生物工程学报  2024, Vol. 40 Issue (1): 252-268
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.230349
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

王秀军, 赵彦贝, 王静, 李子航, 张纪堂, 李庆卫
WANG Xiujun, ZHAO Yanbei, WANG Jing, LI Zihang, ZHANG Jitang, LI Qingwei
基于SSR分子标记的175份蜡梅种质遗传多样性分析和指纹图谱构建
Genetic diversity analysis and fingerprinting of 175 Chimonanthus praecox germplasm based on SSR molecular marker
生物工程学报, 2024, 40(1): 252-268
Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(1): 252-268
10.13345/j.cjb.230349

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Received: May 8, 2023
Accepted: July 18, 2023
 Abstract              PDF               Figures               Tables
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王秀军, 赵彦贝, 王静, 李子航, 张纪堂, 李庆卫. 基于SSR分子标记的175份蜡梅种质遗传多样性分析和指纹图谱构建[J]. 生物工程学报, 2024, 40(1): 252-268.
WANG Xiujun, ZHAO Yanbei, WANG Jing, LI Zihang, ZHANG Jitang, LI Qingwei. Genetic diversity analysis and fingerprinting of 175 Chimonanthus praecox germplasm based on SSR molecular marker[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(1): 252-268.
基于SSR分子标记的175份蜡梅种质遗传多样性分析和指纹图谱构建
王秀军1 , 赵彦贝1 , 王静1 , 李子航1 , 张纪堂2 , 李庆卫1     
1. 北京林业大学园林学院 林木资源高效生产全国重点实验室, 北京 100083;
2. 鄢陵县林业局, 河南 许昌 461200
收稿日期：2023-05-08；接收日期：2023-07-18
基金项目：国家林业和草原局课题蜡梅(修订) (2020-LY-008)；北京园林绿化增彩延绿科技创新工程(2019-KJC-02-10)
摘要：理清蜡梅品种资源、构建指纹图谱是推动蜡梅科学研究和产业发展的重要基础。利用简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)分子标记技术，对鄢陵地区175个蜡梅(Chimonanthus Praecox L.)品种(系)的遗传多样性进行了研究，使用NTSYSpc 2.1软件中的UPDM聚类方法分析品种间的遗传多样性。利用基于贝叶斯模型的Structure v2.3.3软件解析175份种质的遗传结构。通过一般线性模型(general linear model, GLM)对性状和标记进行关联分析。在遗传多样性分析中，平均等位基因数(number of alleles, Na)为6.857，平均期望杂合度(heterozygosity, He)为0.496 3，平均观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)为0.503 7，蜡梅Nei’s平均基因多样性指数为0.494 9，平均Shannon信息指数为0.995 8，表明鄢陵地区蜡梅群体内具有较丰富的遗传多样性。群体结构和UPDM聚类分析均表明可将175个品种(系)分为7个类群。在GLM模型中有15个标记位点与8个表型性状显著(P < 0.05)关联，表型变异解释范围为14.90%−36.03%。利用11对多态信息含量(polymorphic information content, PIC)最高的引物，构建175份蜡梅品种(系)资源SSR标记的指纹图谱。本研究综合分析了鄢陵地区蜡梅的遗传多样性与SSR分子标记，并构建了蜡梅核心种质资源库，为蜡梅新优品种选育、品种鉴定、资源保护与利用等工作提供理论支撑。
关键词：蜡梅    种质资源调查    遗传多样性    指纹图谱    简单重复序列(SSR)分子标记    
Genetic diversity analysis and fingerprinting of 175 Chimonanthus praecox germplasm based on SSR molecular marker
WANG Xiujun1 , ZHAO Yanbei1 , WANG Jing1 , LI Zihang1 , ZHANG Jitang2 , LI Qingwei1     
1. National Key Laboratory for Efficient Production of Forest Resources, School of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;
2. Yanling County Forestry Bureau, Xuchang 461200, Henan, China
Received: May 8, 2023; Accepted: July 18, 2023
Supported by: This work was supported by the National Forestry and Grassland Administration Subject Wintersweet (Revised) (2020-LY-008) and the Beijing Landscaping Enhances Color and Extends Green Science and Technology Innovation Project (2019-KJC-02-10)
Corresponding author: LI Qingwei, E-mail: lqw6809@bjfu.edu.cn.
Abstract: The elucidation of resources pertaining to the Chimonanthus praecox varieties and the establishment of a fingerprint serve as crucial underpinnings for advancing scientific inquiry and industrial progress in relation to C. praecox. Employing the SSR molecular marker technology, an exploration of the genetic diversity of 175 C. praecox varieties (lines) in the Yanling region was conducted, and an analysis of the genetic diversity among these varieties was carried out using the UPDM clustering method in NTSYSpc 2.1 software. We analyzed the genetic structure of 175 germplasm using Structure v2.3.3 software based on a Bayesian model. General linear model (GLM) association was utilized to analyze traits and markers. The genetic diversity analysis revealed a mean number of alleles (Na) of 6.857, a mean expected heterozygosity (He) of 0.496 3, a mean observed heterozygosity (Ho) of 0.503 7, a mean genetic diversity index of Nei՚s of 0.494 9, and a mean Shannon information index of 0.995 8. These results suggest that the C. praecox population in Yanling exhibits a rich genetic diversity. Additionally, the population structure and the UPDM clustering were examined. In the GLM model, a total of fifteen marker loci exhibited significant (P < 0.05) association with eight phenotypic traits, with the explained phenotypic variation ranging from 14.90% to 36.03%. The construction of fingerprints for C. praecox varieties (lines) was accomplished by utilizing eleven primer pairs with the highest polymorphic information content, resulting in the analysis of 175 SSR markers. The present study offers a thorough examination of the genetic diversity and SSR molecular markers of C. praecox in Yanling, and establishes a fundamental germplasm repository of C. praecox, thereby furnishing theoretical underpinnings for the selection and cultivation of novel and superior C. praecox varieties, varietal identification, and resource preservation and exploitation.
Keywords: Chimonanthus praecox    germplasm resources survey    genetic diversity    fingerprinting    simple sequence repeats (SSR) marker    

