在于其基因组可以插入较大的外源基因，且感染谱广，能够感染大多数肿瘤细胞[14]，在临床使用中如果出现感染，可以通过成熟的抗疱疹病毒治疗方案进行控制[15]。
溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus type 2, oHSV2)是以野生型Ⅱ型单纯疱疹病毒为骨架改造而来[16]，通过敲除ICP34.5[17]和ICP47[18]以降低神经毒性和增强对肿瘤细胞的选择性。在oHSV2中插入外源基因可以辅助肿瘤治疗[19]，如插入绿色荧光蛋白基因能够使感染的细胞在荧光显微镜中更好地被观察[20]；插入萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)基因后得到的oHSV2-Fluc在d-荧光素钾盐的作用下发出的荧光能够被仪器检测，可用于观测病毒在机体中的感染状况[21]；插入人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF)基因后得到的oHSV2-hGM-CSF (简称OH2)所分泌的hGM-CSF可以增强抗原呈递细胞(antigen presenting cells, APC)的募集，APC的活化有助于肿瘤抗原呈递给肿瘤特异性T细胞，从而提高抗肿瘤效应[22]。临床前研究表明，oHSV2能有效治疗鼠结肠癌[23]，降低脾脏中抑制性免疫细胞的含量，增加抗肿瘤免疫细胞的含量，能够发挥持久的抗肿瘤效果且具有远端效应[24]。oHSV2与抗信号调节蛋白α抗体联合治疗可以重塑肿瘤微环境，激活先天性和适应性免疫反应[25]。经过oHSV2治疗的荷瘤小鼠采取外周血进行单细胞RNA测序，结果表明oHSV2能够激活全身免疫，促进CCL5的产生，oHSV2可提高外周血细胞毒性T细胞和成熟自然杀伤细胞的细胞毒性[26]。oHSV2安全性良好，其在小鼠和食蟹猴的长期毒性和生物分布实验中的结果证实，oHSV2多次给药后不会显著改变小鼠和食蟹猴的体重和各项生理指标，在各脏器中均不能检测到病毒拷贝数[27]。同时，临床数据显示，oHSV2在实体瘤患者中耐受性良好，表现出持久的抗肿瘤活性且未发生与治疗相关的严重不良事件[28]。本文通过考察oHSV2在肿瘤注射部位的复制水平、持续时间、hGM-CSF的表达水平以及考察HSV-2抗体表达水平，为给药方案的优化提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料、试剂 1.1.1 实验动物和细胞56只雌性无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c小鼠，6−7周龄，体质量(18±1) g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK (鄂) 2020−0018。CT26细胞由本实验室前期保存。所有动物实验的进行均遵守湖北工业大学科研伦理与科技安全委员会的相关规定(批准号：HBUT20200021)。
1.1.2 试剂及仪器胰酶购自Gibco公司；D-荧光素钾盐购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自四季青公司；Premix Ex Taq (Probe)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；RNA simple总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；FastPure Plasmid Mini Kit、反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；HRP-Goat Anti-Mouse IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司；GM-CSF单克隆抗体、生物素标记的GM-CSF单克隆抗体及Streptavidin-HRP购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)、DMEM/F12培养基由本实验室自配；OH2及oHSV2-Fluc由本实验室构建。
二氧化碳培养箱购自松下电器（中国）有限公司；小动物活体成像系统购自珀金埃尔默股份有限公司；生物安全柜购自海尔集团公司；多功能酶标仪、高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；常温冰箱及−80 ℃低温冰箱均购自海尔集团公司；荧光定量PCR仪购自鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养CT26细胞由本实验室前期保存，细胞培养基为DMEM/F12 (含10%胎牛血清)，将细胞培养于含5% CO2、37 ℃的二氧化碳培养箱中。在显微镜下观察细胞，当细胞汇合度达到80%−90%时对细胞用0.25%胰酶消化传代。
