2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 苏如意, 金罗佳, 徐江玲, 耿慧雅, 陈晓, 林思怡, 郭威, 纪志远
- SU Ruyi, JIN Luojia, XU Jiangling, GENG Huiya, CHEN Xiao, LIN Siyi, GUO Wei, JI Zhiyuan
- 大豆斑疹病菌铁摄取因子PiuB在致病性中的作用分析
- The role of iron-uptake factor PiuB in pathogenicity of soybean pathogen Xanthomonas axonopodis pv. glycines
- 生物工程学报, 2024, 40(1): 177-189
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(1): 177-189
- 10.13345/j.cjb.230338
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文章历史
- Received: May 5, 2023
- Accepted: September 13, 2023
- Published: September 18, 2023
引用本文
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2. 中国农业科学院作物科学研究所 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081
2. National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI), Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing 100081, China
由地毯草黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. glycines, Xag)引起的大豆细菌性斑疹病(bacterial pustule, BP)，是大豆上重要的检疫性病害[1]。BP在我国大豆产区常年发生，区域性和间歇性暴发成灾，其可导致大豆叶片病斑累累、早枯脱落，造成大豆籽粒瘪小、严重减产降质[2-3]。
金属离子在细菌生理代谢过程中具有多重作用，其除了参与蛋白质互作、调节蛋白质的三维结构与功能外，还能感知并传递胞外信号、促进生长以及增强毒性[4]。Fe3+作为生命必需的基本元素，在细菌呼吸、DNA合成、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环和氧化还原等过程中起重要作用；但胞内Fe3+积累过量会引发芬顿(Fenton)反应，导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累，从而造成细胞中毒或死亡[5-6]。因而，病原细菌进化出复杂而又精细的策略调节Fe3+的摄取、利用和贮存，以维持胞内的铁稳态[5, 7]。
有关病原细菌对Fe3+摄取的研究相对较少，且主要见于人体和动物病原细菌中。例如，引起一些严重全身感染(如脑膜炎、心内膜炎等)的伴生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)，可利用HitABC系统直接介导Fe3+的吸收[8]。Fe3+膜外受体PhuR和HasR[9]，以及受体FyuA[10]，分别在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和鼠疫耶尔森氏杆菌(Yersinia pestis)结合铁载体和铁乳蛋白中发挥重要作用。研究表明，Fe3+摄取基因缺失通常影响人体或动物病原细菌的毒力[11-12]。植物病原黄单胞菌的全基因组内存在多个(7个以上)注释编码Fe3+摄取或转运的基因，但其具体功能均未知。
铁摄取调节子(ferric uptake regulator, Fur)在细菌中高度保守，且是控制胞内Fe3+浓度的重要调节子[13-14]。在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)中，Fur失活削弱病原菌的铁稳态、氧化应激(oxidative stress, OS)、生长和毒力[15]。P. aeruginosa的fur为必需基因，不能直接敲除；低表达Fur菌株在高Fe3+和低Fe3+环境中均呈现出生长阻滞现象，且生物膜(biofilm)形成能力、OS、游动性(motility)等均显著削弱[16]。此外，黄单胞菌铁结合调控子(Xanthomonas iron binding regulator, XibR)负调控铁载体产生[17]。可见，植物病原细菌胞内Fe3+摄取的调控机制复杂且多样。
为探究Fe3+在Xag生长代谢过程中的作用，本研究以铁摄取因子(iron-uptake factor, PiuB) (A9D66_21475)为研究对象，分析PiuB对于Xag在铁载体分泌量、毒性因子合成、致病性等方面的作用，以期为深入解析Xag的致病机制和设计BP病害生防策略提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 菌株和培养条件本研究所用菌株和质粒见表 1。
| Strains and plasmids | Properties | Source |
| Strains | ||
| Escherichia coli DH5α | Φ90, 1acZ Δm15, recA1 | Invitrogen |
| Xanthomonas axonopodis pv. glycines ZJ15 | Cbr; wild-type, Zhejiang | This lab |
| ∆hrcC | Cbr; hrcC deletion mutant of ZJ15 | This study |
| ∆piuB | Cbr; piuB deletion mutant of ZJ15 | This study |
| C∆piuB | Cbr and Spr; ∆piuB harboring pCpiuB | This study |
| Plasmids | ||
| pMD19-T | Apr; Kmr; pUC ori, cloning vector | TaKaRa |