蜡梅(Chimonanthus praecox L.)为蜡梅科蜡梅属落叶木本植物，是我国特产的传统名花和经济林树种[1]，具有很高的观赏价值、经济价值与文化价值[2]。鄢陵，中国著名的花木之都，是蜡梅最重要的产地之一[3]。鄢陵地区的蜡梅栽培历史悠久，品种资源丰富，但目前对该地区蜡梅品种资源的研究还处于起步阶段，新优品种培育及园林推广应用等落实程度不高。因此调查并梳理蜡梅品种资源，摸清鄢陵地区蜡梅种质资源，进行遗传多样性研究，建立鄢陵地区蜡梅资源DNA指纹图谱，对蜡梅资源管理、品种选育、新优品种研发、鉴定和推广应用等具有十分重要的意义。

DNA指纹图谱可以快速、精准地鉴定品种之间的差异，对品种资源鉴定、保护及亲缘关系分析等具有重要作用[4]。Wu等[5]开发了杨梅品种的DNA指纹系统，该系统使用8个DNA片段的多样性信息，能在不失去稳定性的情况下获得非常高的效率，对杨梅的遗传多样性、分子育种和品种保护具有重要的价值。已有研究表明蜡梅在长期的生产栽培过程中，不论是群体内还是群体间都产生了丰富的遗传多样性[6]。简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)分子标记技术在遗传多样性分析、品种鉴定、关联分析、基因定位和辅助育种等研究中体现了较高的实用性和应用价值，在园林植物[7]、农作物[8]、动物[9]等遗传多样性研究方面均有应用。赵明晓和范国强以素心蜡梅为材料，研究不同方法对蜡梅SSR扩增效果的影响，建立了适宜的蜡梅SSR分子标记反应体系[10]。李响等利用蜡梅转录组数据库组装的Unigene分析得到表达序列标签微卫星(expressed sequence tag simple sequence repeat，EST-SSR)的候选位点，证明通过蜡梅转录组数据库EST信息开发SSR标记具有可行性[11]。杨佳利用从NCBI数据库中获得蜡梅EST序列来设计引物，在10个野生蜡梅居群中获得多态性等位基因片段，证明从蜡梅EST序列中开发的EST-SSR分子标记具有良好的种间通用性[12]。Qazi利用SSR分子标记技术鉴别蜡梅杂种F1的真实性，发现真杂种率仅为41.67%，且F1代群体的遗传多样性较低[13]。鄢陵地区长期以来持续开展蜡梅的收集、驯化和培育等工作，汇集了全国不同地区的蜡梅品种资源。但蜡梅相关基础科研发展相对较为薄弱，蜡梅品种资源家底不清，蜡梅性状与遗传多样性研究较少。

本研究通过开展蜡梅品种资源调查，梳理鄢陵地区蜡梅种质资源，运用SSR分子标记的方法，对调查记载的蜡梅栽培群体进行遗传多样性和亲缘关系分析，为蜡梅的品种分类、核心种质库建立以及新优品种研发、鉴定和推广应用等提供科学依据；并以SSR标记引物建立鄢陵地区蜡梅种质资源DNA指纹图谱，为蜡梅资源的保护和利用以及科学研究和产业应用提供理论支撑。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验材料于2020年采样于鄢陵，鄢陵位于河南省中东部地区(东经114°02′−114°19′，北纬33°46′−34°14′)，采样地点包括鄢陵县园艺场蜡梅基地、世界蜡梅园、鄢陵梅园、新科梅园、鄢陵县国家花木博览园蜡梅基地、花艺蜡梅资源圃和姚家蜡梅苑等，共175份蜡梅品种(系) (附表1，所有附表和附图已提交国家微生物科学数据中心，编号：NMDCX0000226)。

表 1 筛选出的21对引物序列表 Table 1 The sequence of the 21 primer pairs screened
Primers Base sequence (5′→3′) Base sequence (5′→3′) Output (bp)
Locus5 AAGAGGAAGAGGAAGAGGAAGTG TAGCTGCTGAGAGTAAGACCACG 124−136
Locus6 AAGAGGAAGAGGAAGAGGAAGTG CCTTAGCTGCTGAGAGTAAGACC 128−140
Locus8 ACCAACAAAACAACGATGAGAAT TATCCGAATTCCAATTCCTCTCT 118−127
Locus31 ATGTATAGCAGTATTTTAGTATCA TATTTTGTCTTGGTTATCAT 112−138
Locus63 GAACCGTCGGATGAAGAAGATG CAGATGCCCCCACTACCCTATT 275−281
Locus65 CTGCTCGCAAAGATAACG CCTAACTCGGAGCACATACT 373−397
Locus66 AGCTGCTGAAGGAGGAGAAG TTGGAGACGGCGAAGTGG 228−243
Locus67 CGCCGCCCGATTTCCTCC CGCCTGCCTATACCTTTGATTG 291−329
Locus71 GTGTGCGACGTGGGTGTT GGCGATTTCTGTTTCCTTTCT 255−258
Locus76 TCTTCTCCATTTCCTTCACAAAA TCTGTGTACTTTCTCATTTCGCA 118−156
Locus77 ACCAACAAAACAACGATGAGAAT TTCCTCTCTCCTAGCCCTTATGT 105−133
Locus78 ATTGTAACCATGGAAGGAGGAAC TGAAGCATCAATCATAGCAAATG 117−283
Locus79 ATCAATTTTGACTTGTAAACGGC TGATCTGCGCAACAAAGATAAAT 126−174
Locus80 GTTTTGGTAGCGTTTGGTTAGTG AACCTTCTTCATACTAGCCTCCG 168−200
Locus93 TCGGAGTATTACATTCCCTCTTG GCAATACATACATGCACATAGCC 117−121
Locus106 ATCGGGTTTAGCAGACTTAGCTT ACTTTGAAAGATTCACACTTCCG 169−175
Locus116 AAGTCTCATCTCCAATATGGGGT TGAGAATCATGTTGAGAGTCAGG 154−164
Locus119 ACCACTGTGAGTTGTTCGTTTGT GGCAACACTCAAACGAATTTTAC 140−142
Locus122 ACTTAATGGGCTTTTGTTGGTTT TGAAAAGGTTGGATTGTTTATGG 132−134
Locus144 TTCAAAGTAGCTCAAGCATTTGTC AGTTGGTCATGCGATTCAAAAT 123−151
Locus155 TATTGTCCCAAGCTTTCTTTCAA TCCATCAGATCCAATAAGTACCG 164−184
表选项
1.2 实验方法 1.2.1 DNA提取的方法步骤