1.2.2 动物模型建立将购自湖北省实验动物研究中心的BALB/c雌性小鼠饲养于无致病原的动物实验室内。在饲养1周后于小鼠背部右侧皮下植瘤：取生长状态良好的CT26细胞，使用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，用DMEM/F12把细胞密度调整为1×107/mL，每只小鼠皮下注射100 μL。植瘤后观察肿瘤生长状况，待肿瘤体积达到约100 mm3时将小鼠分笼。
1.2.3 小鼠给药及量瘤将56只小鼠分为4组(表 1)。为各组小鼠瘤内注射100 μL不同浓度(1×107 CCID50/mL、1×108 CCID50/mL)的OH2及1×107 CCID50/mL的oHSV2-Fluc。对照组(Control)瘤内注射PBS 100 μL。将首次给药时间记为0 d，于第0、3、6天对小鼠进行瘤内给药。从0 d开始量瘤，每3天进行一次，肿瘤体积(mm3)=长×宽2×0.5。
| Group | Type of administration | Dosage (100 μL/piece) | Number of animals |
| High-dose group | OH2 | 1×108 CCID50/mL | 20 |
| Low-dose group | OH2 | 1×107 CCID50/mL | 20 |
| Duration group | oHSV2-Fluc | 1×107 CCID50/mL | 6 |
| Control | PBS | 100 μL | 10 |
oHSV2所携带的外源基因Fluc能够在小鼠皮下表达。在第0、1、5、8、11、18天对持续时间组及对照组小鼠使用小动物活体成像仪拍照，每次取3只小鼠，麻醉前对小鼠腹腔注射d-荧光素钾盐100 μL，注射(15±2) min后对小鼠进行拍照。
1.2.5 OH2在肿瘤注射部位的复制水平对首次给药后第7、9天的小鼠进行剥瘤，−80 ℃保存。使用分析天平称取50 mg样本用于提取总RNA，取1 μg总RNA进行逆转录反应，对逆转录产物采用qPCR进行定量。根据OH2的包膜糖蛋白gD设计qPCR引物及探针为：上游引物：5′-CCGCTTTATCCCCGAAAAC-3′；下游引物：5′-TGCCACCCGGCGATT-3′；探针：5′-AGCGCACCGTCGCCCTATACAGC-3′。以pHG52-d34.5-CMV-gD质粒作为标准品，建立标准曲线。qPCR反应中每个样本进行3次技术重复，依据标准曲线计算出相应样本的拷贝数。
1.2.6 OH2注射后小鼠体内hGM-CSF水平的检测对首次给药后第14、28天的小鼠进行眼眶采血，血样本离心后取血清，存放于−80 ℃低温冰箱中。检测hGM-CSF水平采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)：使用GM-CSF单克隆抗体为一抗包被酶标板；封闭液封闭后，将血清样本用稀释液1:50稀释；同时用稀释液稀释标准品，标准品初始浓度为300 pg/mL，通过2倍倍比稀释，得到5个浓度梯度的标准品；设置阴性对照(稀释液)，将待检样品与标准品加入酶标板中，于37 ℃孵育1 h；洗板后，加入生物素标记的GM-CSF单克隆抗体，37 ℃孵育1 h；将Streptavidin-HRP以1:1 000进行稀释后，加入酶标板中，37 ℃孵育30 min；洗板后加入显色剂显色，终止显色后用酶标仪于450 nm波长下测量吸光度。
1.2.7 OH2注射后小鼠体内HSV-2抗体水平检测检测HSV2抗体水平采用ELISA法：对包被了检测HSV2抗体的一抗的酶标板使用封闭液封闭，将血清样本用稀释液以1:100进行梯度稀释，共8个稀释度，加入酶标板中孵育；洗板后，加入用稀释液1:20 000稀释的二抗辣根过氧化物酶-山羊抗小鼠IgG [HRP(horseradish peroxidase)-goat anti-mouse IgG]；于37 ℃孵育30 min，再加入显色剂显色，终止显色后用酶标仪于450 nm波长下测量吸光度(图 1)。
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| 图 1 oHSV2在肿瘤中复制及表达的检测方法 Fig. 1 Detection of oHSV2 replication and expression in tumors. |