| pKMS1 | Kmr; sacB+, suicide vector derivative from pK18mobGII | [18] |
| pHM1 | Spr; Mob+, LacIP+, PK2 replicon, cosmidr | [18] |
| pKΔpiuB | Kmr; A 819 bp fusion cloned in pKMS1 for a 2 420 bp deletion in piuB | This study |
| pCpiuB | Spr; pHM1 expressing piuB under its own promoter | This study |
| Apr: Ampicillin resistance; Kmr: Kanamycin resistance; Spr: Spectinomycin resistance; Cbr: Carbenicillin resistance. | ||
LB培养基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10；NA培养基(g/L)：酵母提取物1，多聚蛋白胨5，蔗糖10，牛肉浸膏3，琼脂粉15；NY培养基(g/L)：酵母提取物1，多聚蛋白胨5；NAN培养基(g/L)：酵母提取物1，牛肉浸膏3，多聚蛋白胨5；NAS培养基(g/L)：酵母提取物1，牛肉浸膏3，多聚蛋白胨5，蔗糖100；L培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 5，葡萄糖1。大肠杆菌(Escherichia coli)于37 ℃培养；Xag及衍生菌株于28 ℃培养。
所用抗生素及浓度：氨苄青霉素(ampicillin, Ap) 100 μg/mL，羧苄青霉素(carbenicillin, Cb) 50 μg/mL，卡那霉素(kanamycin, Km) 50 μg/mL，壮观霉素(spectinomycin, Sp) 100 μg/mL。
1.2 piuB基因缺失突变株及其功能互补株的构建本研究所用引物见表 2。
| Primers name | Primer sequence (5′→3′) | Size (bp) |
| piuB-up-F1 piuB-up-R1 |
aaTCTAGAGTGAAACGAGCCGACCCTGCC atAAGCTTCAGTGATACCGAGCAGCCAAT |
543 |
| piuB-down-F2 piuB-down-R2 |
atAAGCTTGTACTCGGCGACACGCGTCTG taCTGCAGGGCGAGGATTTATTGATGCGT |
276 |
| piuB-verification-F1 piuB-verification-R2 |
aaTCTAGAGTGAAACGAGCCGACCCTGCC taCTGCAGGGCGAGGATTTATTGATGCGT |
819 |
| piuB-verification-F3 piuB-verification-R3 |
CTCGCCGTGTTGCTTGACCAG ATGCGAGTTGCCGTTGAGGTG |
1 316 |
| piuB-complemention-F piuB-complemention-R |
taAAGCTTGGGGTGCCGTTCGCGTAAAGA atGAATTCTCAGTACACATCGCGTCGATA |
2 869 |
| Bold letters indicated restriction sites. | ||
以ZJ15为出发菌株，以pKMS1为敲除载体[18]，基于同源重组策略构建piuB基因的缺失突变株，命名为ΔpiuB (附图 1已提交至国家微生物科学数据中心，登录号：NMDCX0000229)；以pHM1为互补载体[19]，构入piuB基因[含启动子及编码序列(coding sequence, CDS)区]，并将其电转至突变株ΔpiuB中，构建突变株ΔpiuB的功能互补株，命名为CΔpiuB (附图 2已提交至国家微生物科学数据中心，登录号：NMDCX0000229)。
1.3 致病性和生长能力测定将新活化的各待测菌株培养至指数生长期，用灭菌去离子水洗涤2次后，调至OD600=0.3，再加入0.05%表面活性剂Silwet L-77，混匀后经高压喷雾接种至大豆叶片表面，15 d后拍照记录叶片发病症状，试验重复3次。用灭菌去离子水将新培养的各待测菌株调至OD600=0.1，经无针注射器注入大豆叶片体内，每天取注射区域的大豆叶片研磨、稀释、涂布平板，统计菌落数量以评估各待测菌株在大豆体内的生长能力，连续测定7 d，试验重复3次[2]。
1.4 添加外源Fe3+的生长曲线测定将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，按一定比例转接至含不同Fe3+浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)的NY培养基中振荡培养24 h，每隔3 h测定其OD600值，并绘制生长曲线[16]。
1.5 铁载体分泌量检测将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，等量菌液接种至以铬天青S为显色剂的CAS检测培养基平板上，28 ℃培养3−5 d，观察接种区域周围培养基的颜色变化，比较各菌株的铁载体分泌量[15]。
1.6 H2O2抗性将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，均匀涂布于含不同浓度(0、0.4、0.6 mmol/L) Fe3+的NA平板上，在平板中央放置1个灭菌滤纸片，在其中央滴加3 μL 30%的H2O2溶液，28 ℃培养2 d，观察各菌株在滤纸片周围所形成的抑菌圈[19]。
1.7 金属离子抗性将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，均匀涂布于NA平板上，再将无菌的圆形滤纸片放置于平板中央，用移液器在其上分别滴加3 μL FeCl3 (2.5 mol/L)、CuCl2 (1.25 mol/L)、ZnCl2 (1.25 mol/L)或MnCl2 (2.5 mol/L)溶液，28 ℃培养2 d，比较各菌株对金属离子的抗性[20]。