DNA提取参照天根生化科技(北京)有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)说明书进行操作。

1.2.2 引物筛选与荧光毛细管电泳

从已发表的蜡梅及近缘物种夏蜡梅的分子标记相关文献中确定168对SSR引物(附表2)[10, 14-17]，再随机选取8个蜡梅DNA样品进行PCR扩增，筛选出能够稳定扩增出清晰条带的引物，PCR扩增的反应体系和反应程序参照Nie等的方法[18]。通过扩增位点片段筛选出21对能够稳定扩增出清晰条带的引物(表 1)。通过Genemarker v2.2.0[19]软件得到175个蜡梅样品的基因型数据。

表 2 SSR位点多态性信息表 Table 2 Polymorphism information of SSR loci
Primer Na Ne I Ho He H PIC
Locus5 3 1.704 8 0.723 8 0.585 4 0.414 6 0.413 4 0.366 4
Locus6 3 1.638 9 0.679 7 0.609 1 0.390 9 0.389 8 0.343 2
Locus8 4 1.833 6 0.772 7 0.544 1 0.455 9 0.454 6 0.389 4
Locus31 5 1.053 2 0.150 8 0.949 3 0.050 7 0.050 5 0.050 7
Locus63 3 1.593 0 0.666 1 0.626 7 0.373 3 0.372 2 0.333 5
Locus65 9 3.208 3 1.536 3 0.309 7 0.690 3 0.688 3 0.661 8
Locus66 4 2.802 6 1.140 6 0.355 0 0.645 0 0.643 2 0.580 3
Locus71 2 1.953 5 0.681 2 0.510 5 0.489 5 0.488 1 0.369 0
Locus67 14 3.276 5 1.593 9 0.303 2 0.696 8 0.694 8 0.653 9
Locus76 13 3.148 3 1.513 8 0.315 7 0.684 3 0.682 4 0.647 6
Locus77 4 1.841 9 0.775 5 0.541 6 0.458 4 0.457 1 0.391 1
Locus78 26 5.359 2 2.295 9 0.184 3 0.815 7 0.813 4 0.801 5
Locus79 10 2.845 3 1.317 2 0.349 6 0.650 4 0.648 5 0.593 0
Locus80 11 3.327 5 1.558 6 0.298 5 0.701 5 0.699 5 0.664 8
Locus93 3 1.241 8 0.365 9 0.804 7 0.195 3 0.194 7 0.178 6
Locus106 3 1.522 6 0.626 9 0.655 8 0.344 2 0.343 2 0.310 6
Locus116 4 1.556 3 0.651 5 0.641 5 0.358 5 0.357 4 0.315 7
Locus119 2 1.433 6 0.479 9 0.696 7 0.303 3 0.302 4 0.257 0
Locus122 2 1.507 7 0.519 6 0.662 3 0.337 7 0.336 7 0.279 8
Locus144 10 3.355 2 1.489 9 0.296 0 0.704 0 0.702 0 0.655 3
Locus155 9 2.947 1 1.372 4 0.337 4 0.662 6 0.660 7 0.604 4
Mean 6.857 2.340 5 0.995 8 0.503 7 0.496 3 0.494 9 0.449 9
St.Dev 5.842 1.049 0 0.537 3 0.200 5 0.200 5 0.199 9 0.192 9
表选项
1.3 群体结构分析

使用Structure 2.3.3[20]的贝叶斯聚类方法进行群体结构的分析，参数Length of burnin period设置为5 000，Number of MCMC Reps after burnin设置为50 000，设定K值为1−10，Number of iterations为20次。将Structure的输出结果打包后上传至Structure Harvester进行计算，获取最佳K值。

1.4 遗传多样性分析

多样性指数是描述物种多样性的重要指标，按Shannon-Weaver信息指数进行运算。数值性状如中被片长度、长宽比等进行10级分类，一级 < X‒2δ，10级 > X+2δ，中间每级差0.5δ，δ为标准差，X为平均数。二元性状及多元性状按赋值进行统计计算。

统计各品种(系)的扩增片段大小总数，将每对引物下的位点数按照从小到大的顺序分别编码为A、B、C、D等，形成原始数据矩阵，再使用Popgene软件计算观测等位基因数(number of alleles, Na)、有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)、Shannon信息指数(Shannonʼs information index, I)、Nei’s基因多样性指数(Neiʼs gene diversity index, H)、期望杂合度(heterozygosity, He)和观测杂合(observed heterozygosity, Ho)；利用PIC_CALC软件计算多态信息含量(polymorphic information content, PIC)。对每个样品的扩增条带按有(记为1)、无(记为0)，形成原始数据矩阵，利用NTSYS-pc2.10e软件中的SAHN程序对距离矩阵进行UPGAM聚类分析并用MEGA 11绘制聚类树状图，计算遗传距离和遗传一致度，用Dcenter命令和Eigen程序进行主成分分析，利用SPSS19.0[21]软件进行相关性分析。