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数据统计采用Graph Pad Prism 9软件进行处理，数据以平均值±标准差表示。两组组间差异性采用独立样本t-test分析，以P < 0.05表示差异有显著性，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 OH2在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果在首次给药后的第15天，对照组小鼠平均肿瘤体积为(1 986.78±1 081.53) mm3，oHSV2高剂量组平均肿瘤体积为(184.53±308.27) mm3，oHSV2低剂量组平均肿瘤体积为(568.53±516.36) mm3，其中对照组与oHSV2高剂量组存在极显著性差异(P < 0.01)，实验结果如图 2所示。
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| 图 2 BALB/c小鼠肿瘤体积大小 Fig. 2 Tumor size in BALB/c mice. A：肿瘤体积随时间的变化. B：第15天肿瘤体积 A: Changes in tumor volume over time. B: Tumor volume on day 15. *: P < 0.05; **: P < 0.01. |
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通过小动物活体成像仪对不同时间段oHSV2携带的Fluc在小鼠瘤内的表达进行检测，结果如图 3所示。结果表明在进行瘤内注射oHSV2-Fluc后，Fluc基因能够在瘤内表达。检测到的荧光强度随着时间增长而降低，到第18天时荧光强度已低于检测限，同时对照组均未检测到荧光。
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| 图 3 小鼠瘤内所表达Fluc的信号强度 Fig. 3 The signal intensity of Fluc expressed in mouse tumor. A：小动物活体成像仪所拍摄的小鼠瘤内Fluc表达状况. B：小鼠瘤内Fluc表达荧光信号强度的变化 A: The expression of Fluc in mouse tumor captured by small animal imaging apparatus. B: The change of Fluc expression intensity in mice tumor. |
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qPCR结果显示，在给药后第7天均能检测到OH2的基因，且对照组未检测出，其中高、低剂量组OH2 mRNA表达水平分别为(779.44±151.75) copies/μg total RNA、(160.51±56.23) copies/μg total RNA。给药后第9天，高剂量组OH2仍能检出，其表达水平为(142.03±10.05) copies/μg total RNA，低剂量组与对照组未检测出OH2 mRNA的表达(图 4)。
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| 图 4 qPCR检测肿瘤中OH2拷贝数随时间的变化 Fig. 4 The number of OH2 copies in tumor over time was detected using qPCR. N.D.: Not detected. |
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对第14天及28天小鼠血清中hGM-CSF水平进行酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测。实验结果显示，第14天时，高、低剂量组小鼠血清中hGM-CSF与对照组小鼠血清相比显著提高，且存在极显著性差异(P < 0.01)。第28天检测结果表明，高、低剂量组小鼠血清中hGM-CSF仍高于对照组，但无显著性差异，结果如图 5所示。
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| 图 5 血清中hGM-CSF水平 Fig. 5 The serum levels of hGM-CSF. A：第14天hGM-CSF水平. B：第28天hGM-CSF水平 A: hGM-CSF level on day 14. B: hGM-CSF level on day 28. **: P < 0.01. |