1.8 胞外多糖合成定性测定：将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，用灭菌去离子水洗涤菌体并悬浮，取1 μL菌液接种于含2%葡萄糖或蔗糖的NY平板上，28 ℃培养5−7 d，观察各菌株的生长形态[1]。
定量测定：将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，取20 μL菌液接种于含2%葡萄糖或蔗糖的NY液体培养基中，28 ℃振荡培养5 d，离心收集上清液，加入3倍体积无水乙醇后充分混匀，−20 ℃放置10−12 h，高速离心收集沉淀物，于55 ℃烘干后称重[1]。
1.9 生物膜检测将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，按1‰比例转接至L培养基中，28 ℃静置培养7 d后，轻轻倒去培养液，先用0.1%结晶紫对试管壁上形成的生物膜染色，再用90%酒精溶解结合于生物膜上的结晶紫，分别测定结晶紫洗脱液A600和上清液OD600的吸光值，确定各菌株的生物膜形成能力[16]。
1.10 游动性测定将新活化的各待测菌株培养至OD600约为1.0，用灭菌去离子水洗涤菌体并重悬至OD600约为0.1，取1 μL菌液接种于含0.5%葡萄糖的半固体NY平板上，28 ℃培养1−2 d，比较各菌株在平板上的游动能力[19]。
1.11 胞外水解酶检测分别以羧甲基纤维素、可溶性淀粉或脱脂牛奶为底物制备胞外酶活性检测培养基。将新活化的各待测菌株培养至OD600约为3.0，离心取上清液并加入各酶活性检测平板中，培养1−2 d后分别染色，并测量水解圈直径，比较各菌株的胞外水解酶活性[3]。
2 结果与分析 2.1 PiuB在植物病原黄单胞菌中高度保守piuB在Xag基因组内注释为编码铁摄取因子，暗示其可能是胞内的Fe3+吸收因子。在已知序列的Xag菌株(如ZJ15、12-2和8ra等)中，PiuB具有100%的蛋白序列同源性。此外，Xag的piuB基因与来自柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xac) 306菌株的piuB基因(XAC4036)、棉花细菌性角斑病菌(Xanthomonas campestris pv. malvacearum, Xcm) AR810009菌株的piuB基因(CIW71_02020)、菜豆细菌性疫病菌(Xanthomonas campestris pv. phaseoli, Xcp) CFBP4885菌株的piuB基因(XcfCFBP4885P_00310)、辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv) 85-10菌株的piuB基因(XCV4128)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) PXO99A菌株的piuB基因(PXO_02819)、水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc) BLS256菌株的piuB基因(XOC_4335)、Xcc 8004菌株的piuB基因(XC_4044)和小麦细菌性条斑病菌(Xanthomonas translucens pv. cerealis, Xtc) CFBP 2541菌株的piuB基因(KHA79_01495)，分别具有99.33%、99.33%、96.57%、95.40%、90.73%、90.65%、78.39%和71.40%的DNA序列相似性(图 1)。揭示铁摄取因子PiuB在植物病原黄单胞菌中高度保守。
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| 图 1 piuB基因在植物病原黄单胞菌中的同源性分析 Fig. 1 Homology analysis of piuB in plant pathogenic Xanthomonas spp.. 通过MEGA 7.0软件利用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，并且用bootstrap-1 000进行校正 Phylogenetic tree was constructed using NJ through MEGA 7.0 software, and was corrected with bootstrap-1 000. |
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为探究PiuB是否参与Xag的致病性，分别将ΔpiuB、CΔpiuB和野生型菌株通过喷雾和无针注射方式接种至寄主大豆叶片上。15 d后，ΔpiuB在大豆叶片表面引起的疱疹状病斑(毒性)明显弱于野生型，而Ⅲ型分泌系统突变株ΔhrcC (阴性对照)在大豆叶片上没有产生任何病斑症状(图 2A)。此外，ΔpiuB在大豆叶片体内的生长能力前7 d均显著低于野生型(P < 0.01) (图 2B)。功能互补可恢复ΔpiuB在寄主大豆上的毒性和生长能力至野生型水平(图 2)。这说明PiuB是Xag在寄主大豆上致病所需的。
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| 图 2 大豆斑疹病菌突变株ΔpiuB在寄主大豆上的致病性测定 Fig. 2 Pathogenicity test of ΔpiuB in host soybean. A：突变株ΔpiuB在大豆叶片上引起的病害症状. B：突变株ΔpiuB在大豆叶片体内的生长能力. **：P < 0.01；n=3 (t检验) A: BP symptoms caused by ΔpiuB on soybean leaves. B: Growth ability of ΔpiuB in inoculated leaves of soybean. **: P < 0.01; n=3 (t test). |
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为初步探究PiuB是否与Xag摄取外源Fe3+有关，分别检测ΔpiuB、CΔpiuB和野生型菌株的铁载体分泌量。在以铬天青S为显色剂的CAS检测培养基平板上，上述3个菌株均能产生较明显的淡黄色晕圈，表明各菌株均能产生铁载体以螯合培养基中的Fe3+，使培养基呈现出黄色；但突变株ΔpiuB形成黄色晕圈的能力相较于CΔpiuB及野生型菌株均显著增强(P < 0.01) (图 3)。在Fe3+充足条件下，ΔpiuB需分泌更多的铁载体从胞外吸收Fe3+；也就是说piuB基因缺失增强了Xag的铁载体分泌量，表明PiuB可能是Xag获取Fe3+所需的。