1.5 关联分析

利用TASSEL 2.1软件，通过一般线性模型(general linear model, GLM)将性状和标记进行关联分析[22]，通过OmicShare Tools (https://www.omicshare.com/tools)进行数据可视化，确定标记位点和表型变异解释率。

1.6 DNA指纹图谱构建

根据1.2.2中SSR扩增出的175份蜡梅品种(系)的片段长度，将不同引物的不同片段分别编号，每对引物由2个字母组成。根据11对核心引物PIC值从大到小的排列顺序和各样品扩增出条带的片段大小，运用Excel 2021软件将筛选出的所有多态性引物的品种分组情况进行统计对比，挑选出条带清晰且能区分所有蜡梅品种(系)的最佳引物组合，为175个蜡梅品种(系)资源构建对应的DNA指纹图谱。根据SSR引物扩增的条带图对175个蜡梅品种(系)进行分组。

2 结果与分析 2.1 蜡梅遗传多样性水平分析

根据得到的175个蜡梅品种SSR的扩增结果，利用Popgene软件计算出21对引物的多态性信息，21对引物在11条染色体上均匀分布(附图 1)。以locus80引物为例，其在6个品种上的扩增产物毛细管电泳结果见图 1，可见该引物具有较高的多态性。结果显示(表 2)，175个样品中共检测到144个等位位点，每对引物检测到多态性条带范围为2−26条，平均每个位点观测等位基因数(Na)为6.857个，其中位点最多的有26个，位点最少的只有2个；平均每个位点能够检测到的有效等位基因数(Ne)为2.340 5，其中位点78最多(5.359 2)，位点31最少(1.053 2)；Shannon信息指数(I)的变化为0.150 8−2.295 9，均值为0.995 8，表明供试蜡梅材料有着丰富的遗传多样性；Nei’s基因多样性指数范围是0.050 5−0.813 4，均值为0.494 9；期望杂合度(He)在0.050 7−0.815 7，均值为0.496 3，观测杂合度(Ho)变化范围为0.184 3−0.949 3，均值为0.503 7。多态信息含量值(PIC)的变化范围是0.050 7−0.801 5之间，均值为0.449 9，表明能够满足对供试材料进行遗传多样性分析的要求。

图 1 SSR引物locus80在6个蜡梅样本(‘虎蹄红丝’ ‘银盘紫’ ‘腮红’ ‘冰盏红心’ ‘金殿紫’和‘白被醉心’)中的毛细管电泳图 Fig. 1 Capillary electrophoresis of locus80 primer in six samples ('Huti Hongsi' 'Yinpan Zi' 'Saihong' 'Bingzhan Hongxin' 'Jindian Zi' and 'Baibei Zuixin').
图选项
2.2 群体结构分析

当K=7时，ΔK有明显的峰值，因此确定K=7为最优K值(图 2A)。表明175份蜡梅品种(系)可分为7个类群，当某一材料在某个组群中的Q值≥0.6时，认为该材料遗传结构相对单一[23]，Q值大于或等于0.6的131份蜡梅种质材料(占参试材料的74.9%)划归到相应的7个组群中，其余44份遗传结构具有复杂的混合来源，无法明确其归属的组群。G1 (见图 2B红色部分) 15份；G2 (见图 2B绿色部分) 13份；G3 (见图 2B蓝色部分) 36份；G4 (见图 2B黄色部分) 19份；G5 (见图 2B品红色部分) 21份；G6 (见图 2B青色部分) 24份；G7 (见图 2B桔色部分) 12份，大部分资源为混合类型，说明G1和G3、G2和G5、G5和G6、G7和G5之间的遗传分离程度高，存在一些杂合度较高的蜡梅品种(图 2B)。

图 2 蜡梅品种(系)群体结构分析的delta K值分布(A)和群体结构图(B) Fig. 2 Distribution of delta K values for structure analysis (A) and population structure diagram (B) in Chimonanthus praecox.
图选项
2.3 蜡梅种质亲缘关系分析 2.3.1 聚类分析

根据SSR扩增结果分析得到，175个蜡梅样品的遗传相似系数变化范围是0.431 3−0.885 2，平均值为0.658 2，根据遗传相似系数绘制聚类图(图 3)。结果显示，供试材料的175个样品可通过21对引物完全区别。为了后续更好地比较不同组群间的差异，可划分为三大类，其中Ⅱ和Ⅲ可以进一步划分出3个亚类，共七小类(分别包含14、30、26、22、29、26和28份材料)。第Ⅰ类均为红心品种，花型以碗型和喇叭型居多；Ⅱ-1中包含红心蜡梅和晕心蜡梅品种，花型以喇叭型为主，花被片数约在13−18，雄蕊个数在5−6；Ⅱ-2和Ⅱ-3包含红心、晕心和素心3个蜡梅品种，以中晚花期为主; 第Ⅲ-1类和第Ⅲ-2类为晕心和素心品种，以早花期和中花期为主，爪的颜色为黄色和绿色；第Ⅲ-3类包含素心、晕心和红心蜡梅品种，花被片数大都在16−20之间，中被片边缘以平展居多。

图 3 175个蜡梅品种聚类图 Fig. 3 Cluster analysis of 175 Chimonanthus praecox varieties.
图选项
2.3.2 主成分分析

利用NTSYS-pc 2.10e软件对175份供试材料进行主成分分析，其中第一主坐标贡献率为7.58%，第二主坐标贡献率为7.43%，第三主坐标贡献率为5.47%。根据第一和第二主坐标生成的二维图(图 4)对供试样品间亲缘关系进行比较分析。根据二维图可以看出175个蜡梅样品分散在各个方向，表明供试材料间遗传变异丰富，拥有较广阔的遗传背景。该二元主成分分析结果不仅体现了参试蜡梅种质间的亲缘关系，且与群体结构的组群划分大致吻合。