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对第14、28天小鼠血清中HSV2抗体水平进行ELISA检测。实验结果表明，与对照组相比，低剂量组与高剂量组HSV2抗体水平显著提高，且均存在显著性差异(P < 0.05)，结果如图 6所示。
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| 图 6 血清中HSV-2抗体水平 Fig. 6 The serum levels of HSV-2 antibody. A：第14天HSV-2抗体水平. B：第28天HSV-2抗体水平 A: HSV-2 antibody level on day 14. B: HSV-2 antibody level on day 28. |
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目前，肿瘤的治疗方式仍是集中在手术治疗、化学治疗和放射治疗[29]，由于生物技术手段的不断发展，越来越多新颖的治疗方式出现，如CAR-T、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒等。而这些新方法还需要更多的临床试验和验证，才能更好地应用于癌症治疗。溶瘤病可以在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，改变肿瘤微环境，激发免疫反应，吸引更多的免疫细胞继续杀死残余的肿瘤细胞[30]。随着溶瘤病毒被多个国家的监管部门批准用于癌症的治疗，越来越多的癌症患者也因此受益，这也加速了溶瘤病毒的研究进程。
随着oHSV2在临床治疗中不断展现出的积极效果，作为一种有前途的溶瘤治疗产品，目前已有oHSV2进入Ⅲ期临床，用于治疗黑色素瘤。然而，oHSV2还面临着一些挑战和问题，需要更多的临床前和临床数据来支持其安全性和有效性。为了深入探讨oHSV2给药方法的合理性、可行性，提高oHSV2的临床效果，本研究对oHSV2在肿瘤注射部位的持续时间、复制水平、hGM-CSF表达水平以及HSV-2抗体水平进行考察。实验结果表明：瘤内注射OH2的小鼠肿瘤体积明显小于对照组，显示出积极的抗肿瘤效果；对肿瘤注射部位的OH2进行qPCR检测以及通过活体成像仪对oHSV2-Fluc在肿瘤部位的持续时间进行检测，发现oHSV2能够在肿瘤中复制且对肿瘤具有持久的杀伤作用；对给药后的小鼠进行眼眶采血，通过ELISA对小鼠血清中hGM-CSF检测，结果显示OH2能够持续表达hGM-CSF，反映出其能够活化肿瘤微环境，增强抗肿瘤能力。通过ELISA对小鼠血清中HSV-2抗体水平进行检测，结果表明给药后能够激活机体对oHSV2的抗体中和作用，验证了免疫系统对机体具备保护作用，表明oHSV2具备一定的安全保障。
确定溶瘤病毒在肿瘤中的持续作用时间及插入基因的持久性对于指导溶瘤病毒的临床应用是至关重要的。OncoVEXGM-CSF是一款以HSV1为骨架的溶瘤病毒，其Ⅰ期临床结果发现在单剂量阶段，2名患者的肿瘤表面在3周后能检测到低水平的病毒存在，这表明在多剂量应用时，间隔2−3周给药是合理的[31]。插入外源基因的表达对于肿瘤治疗有着积极的影响[32]，hIL-7/mIL-12-VV是一种能够表达hIL-7和mIL-12的溶瘤痘病毒，除了病毒本身的溶瘤效果外，还可以通过释放hIL-7和mIL-12改变肿瘤微环境中的免疫状态，增强了注射和非注射远端肿瘤的免疫应答，并使免疫原性差的肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感[33]。使溶瘤病毒只在肿瘤中复制而不影响其他正常组织，能够显著降低副作用对患者的损害[34]。肿瘤细胞的一个局限性是它们的抗病毒反应途径存在缺陷[35]，这种缺陷使它们更容易受到溶瘤病毒的影响，实现肿瘤细胞特异性感染，oHSV2就是通过敲除ICP34.5使之能够在干扰素缺陷的肿瘤细胞中正常复制。从生物安全角度来看，当病毒入侵人体后，机体会产生抗病毒免疫反应[36]，所产生的抗体可以降低病毒在正常组织中的复制，确保溶瘤病毒的安全性。在OH2临床试验中[27]，26例血清中HSV2抗体阴性的患者经过OH2治疗后全部转为阳性，而临床结果表明HSV抗体的产生与肿瘤治疗间未发现关联，这表明OH2是一款安全且抗肿瘤功能强大的溶瘤病毒。
总之，本研究证明oHSV2是一种能够持久表达且安全有效的溶瘤病毒产品。未来，将积极探索溶瘤病毒给药途径和给药方式，降低溶瘤病毒免疫原性[37]，提高溶瘤病毒的肿瘤靶向性[38]，如通过脂质体包封病毒核酸经静脉给药来治疗给药困难的肿瘤，增加患者的治疗选择。
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