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| 图 3 突变株ΔpiuB的铁载体分泌量分析 Fig. 3 Analysis of siderophore secretory volume in ΔpiuB. A：在CAS检测培养基平板上测定突变株ΔpiuB的铁载体分泌量. B：突变株ΔpiuB铁载体分泌形成的黄色晕圈直径. 晕圈直径与铁载体分泌量呈正相关. **：P < 0.01；n=3 (t检验) A: Determination of siderophore secretory volume in ΔpiuB on CAS detection medium plates. B: Diameter of yellow halo zone formed by siderophore secretion in ΔpiuB. The diameter of yellow halo zone is proportional to the siderophore secretory volume. **: P < 0.01; n=3 (t test). |
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为探究PiuB失活是否影响Xag胞内的渗透平衡，分别测定ΔpiuB、CΔpiuB及野生型菌株在添加不同浓度外源Fe3+条件下的生长能力。试验结果发现，在培养基中添加适量Fe3+ (0.4 mmol/L)时，ΔpiuB菌株的生长活力达到最大，与CΔpiuB及野生型菌株的生长能力基本一致；然而，在培养基中添加低浓度Fe3+ (< 0.4 mmol/L)或高浓度Fe3+ (> 0.4 mmol/L)时，ΔpiuB菌株的生长活力相较于CΔpiuB和野生型菌株均受到明显抑制(图 4)。说明PiuB维持Xag体内的铁稳态。
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| 图 4 在添加不同浓度的外源Fe3+条件下突变株ΔpiuB的生长曲线 Fig. 4 Growth curve of ΔpiuB under the addition of different concentrations of exogenous Fe3+. 将突变株ΔpiuB接种至含不同浓度Fe3+的NY培养基中振荡培养24 h，每3 h测定一次菌株浓度. A：0 mmol/L Fe3+. B：0.2 mmol/L Fe3+. C：0.4 mmol/L Fe3+. D：0.6 mmol/L Fe3+. E：0.8 mmol/L Fe3+. F：1.0 mmol/L Fe3+. n=3 ΔpiuB was inoculated into NY medium containing different concentrations of Fe3+ for shaking culture, and the OD600 of ΔpiuB was measured every 3 h for 24 h. A: 0 mmol/L Fe3+. B: 0.2 mmol/L Fe3+. C: 0.4 mmol/L Fe3+. D: 0.6 mmol/L Fe3+. E: 0.8 mmol/L Fe3+. F: 1.0 mmol/L Fe3+. n=3. |
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为探究piuB基因缺失是否影响Xag对金属离子的敏感性，分别检测Fe3+ (2.5 mol/L)、Cu2+ (1.25 mol/L)、Zn2+ (1.25 mol/L)和Mn2+ (2.5 mol/L)对ΔpiuB、CΔpiuB及野生型菌株的抑制能力。在NA测定平板上，Fe3+、Cu2+、Zn2+和Mn2+对ΔpiuB、CΔpiuB及野生型菌株均能产生较明显的抑菌圈；但是，上述4种金属离子对∆piuB菌株的抑制能力相较于C∆piuB和野生型菌株均显著增强(图 5)。表明PiuB失活可增强Xag对Fe3+、Cu2+、Zn2+和Mn2+的敏感性。
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| 图 5 突变株ΔpiuB对Fe3+、Cu2+、Zn2+和Mn2+的灵敏性测定 Fig. 5 Determination of sensitivity of ΔpiuB to Fe3+, Cu2+, Zn2+ and Mn2+. 在NA测定平板上，各金属离子浓度分别为Fe3+ (2.5 mol/L)、Cu2+ (1.25 mol/L)、Zn2+ (1.25 mol/L)和Mn2+ (2.5 mol/L) In NA determination plates, the concentrations of each metal ions are Fe3+ (2.5 mol/L), Cu2+ (1.25 mol/L), Zn2+ (1.25 mol/L), and Mn2+ (2.5 mol/L), respectively. |
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为探究PiuB失活是否影响Xag抵抗氧化应激的能力，分别检测ΔpiuB、CΔpiuB及野生型菌株对H2O2的敏感性。在NA检测平板上，H2O2对ΔpiuB、CΔpiuB及野生型菌株均能产生较明显的抑菌圈；但是，H2O2对ΔpiuB菌株的抑制能力相较于C∆piuB和野生型菌株明显增强(图 6)。在添加不同浓度的外源Fe3+条件下，Fe3+在一定程度上略微增强了ΔpiuB菌株对H2O2的敏感性(图 6)。揭示PiuB失活削弱了Xag对氧化应激的抗性。
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| 图 6 在添加不同浓度的外源Fe3+条件下突变株ΔpiuB对H2O2抗性的测定 Fig. 6 H2O2 resistance of ΔpiuB was determined under different concentrations of exogenous Fe3+. 在NA测定平板上，所用氧化剂为30%过氧化氢 In NA determination plates, the oxidant used was 30% hydrogen peroxide (H2O2). |