图 4 175份蜡梅种质资源二元主成分分析 Fig. 4 Two-dimensional principal component analysis of 175 Chimonanthus praecox germplasm resources. 1−175 corresponds to the 175 C. praecox varieties in supplementary Table 1. 1−175为附表1中的175个蜡梅品种
图选项
2.4 蜡梅表型性状与SSR标记关联分析

利用TASSEL 2.1软件中的GLM模型对表型分布频率符合或接近于正态分布的表型进行表型性状与SSR标记的关联分析(正态分布情况见附图2)。在GLM模型中有15个标记位点与8个表型性状显著(P < 0.05)关联，表型变异解释范围在14.90%−36.03%。与花被片数、中被片数、中被片长宽比极显著关联(P < 0.01)的位点有2个；与中被片形状极显著关联的位点有4个。与雄蕊数、中被片颜色、中被片形状和中被片长度显著关联的位点有12个。另外，还出现同一标记位点与多个性状关联的情况，locus63和locus80均与花被片数、中被片数、雄蕊数和中被片形状关联；locus119与中被片长度和花径关联；locus122与花被片数和中被片数关联(图 5)。

图 5 GLM模型的关联分析结果 Fig. 5 Association analysis results of GLM models. a: Chime mouth type; b: Lotus type; c: Bowl type; d: Bell type; e: Trumpet type; f: Disc disc type; g: Middle tepal color; h: Flower diameter; i: Number of tepals; j: Number of middle tepals; k: Length of middle tepals; l: Length to width ratio of middle tepals; m: Number of stamens; n: Shape of middle tepals; o: Shape of apex of middle tepals; p: State of apex of middle tepals; q: State of edge of middle tepals; r: Condition of inner tepal spotting; s: Color of claw; t: Color of bud; u: Flowering stage. a：磬口型；b：荷花型；c：碗型；d：钟型；e：喇叭型；f：盘碟型；g：中被片颜色；h：花径；i：花被片数；j：中被片数；k：中被片长度；l：中被片长宽比；m：雄蕊数；n：中被片形状；o：中被片先端形状；p：中被片先端状态；q：中被片边缘状态；r：内被片斑晕情况；s：爪的颜色；t：花蕾颜色；u：花期
图选项
2.5 鄢陵地区蜡梅DNA指纹图谱构建

根据表5中的多态信息含量PIC值，按照从大到小的顺序排序，经排列组合后发现，选取PIC值最大的前11对引物组合，可以将175个蜡梅品种完全区分。选定的11对引物PIC值从大到小的顺序名称为locus78、locus80、locus65、locus144、locus67、locus76、locus155、locus79、locus66、locus77和locus8，然后对以上引物的扩增片段进行编号(附表3)，为175个蜡梅品种资源构建对应的字母指纹图谱(表 3)。175个蜡梅品种的SSR指纹图谱均具有唯一性，每一条指纹信息代表一个独立品种。