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为探究PiuB失活是否影响Xag的EPS合成，分别将ΔpiuB、CΔpiuB及野生型菌株接种至含2%葡萄糖或蔗糖的NY培养基中，对其EPS产量进行定性/定量分析。试验结果显示：无论是否在测定平板上添加外源Fe3+，∆piuB所形成的菌落相较于CΔpiuB和野生型菌株均明显减小；而且各菌株所形成的菌落均伴随着外源Fe3+浓度的增加而逐渐变小(图 7A)，暗示piuB基因突变可能削弱Xag的EPS合成。为精准评估突变株∆piuB的EPS产量，液体培养后提取EPS称重，发现∆piuB菌株的EPS产量相较于CΔpiuB和野生型菌株显著减少(P < 0.01)；但无论是否添加外源Fe3+，各菌株的EPS产量变化不大(图 7B)。表明PiuB是Xag合成EPS所需的；且适量添加外源Fe3+不影响Xag的EPS产量。
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| 图 7 在添加不同浓度的外源Fe3+条件下突变株ΔpiuB合成EPS的产量 Fig. 7 EPS yield of ΔpiuB under the condition of adding different concentrations of exogenous Fe3+. 在含2%葡萄糖或蔗糖的NY平板或液体培养基中，定性/定量测定突变株ΔpiuB的EPS产量. A：定性测定EPS的产量. B：定量测定EPS的产量. **：P < 0.01；n=3 (t检验) EPS production was detected on NY plates or liquid medium supplemented with 2% glucose or sucrose. A: Qualitative determination of EPS production. B: Quantitative determination of EPS production. **: P < 0.01; n=3 (t test). |
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为探究PiuB失活是否影响Xag的生物膜形成，分别检测ΔpiuB、CΔpiuB和野生型菌株的生物膜形成能力。在L测定培养基中，ΔpiuB菌株形成生物膜的能力相较于CΔpiuB及野生型菌株均显著减弱(P < 0.01) (图 8)。在添加不同浓度的外源Fe3+条件下，∆piuB菌株形成生物膜的能力略有增强，但是仍显著低于CΔpiuB及野生型菌株的形成水平(P < 0.01) (图 8)。这说明PiuB失活显著削弱Xag的生物膜形成能力；但适量添加外源Fe3+可少许提升ΔpiuB菌株的生物膜形成能力。
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| 图 8 在添加不同浓度的外源Fe3+条件下突变株ΔpiuB形成生物膜的能力 Fig. 8 The ability of ΔpiuB to form biofilm under different concentrations of exogenous Fe3+. 在L液体培养基中，检测突变株ΔpiuB的生物膜形成. A：用0.1%结晶紫染色结合于玻璃管壁上的生物膜. B：用A600/OD600比值量化生物膜. **：P < 0.01；n=3 (t检验) Biofilm formation of ΔpiuB was detected in L liquid medium. A: The glass-bound biofilm was stained with 0.1% crystal violet. B: The biofilm is quantified as A600/OD600. **: P < 0.01; n=3 (t test). |
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为探究PiuB失活是否影响Xag的游动性，分别测定ΔpiuB、CΔpiuB及野生型菌株在NY半固体培养基平板上的游动能力。根据试验结果可知，无论是否添加外源Fe3+，∆piuB菌株的游动能力相较于CΔpiuB和野生型菌株明显减弱(图 9)。此外，各菌株的游动能力会伴随着外源Fe3+浓度的增加而逐渐减弱(图 9)。说明PiuB失活削弱Xag的游动性；而且添加外源Fe3+在一定程度上减弱了Xag的游动性。
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| 图 9 在添加不同浓度的外源Fe3+条件下突变株ΔpiuB的游动性测定 Fig. 9 Determination of cell motility in ΔpiuB under different concentrations of exogenous Fe3+. 在含0.5%葡萄糖的NY半固体平板上，测定突变株ΔpiuB的游动能力. A: 0 mmol/L Fe3+. B: 0.4 mmol/L Fe3+. C: 0.6 mmol/L Fe3+ Motility was detected on NY semi-solid plates supplemented with 0.5% glucose. A: 0 mmol/L Fe3+. B: 0.4 mmol/L Fe3+. C: 0.6 mmol/L Fe3+. |
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Fe3+在病原细菌与寄主植物互作过程中至关重要，其缺乏会影响病原菌的生长活力和致病力[21-22]。对于植物病原细菌来说，寄主体内形成的缺铁环境会阻碍病原菌的侵入[23]。为打破宿主体内的Fe3+限制，病原菌进化出一套精密且复杂的Fe3+摄取和调控系统[24]。分泌铁载体是病原细菌摄取外源Fe3+的重要途径[25]。在缺铁条件下，一些病原细菌可合成并分泌一种高亲和Fe3+的低分子量化合物(俗称铁载体)，可协助其从胞外螯合Fe3+供给受体细胞[26]。本研究表明，PiuB是Xag摄取Fe3+的潜在因子，其失活不仅导致菌株的铁载体分泌量激增；而且也增强菌株对Fe3+的敏感性。与其他植物病原黄单胞菌(如Xcc)类似，Fe3+在Xag的生长过程中起重要作用，但适度的Fe3+浓度方可使突变株ΔpiuB正常生长，表明Xag具有精准且灵敏的Fe3+摄取和贮藏系统。其是否通过Fur抑制或者激活piuB基因的转录，严格调控以维持胞内Fe3+浓度的稳态，有待进一步探究。遗憾的是，一直未能获得fur基因缺失突变株，暗示fur可能是Xag的必需基因。
铁稳态在病原细菌抗氧化应激中起重要作用[27-28]。最新研究发现，Fe3+摄取调节子Fur可调节P. aeruginosa的超氧化物歧化酶SodB和过氧化物酶KatG等，在应对氧化应激时发挥作用[29]。研究表明，PiuB失活导致Xag对H2O2的抗性减弱，即抗氧化应激功能下降，这可能与突变株ΔpiuB依赖于Fe3+浓度的生长活力及Fe3+获取有关。推测植物病原细菌在应对氧化应激时可能启动类似的依赖于Fe3+浓度的调节通路。PiuB失活导致Xag的EPS产量减少、生物膜形成受阻，添加外源Fe3+仅可少许恢复生物膜形成能力。但即使外源添加Fe3+恢复突变菌株生长，也无法提高其EPS产量。Fe3+浓度作为一种信号可调控病原细菌的生物膜形成，外源添加适宜浓度的Fe3+可促进某些病原菌形成生物膜[30]；内源性Fe3+缺失则使生物膜无法正常形成[31]。PiuB失活削弱Xag的生物膜形成，除了源于菌株的EPS产量减少[32]，还可能受制于低效的Fe3+摄取[33]。据报道，EPS和生物膜可抵御胞外环境压力[34]，减弱的EPS合成和生物膜形成，在一定程度上或许增强了菌株对胞外环境中高浓度金属离子的敏感性。
PiuB失活削弱了Xag在寄主大豆上的生长能力和致病性。一方面，可能源于piuB基因突变导致菌株的EPS合成、生物膜形成、游动性和淀粉酶活性减少(附图 3已提交至国家微生物科学数据中心，登录号：NMDCX0000229)；另一方面，Xag侵染瞬间可引发寄主体内的ROS暴发[35]，PiuB失活使得突变株的抗氧化应激能力削弱，可能弱化了病原菌在大豆体内的定殖和生长能力，使其致病性下降。PiuB是否还有其他生物学功能，尤其在Fe3+摄取和致病性等方面，仍需进一步研究。
综上所述，PiuB在Xag的生长代谢、致病性等方面至关重要。PiuB是Xag摄取Fe3+的潜在因子，其失活使突变株因Fe3+摄取能力受阻而引发一系列的生物学特性改变，如铁载体分泌量激增、抗氧化应激功能下降、生长迟滞、毒性因子合成受阻和致病性削弱等。该研究将增加对Xag在寄主大豆上致病机制的认知，可为BP病害的生物防治开拓新途径。
| [1] |
GUO W, GAO J, WANG HJ, SU RY, SUN CY, GAO SH, LIU JZ, CHEN GY. Phosphoglycerate kinase is involved in carbohydrate utilization, extracellular polysaccharide biosynthesis, and cell motility of Xanthomonas axonopodis pv. glycines independent of Clp[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 91. DOI:10.3389/fmicb.2020.00091
|
| [2] |
CHATNAPARAT T, PRATHUANGWONG S, IONESCU M, LINDOW SE. XagR, a LuxR homolog, contributes to the virulence of Xanthomonas axonopodis pv. glycines to soybean[J]. Molecular Plant-microbe Interactions, 2012, 25(8): 1104-1117. DOI:10.1094/MPMI-01-12-0008-R
|
| [3] |
苏如意, 王宏杰, 戴潇雨, 高思涵, 王卿怡, 冯超颖, 张萍华, 郭威. 大豆斑疹病菌胞外纤维素酶编码基因的鉴定及其调控分析[J]. 植物病理学报, 2020, 50(3): 292-300. SU RY, WANG HJ, DAI XY, GAO SH, WANG QY, FENG CY, ZHANG PH, GUO W. Identification and regulation analysis of genes encoding extracellular cellulase in soybean pathogen Xanthomonas axonopodis pv. glycines[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2020, 50(3): 292-300 (in Chinese). |
| [4] |
BEGG SL. The role of metal ions in the virulence and viability of bacterial pathogens[J]. Biochemical Society Transactions, 2019, 47(1): 77-87. DOI:10.1042/BST20180275
|
| [5] |
XING YY, XU N, BHANDARI DD, LAPIN D, SUN XH, LUO XM, WANG YQ, CAO JD, WANG HB, COAKER G, PARKER JE, LIU J. Bacterial effector targeting of a plant iron sensor facilitates iron acquisition and pathogen colonization[J]. The Plant Cell, 2021, 33(6): 2015-2031. DOI:10.1093/plcell/koab075
|
| [6] |
TROXELL B, HASSAN HM. Transcriptional regulation by ferric uptake regulator (Fur) in pathogenic bacteria[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2013, 3: 59.