表 3 175个蜡梅品种资源的指纹图谱 Table 3 Fingerprints of 175 Chimonanthus praecox resources
No. Cultivar SSR fingerprinting No. Cultivar SSR fingerprinting
1 ‘Xiao Qinkou’ WWJJDGBBLLCCCCACBBCDCD 89 ‘Guifei Zuijiu’ WWCCDDGGLLCCDDAABBDDDD
2 ‘Jinzhu’ GWBCEEAABCCCDDAABBDDDD 90 ‘Yuwan Zanghong’ SWBJCDBIBCBCCFAAAABDBD
3 ‘Yanbai’ WWBBDDBGBBEECCCCACCCCC 91 ‘Sai hong’ KWBDDFGGBKBBCCAABCDDDD
4 ‘Jin Qingkou’ WWBJDDGGBBEECCCCAADDDD 92 ‘Xiangya Hongsi’ NWBCDDGGCCCCDHABABBDBD
5 ‘Feng Feiwu’ CIBDEIDDBBBCCDDDAACDCD 93 ‘Zhuang Yuanzhong’ UWDECHAEBFABDHAABDCDCD
6 ‘Luanbei Jinwan’ KWJJDDGGKLFFDDCCBBDDDD 94 ‘Juanyun’ CVCJDDBBBKCCDFACABDDDD
7 ‘Zaola’ CGBBFFBGBKAADDACBCDDDD 95 ‘Husu’ WWBCDDGGCCCCCDAAABDDDD
8 ‘Yin Qingkou’ WWDDDDGGBBEECDCCBCDDDD 96 ‘Yu Linglong’ WXBCEEEEBCBCEEAABCDDDD
9 ‘Dahua Donglü’ NNJJBBBGBCCCCCACBCDDDD 97 ‘Yinhe’ COBJDFBBBCDECDAAABDDDD
10 ‘Jinpan’ CNBCDEBEELJKCDACACDDDD 98 ‘Fenmian Hanchun’ CCBBDFBGBCCCDDCCAADDDD
11 ‘Changban Yinzhan’ KNBDCCBEFFCCDDCCBCDDDD 99 ‘Suwan Ziban’ NNBBDDBBBBCCDDCCAADDDD
12 ‘Yangguang’ WWBJDDBBBBCCCCAAAADDDD 100 ‘Jinwan Qianban’ CWBDBDBBCCCCDDCCACCDCD
13 ‘Jinzhong Suxin’ TWCDBDBGBBBBDHAABCBDBD 101 ‘Bingyan’ WWBBDGGGCCCCCCCCBCDDDD
14 ‘Yuhu Bingxin’ WWDDBBGGBBCCCDCCBCCCCC 102 ‘Maonao’ GGJJDDGGBCAADDCCBCDDDD
15 ‘Su Yuwan’ WWBBDDBBBBCCCCCCBCDDDD 103 ‘Huang Denglong’ CCBBDDGGCCCCDDAABBBDBD
16 ‘Baixue Gongzhu’ WWDJDDBBCCEECDACBBDDDD 104 ‘Daiyu’ PWBBDFAGBCCCDDCDBBCDCD
17 ‘Baihua Suxin’ WWBDCDBGBBCCCDCCBCCDCD 105 ‘Huanghe’ PWIJCFBEBBBCCDBBBDCDCD
18 ‘Dahua Suxin’ GWBBBDBGBLDEDDACBCBDBD 106 ‘Jin Zifeng’ CGBBDEGGCCCCCCAABBDDDD
19 ‘Lüwan Suxin’ CCBBCDBBCCEEDHAAAACDCD 107 ‘Danzhuang Lülei’ MYBCEEBBCIBBCCBBACCDCD
20 ‘Waigang’ CWBJDDBBBBEECDCCBBDDDD 108 ‘Duobei Yunjuan’ WWBBBDBGBBCCCDCCABDDDD
21 ‘Qinkou Suxin’ WWDDGGBGDFDEDDCCABDDDD 109 ‘Hongxin Bozhou’ GLBBCDEGCFCCFGCCAACDCD
22 ‘Jinbei’ WWBJDDBGBLCCCDCCABDDDD 110 ‘Feihuang’ WWBBCDBBEEEEDDCCBCCCCC
23 ‘Jin Zhonghuang’ CWDJBDBGBCCCDDCCACDDDD 111 ‘Youbao Pipa’ EGBBBBBEBBCCDDAABCBBBB
24 ‘Huangjian’ NNBBDDBGBFBBDDCCACDDDD 112 ‘Shi Baban’ WWJJDDBGCLCCCDBCBBBDBD
25 ‘Xuhe’ KKBDFFBBBBEEDDCCACDDDD 113 ‘Juanbei Yunxin’ WWJJCDBGBCCCDDCCBCDDDD
26 ‘Duobei Suxin’ GWJJGGBGBBCCDDAABBCCCC 114 ‘Sihong Danyu’ CCBBDDBGBLEECCCCABDDDD
27 ‘Guanghui’ WWBJDDBBBBEEDDCCAADDDD 115 ‘Feiyan’ GNBBCDBGEKEECDCCAADDDD
28 ‘Jinbei’ WWJJBBBBBBEEDDCCBCBDBD 116 ‘Qingwu Feiyang’ JJBHCDBBCCEEFGCCAACCCC
29 ‘Changbei Suxin’ NNBBDDBBBBCEDDACBBDDDD 117 ‘Yupan Hongrun’ WWBBDDGGBLCCDHABBCDDDD
30 ‘Feicui’ JNBBGGBBCCCCCDCCAADDDD 118 ‘Lingdang’ GTJJDGBBBCCCDDAAACDDDD
31 ‘Dahua Bozhou’ CWBBCDBBBBCCCCCCBCCCCC 119 ‘Chuniao Chuchao’ WZBCDGGGBCCCCHACABDDDD
32 ‘Lühua’ CCDDCCBBBEEECCCCBBDDDD 120 ‘Jinlü Zuihua’ WWBJDGBGBBDECDCCBCDDDD
33 ‘Juan bei Suxin’ CWBJDDBBBECCCDCCACDDDD 121 ‘Jinyu Hongzhuang’ WWDJCGBGCEBBDHBCBBBCBC
34 ‘Jin Houshi’ KWJJDDGGBECCCDBCBCBDBD 122 ‘Biyu Xiuhua’ NNBBDDGGCLEEDHCCBCCDCD
35 ‘Jin Pifeng’ WWBDDFGGBBCCCDAABCBBBB 123 ‘Yu Jiaorong’ WWDDGGGGCCCCCCACBBCDCD
36 ‘Jianbo Suxin’ JXBDCDBGBBCCDGABBCCDCD 124 ‘La Hongsi’ WWBBCDBBBBBBDDBBBCDDDD
37 ‘Bingyu’ CCBBDDGGCCCCCCCCBCCDCD 125 ‘Xin Guifei’ LLJJGGBBCCCCDDBCABDDDD
38 ‘Jindie’ WWBCDDGGCFBBDDCCBBDDDD 126 ‘Juanlian Xinyun’ CCDDDDBBKKEECECCAADDDD
39 ‘Huang Yuqiu’ NWBBCCBBBBCCCCCCACDDDD 127 ‘Zhaoxia’ OWBICFBBABACCHAABBCDCD
40 ‘Yuzhong’ WWBBDGBGBBEECCCCAACDCD 128 ‘Liaoban Yiran’ ZZEECDEEGGDDDEJIBBCCCC
41 ‘Diaozhong Suxin’ WWJJDDBGBCCCCCCCBCDDDD 129 ‘Changbo Hongsi’ HRCCCCADBBCICDBBBCCDCD
42 ‘Jiang Nanbai’ GGJJIIBBCLCCCDAAAADDDD 130 ‘Jinpan Yurui’ WYIJCCDFBIHHCDCCABCDCD
43 ‘Yang Zhouhuang’ CCBBDDBGBCCCCDACAADDDD 131 ‘Jinlian Hongyu’ BEBBCDEEBJHHCCCDBCDDDD
44 ‘Su Foshou’ WWJJDDBGEECCHHCCBBCDCD 132 ‘Huangyan Danxin’ PPBBDDDEAAEECCDDCCCCCC
45 ‘Jusu’ LWJJDDBGBCEECCACABBDBD 133 ‘Mohe’ EOJKDDAFBBBBCDBBBDDDDD
46 ‘Huangyan Wansu’ WWDDCDGGBBCCDFBBAACCCC 134 ‘Taiyang’ OOBBBDAFBBBBCDAABDADAD
47 ‘Qianhuang Wansu’ WWBBGGBGCCEECCCCABDDDD 135 ‘Qiyan’ GOBJBGABBBDDCDBBABCDCD
48 ‘Xiaguang’ GVBCCEEGABBJCEAABCDDDD 136 ‘Mohong’ TTBBCDAABFCCCCAEBCCDCD
49 ‘Yin Gouya’ YYFFBDBFBBAADEFFBBDDDD 137 ‘Yanchi Xiayi’ UYBBCFFGBDDEAEACBBCCCC
50 ‘Ningmei Yilan’ MMBBDDABBIBCEEAAAACCCC 138 ‘Yin Panzi’ EPBJDEDJAMEECIDGBCCDCD
51 ‘Yinhong’ TVABCDBFAICCDDAABDDDDD 139 ‘Zaohong’ DEBJCDBDAMCCCDEEACDDDD
52 ‘Lüzhua Qianyun’ YYBHDDDGBBCCEEAAAACCCC 140 ‘Xiaohua’ GWBBEEEEAABCDEAABCDDDD
53 ‘Ehuang Xiaguan’ ACHHBDFGBBBBCCCCAADDDD 141 ‘Xiaojing Nongnei’ ERABBDBFBBBCADDFADCDCD
54 ‘Yunbian hongsi’ TYABCCBGBBEFDDCCADCDCD 142 ‘Qingwu Hongniang’ GGCCFFAGBBCCCIAABDDDDD
55 ‘Zixin Qingkou’ WWBJDGGGBCCCCDACBBCDCD 143 ‘Bingzhan Hongxin’ GPBBDGEFBBBBBEAABCDDDD
56 ‘Bing Huanghou’ GPBBDFFGCCBBDDAABBDDDD 144 ‘Baibei Zuixin’ WYAJCDBGABCDCCAABCCDCD
57 ‘Feilian’ TYBIDHGGBCAACCBFABDDDD 145 ‘Moji’ AQBGCDAEBCEFFHAABBCCCC
58 ‘Mo Gouya’ BBBJDFABCLCCADBCBBDDDD 146 ‘Yaochi Xianzi’ FFBEAFCCBBGGCEEEACCDCD
59 ‘Yuzan’ QTBJCFFGBBBBCCACABCDCD 147 ‘Yinzi’ CEFJCDBBBBDDCDAAABCCCC
60 ‘Jinman Siyun’ GWBBDDBGCMBCCCACBCDDDD 148 ‘Mozhong’ GPBBDFAEBCBBCDAABCDDDD
61 ‘Hefeng Lüxiu’ TWBBDHBBBLBBBEHHBBDDDD 149 ‘Jin Dianzi’ CWBBDDBGCKBBCHCCBCDDDD
62 ‘Ehuang Hongsi’ CCBJDDBGBCACCDACBCDDDD 150 ‘Hongxin Tuer’ CWBJDGBGBCCCCDABABDDDD
63 ‘Jinbei Huangrui’ WWBJDDBFCCDDDDCCBBCDCD 151 ‘Jin Jianzhou’ GWBBCDGGCCCCBDCCBBCDCD
64 ‘Xiaojia Biyu’ EGCGDEFFBMCCDEAABCDDDD 152 ‘Zi Yuzhan’ EGBBCCDEBDDHCDAFBCCDCD
65 ‘Huangban’ WWBBDDBBBCCCCCAABCDDDD 153 ‘Gouya’ RTDJCEDGCLBEACBCCDCDCD
66 ‘Luanbei Dianyun’ WYBBCDEFBICLDDADBCDDDD 154 ‘Mozhong Dianjin’ WWDDDFBHBBBBCCEEADCCCC
67 ‘Jinhuang’ UWBCCDBGBCCCDDCCBBDDDD 155 ‘Jin Panzi’ TWBBDDEGABCMFGACAABCBC
68 ‘Jinzhong Yunjian’ GGCCCDBBBBCCCDAABBDDDD 156 ‘Jinlong Zixue’ WWBFDDBBCCBBDDBCBCDDDD
69 ‘Yanzhi’ OQAJCEAFBBBEDFDDBDDDDD 157 ‘Jinjian Hongxin’ GGBBDEBGBBCEDDCCABCDCD
70 ‘Jiaorong’ CCBHEGBGBKDEDFCDACCDCD 158 ‘Zixin Rumeng’ EQCECDAEFJEIFFFGBBCCCC
71 ‘Jinhe Ziwen’ WWBBDDGGBBEEFFCCAADDDD 159 ‘Bingling Huanxiao’ MTDDIICCBBCCDDFFBBDDDD
72 ‘Danzhuang Huangyan’ PWCFBBFGCFAHDDCCBCCDCD 160 ‘Kouhong’ GGAADFBBBBCCBDAABBCDCD
73 ‘Suyi Danzhuang’ PWBGDDFGBLCCDEAABCDDDD 161 ‘Bingling’ EEEEEEDDBBFFDDBCBBCCCC
74 ‘Jinwan Baoxin’ TTBJCIBBBCBCCDACABDDDD 162 ‘Jinzhan Hongxin’ EGDHCEBDBNCCDDAAABCCCC
75 ‘Huti Hongsi’ KKCJDDGGFLCCDDACACDDDD 163 ‘Yuguan’ WWJJDDFGCCCCDDCCACCDCD
76 ‘Hongyun Changbei’ NWCJDGBGCKCCCCACAACCCC 164 ‘Luoyang’ TTCJDDFGCCCCCHACBBDDDD
77 ‘Jinqing Tanxiang’ GGJJIIEECCCCDDCCBCDDDD 165 ‘Xiaran Huangyan’ GWDJBCBGCKCCDGAABCDDDD
78 ‘Jin Zhanhua’ CCCJDDBGCCEECDCCBCBDBD 166 ‘Yanguo Qingxue’ NWBBGGBGLLCCDDCCBBCCCC
79 ‘Hongxia’ WWBJDDFGBCCCDDCCBBDDDD 167 ‘Jianbei Hongxin’ NSABBCGIACBBCGBBBBBCBC
80 ‘Jinwan Tanxiang’ KWJJCDBGBBCCCCCCBCDDDD 168 ‘Jinwu Cangjiao’ LWBJCDBBCEAACDABBCCDCD
81 ‘Jindie Qianyun’ NWBDBCGGBECCCCCCBBDDDD 169 ‘Jianzi’ CCBBDEGGBBCCDGBCBCCDCD
82 ‘Hongfo’ CCBCDDBBCCCCCCCCBCCCCC 170 ‘Juanlian Jinbei’ GWBJCDFGBCACDDCCBCCDCD
83 ‘Huangpan Hongsi’ CCCCDDBGBLCECDCCBBCDDD 171 ‘Yucai’ WWBBDDBBCCEEDHCCBCCDCD
84 ‘Jinxiang Hongyun’ WWBJFGBBCLCECDBCBCDDDD 172 ‘Chushui Furong’ KWBBGGGGCCCCFHBCBCCDCD
85 ‘Hongsi Jinlian’ WWBBDGBBBBEECDCCABDDDD 173 ‘Jinyun Biri’ GTCCDDGGCCCCCDAABBDDDD
86 ‘Fujin’ GGFJCDBFCCCCCDACBCBCBC 174 ‘Yuyi Hongxin’ WWBBDDBGCCEECDCCBBDDDD
87 ‘Danzhuang Diewu’ WWCJGGBBCLCCCHCCBCDDDD 175 ‘Jinlong Tanzhua’ GGBBDDBBBHBBDGCCACCDCD
88 ‘Xiao Dingdang’ UWCCCCBDBEDDDEBBAADDDD
表选项
3 讨论与结论