|
| [7] |
RATLEDGE C, DOVER LG. Iron metabolism in pathogenic bacteria[J]. Annual Review of Microbiology, 2000, 54: 881-941. DOI:10.1146/annurev.micro.54.1.881
|
| [8] |
RHODES ER, MENKE S, SHOEMAKER C, TOMARAS AP, MCGILLIVARY G, ACTIS LA. Iron acquisition in the dental pathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans: what does it use as a source and how does it get this essential metal?[J]. BioMetals, 2007, 20(3): 365-377.
|
| [9] |
SMITH AD, WILKS A. Differential contributions of the outer membrane receptors PhuR and HasR to heme acquisition in Pseudomonas aeruginosa[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(12): 7756-7766. DOI:10.1074/jbc.M114.633495
|
| [10] |
CHEN YL, SONG K, CHEN X, LI Y, LV RC, ZHANG QW, CUI YJ, BI YJ, HAN YP, TAN YF, DU ZM, YANG RF, QI ZZ, SONG YJ. Attenuation of Yersinia pestis fyuA mutants caused by iron uptake inhibition and decreased survivability in macrophages[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2022, 12: 874773. DOI:10.3389/fcimb.2022.874773
|
| [11] |
ANDREWS-POLYMENIS HL, BÄUMLER AJ, MCCORMICK BA, FANG FC. Taming the elephant: Salmonella biology, pathogenesis, and prevention[J]. Infection and Immunity, 2010, 78(6): 2356-2369. DOI:10.1128/IAI.00096-10
|
| [12] |
CASSAT JE, SKAAR EP. Iron in infection and immunity[J]. Cell Host & Microbe, 2013, 13(5): 509-519.
|
| [13] |
DAVIES BW, BOGARD RW, MEKALANOS JJ. Mapping the regulon of Vibrio cholerae ferric uptake regulator expands its known network of gene regulation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(30): 12467-12472.
|
| [14] |
PANDEY SS, PATNANA PK, LOMADA SK, TOMAR A, CHATTERJEE S. Co-regulation of iron metabolism and virulence associated functions by iron and XibR, a novel iron binding transcription factor, in the plant pathogen Xanthomonas[J]. PLoS Pathogens, 2016, 12(11): e1006019. DOI:10.1371/journal.ppat.1006019
|
| [15] |
JITTAWUTTIPOKA T, SALLABHAN R, VATTANAVIBOON P, FUANGTHONG M, MONGKOLSUK S. Mutations of ferric uptake regulator (fur) impair iron homeostasis, growth, oxidative stress survival, and virulence of Xanthomonas campestris pv. campestris[J]. Archives of Microbiology, 2010, 192(5): 331-339. DOI:10.1007/s00203-010-0558-8
|
| [16] |
王志鹏, 于海英, 马旅雁. 铜绿假单胞菌铁摄取调节子Fur诱导表达突变株构建及表型分析[J]. 生物工程学报, 2021, 37(9): 3253-3267. WANG ZP, YU HY, MA LY. Construction and phenotypic study of Pseudomonas aeruginosa inducibly expressing a ferric uptake regulator[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(9): 3253-3267 (in Chinese). |
| [17] |
PANDEY SS, CHATTERJEE S. Insights into the cell-to-cell signaling and iron homeostasis in Xanthomonas virulence and lifestyle[J]. Phytopathology, 2022, 112(2): 209-218. DOI:10.1094/PHYTO-11-20-0513-RVW
|
| [18] |
LI YR, ZOU HS, CHE YZ, CUI YP, GUO W, ZOU LF, CHATTERJEE S, BIDDLE EM, YANG CH, CHEN GY. A novel regulatory role of HrpD6 in regulating hrp-hrc-hpa genes in Xanthomonas oryzae pv. oryzicola[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2011, 24(9): 1086-1101. DOI:10.1094/MPMI-09-10-0205
|
| [19] |
ROY S, MITTAL P, TAYI L, BONDADA S, RAY MK, PATEL HK, SONTI RV. Xanthomonas oryzae pv. oryzae exoribonuclease R is required for complete virulence in rice, optimal motility, and growth under stress[J]. Phytopathology, 2022, 112(3): 501-510. DOI:10.1094/PHYTO-07-21-0310-R