SSR分子标记被广泛应用于分类鉴定、亲缘关系分析、体细胞杂种鉴定、遗传图谱构建和基因定位等方面[24-25]，能够从分子水平研究物种的遗传多样性，探讨种内及其近缘种属植物的起源与变化。本研究利用21对SSR引物对175份蜡梅种质资源进行遗传多样性分析，结果显示供试群体平均等位基因数(Na)为6.857，平均期望杂合度(He)为0.496 3，平均观测杂合度(Ho)为0.503 7，表明鄢陵地区蜡梅群体内有比较丰富的遗传多样性；蜡梅Nei’s平均基因多样性指数为0.494 9，平均Shannon信息指数为0.995 8，表明各位点的遗传多样性存在较大差异，该蜡梅群体具有较高的遗传多样性。该结果与靖相密[26]、赵凯歌[6]对蜡梅栽培群体遗传多样性的研究结果类似。多态信息含量(PIC)是微卫星DNA变异程度高低的一个指标，反映微卫星DNA多态高低[27]。本研究21对引物中，PIC > 0.5的有9对，0.25 < PIC < 0.5的有10对，位点表现出较高的多态性。群体结构分析表明，可将供试材料分为7个组群，其中G1和G3、G2和G5、G5和G6、G7和G5之间存在一些杂合度较高的品种，同时也表明鄢陵地区的蜡梅具有丰富的遗传背景。通过聚类图分析可以发现，175份蜡梅栽培品种资源首先被聚为两类。第一大类包含了大部分蜡梅栽培品种，第二大类中，品种内被片均为深紫红色，爪的颜色也均为红色，表明内被片斑晕情况相同的品种能够较早地被聚为一类，该性状特征在蜡梅品种分类中具有重要地位。这个结果在陈龙清等[28]、芦建国等[29]的研究中也得到证实，目前根据内被片斑晕特征将蜡梅划分为素心品种群、晕心品种群及红心品种群的分类标准得到专业学者们的认可[29-31]。综合聚类结果，发现内被片斑晕情况、花被片数、花色、花蕾颜色、中被片长宽比、中被片长度、花径和中被片形状等性状相似的品种能够明显的被聚在一起，这与赵冰等[1]、叶丽娟[32]的研究结果类似。在表型遗传聚类中占重要地位的花型特征在SSR分子遗传聚类图中却没有表现明显的聚类关系，可能由于蜡梅是异交为主的植物，后代产生广泛的变异和分离，而数量性状具有微效性和累加性，需要多个数量性状点发生变异，才有可能引起表型上的变化，花型特征作为品种分类的依据有待进一步研究验证。关联分析的为蜡梅复杂性状基因定位和实现分子辅助育种提供了一种快捷、有效的途径。本研究关联到更多与蜡梅花部表型相关的性状，在GLM模型中关联到花径、花被片数等8个性状(附表4)，该模型考虑群体结构Q对关联分析的影响，具有较高的统计效率[33]；数量性状中存在同一标记与多个性状相关联或同一数量性状和多个标记相关联情况，可能是基因之间相互关联所导致的[34]。