|
| [20] |
ROSCH JW, GAO GL, RIDOUT G, WANG YD, TUOMANEN EI. Role of the manganese efflux system mntE for signalling and pathogenesis in Streptococcus pneumoniae[J]. Molecular Microbiology, 2009, 72(1): 12-25. DOI:10.1111/j.1365-2958.2009.06638.x
|
| [21] |
PALMER LD, SKAAR EP. Transition metals and virulence in bacteria[J]. Annual Review of Genetics, 2016, 50: 67-91. DOI:10.1146/annurev-genet-120215-035146
|
| [22] |
ZUGHAIER SM, CORNELIS P. Editorial: role of iron in bacterial pathogenesis[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2018, 8: 344. DOI:10.3389/fcimb.2018.00344
|
| [23] |
LIU Y, KONG DY, WU HL, LING HQ. Iron in plant-pathogen interactions[J]. Journal of Experimental Botany, 2021, 72(6): 2114-2124. DOI:10.1093/jxb/eraa516
|
| [24] |
GANZ T, NEMETH E. Iron homeostasis in host defence and inflammation[J]. Nature Reviews Immunology, 2015, 15(8): 500-510. DOI:10.1038/nri3863
|
| [25] |
HIDER RC, KONG XL. Chemistry and biology of siderophores[J]. Natural Product Reports, 2010, 27(5): 637-657. DOI:10.1039/b906679a
|
| [26] |
MIETHKE M, MARAHIEL MA. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR, 2007, 71(3): 413-451. DOI:10.1128/MMBR.00012-07
|
| [27] |
ANDREWS SC, ROBINSON AK, RODRÍGUEZ-QUIÑONES F. Bacterial iron homeostasis[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2003, 27(2-3): 215-237. DOI:10.1016/S0168-6445(03)00055-X
|
| [28] |
LATIFI A, JEANJEAN R, LEMEILLE S, HAVAUX M, ZHANG CC. Iron starvation leads to oxidative stress in Anabaena sp. strain PCC 7120[J]. Journal of Bacteriology, 2005, 187(18): 6596-6598. DOI:10.1128/JB.187.18.6596-6598.2005
|
| [29] |
PASQUA M, VISAGGIO D, LO SCIUTO A, GENAH S, BANIN E, VISCA P, IMPERI F. Ferric uptake regulator Fur is conditionally essential in Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of Bacteriology, 2017, 199(22): e00472-17.
|
| [30] |
BERLUTTI F, MOREA C, BATTISTONI A, SARLI S, CIPRIANI P, SUPERTI F, AMMENDOLIA MG, VALENTI P. Iron availability influences aggregation, biofilm, adhesion and invasion of Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia[J]. International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 2005, 18(4): 661-670. DOI:10.1177/039463200501800407
|
| [31] |
PATRIQUIN GM, BANIN E, GILMOUR C, TUCHMAN R, GREENBERG EP, POOLE K. Influence of quorum sensing and iron on twitching motility and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of Bacteriology, 2008, 190(2): 662-671. DOI:10.1128/JB.01473-07
|
| [32] |
MA LZ, WANG D, LIU YW, ZHANG ZY, WOZNIAK DJ. Regulation of biofilm exopolysaccharide biosynthesis and degradation in Pseudomonas aeruginosa[J]. Annual Review of Microbiology, 2022, 76: 413-433. DOI:10.1146/annurev-micro-041320-111355
|
| [33] |
SINGH PK, PARSEK MR, GREENBERG EP, WELSH MJ. A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development[J]. Nature, 2002, 417(6888): 552-555. DOI:10.1038/417552a
|
| [34] |
LIMOLI DH, JONES CJ, WOZNIAK DJ. Bacterial extracellular polysaccharides in biofilm formation and function[J]. Microbiology Spectrum, 2015, 3(3). DOI:10.1128/microbiolspec.MB-10.1128/microbiolspe0011-2014
|
| [35] |
MITTLER R, ZANDALINAS SI, FICHMAN Y, van BREUSEGEM F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2022, 23(10): 663-679.
|