DNA指纹图谱因具有多位点性、高变异性和简单稳定的遗传性等特点，被认为是品种鉴定最简单有效的方法[35]。引物的多态信息含量值(PIC)越高，越具有区分鉴定品种特异性的能力，可以作为核心引物构建DNA指纹图谱[36]。核心引物筛选在节约资金和时间成本方面具有重要意义，在较大容量植物样品的初步研究中可被优先选用。蜡梅栽培历史悠久，品种资源复杂丰富，本研究利用21对SSR引物对175个蜡梅品种进行遗传多样分析，并从中选取11对多态信息含量(PIC)最高的引物作为核心引物为每个品种构建DNA指纹图谱，结果表明175个蜡梅品种的SSR指纹图谱均具有唯一性，每一条指纹信息代表一个独立品种，为蜡梅品种构建更为简单、稳定的DNA指纹图谱，可以为鄢陵地区蜡梅品种鉴定提供理论依据。

本研究通过综合分子遗传聚类与主成分分析，揭示了鄢陵地区蜡梅品种丰富的遗传多样性。利用GLM模型发现15个标记位点与8个表型性状显著(P < 0.05)关联；得到11对多态信息含量(PIC)最高的引物为蜡梅品种构建DNA指纹图谱，为蜡梅品种鉴定与筛选体系的研究提供了技术支撑。

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