2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 周晞雯, 马力群, 朱鸿亮
- ZHOU Xiwen, MA Liqun, ZHU Hongliang
- 基于转录组测序分析沉默番茄中RNA结合蛋白基因SlRBP1对其光合作用的影响
- Investigating the impact of silencing an RNA-binding protein gene SlRBP1 on tomato photosynthesis through RNA-sequencing analysis
- 生物工程学报, 2024, 40(1): 150-162
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(1): 150-162
- 10.13345/j.cjb.230387
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文章历史
- Received: May 22, 2023
- Accepted: July 11, 2023
引用本文
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2050年全球人口预计将超过98亿，粮食需求预计将增长70%。如今，人类的食物主要来自农业，提高农作物产量成为亟待解决的问题。番茄(Solanum lycopersicum L.)是典型的模式作物，也是第二大商业消费蔬果。番茄果实含有多种营养成分，包括维生素C、番茄红素、有机酸、糖、膳食纤维和类胡萝卜素等，日常摄入番茄有益于人体健康。然而，番茄是一类需要高光照强度，才能维持正常生长发育的喜光植物，弱光和不适宜的光周期均会导致番茄果实品质劣变及产量降低[1]。光合作用直接影响植物的有机物合成及积累，通过对光合作用机理的深入探究，有望获得提高光合转化效率、高效增产的农业作物。有研究提出通过C3和C4作物品种的潜在操纵靶点增强叶片光合作用，提高冠层光合作用，进而提高作物的产量[2]。尽管作物生长、发育动态和主要环境相互作用产生的反馈效应导致光合作用不一定直接影响作物产量，但是增强光合作用仍然是提高植物产量最有效的途径之一[3]。调控光照强度、红蓝光比例和光照时间都被证明对植物的有机物积累具有正向调控作用，盐胁迫等条件则从另一角度影响植物的光合强度[4-5]。一定范围内提高光强能够提高植物光合速率，并提高叶片中纤维素、维生素C、总酚、可溶性糖、可溶性蛋白和游离氨基酸含量[6]。叶绿体是植物光合的主要场所，发育中的叶片光合作用强度的变化与叶绿体的结构发育和光合作用所需酶和代谢物的积累有关。直到叶片发育成熟，核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1, 5- bisphosphate arboxylase/oxygenase, Rubisco)蛋白、叶绿素、糖和淀粉才正常积累[7]。因此要获得高产的植物，就需要解析光合机制，提高光合速率。
RNA结合蛋白(RNA binding proteins, RBPs)在植物产量、抗病性和耐旱性等农业性状中发挥关键作用[8]。在植物中，甘氨酸富集的RNA结合蛋白(glycine-rich RNA binding protein, GRP)家族成员，如拟南芥的AtGRP2和AtGRP7[9]，水稻的OsGRP1、OsGRP4和OsGRP6[10]等，参与许多细胞过程，如花粉水合和竞争、原木质部生长、细胞伸长、根长短决定、种子萌发、开花和昼夜节律[11-12]。此外，它们还参与了对各种非生物胁迫的反应，包括寒冷、冷冻、干旱、盐胁迫和病原感染等[13]。而RBPs在植物光合中的具体功能仍缺乏相关研究。SlRBP1是一种甘氨酸富集的RNA结合蛋白，本研究采用高通量测序技术及生物信息学方法探究在番茄中沉默SlRBP1对番茄植株的影响，并且对amiR-SlRBP1沉默植株中差异表达基因进行筛选，利用实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR, RT-qPCR)验证基因差异表达规律。结合amiR-SlRBP1沉默植株的生理指标及表型，分析SlRBP1对植物光合造成的影响。本试验探索沉默SlRBP1影响植物光合作用的分子机制，为揭示光合作用对番茄产量影响提供理论和试验依据。
1 材料与方法 1.1 植物材料番茄品种选取Alisa Craig (AC)，种子为本实验室保存。种植土壤是商业化的番茄培养土(含蛭石、黑土和黄土)，于光周期16 h/8 h、温度22−26 ℃、湿度40%−50%环境培养。番茄叶片材料取样于种植在土壤中发芽一月时的AC及amiR-SlRBP1沉默植株，表达量鉴定及测序样品为第5枝上3叶或4叶位完全展开的叶片，剪下后直接在液氮中冷冻。番茄果实材料均为经过疏花疏果后每穗保留的4枚果实。
1.2 实验方法 1.2.1 植物组织培养植物组织培养方法采用叶盘法，参照已发表文章[14]。经过植物组织培养共获得18株SlRBP1表达效率降低的T0代植株，选择其中沉默效率超过90%的植株的种子种植T1代后进行本文中的实验。amiR-SlRBP1沉默T1代植株种植于北京市小汤山特菜大观园，共种植36株。
1.2.2 株高及果形测定株高：用卷尺测量从番茄茎基部到生长点的高度，保留两位小数(cm)；
果径：利用游标卡尺测得番茄果实赤道处的直径(mm)，每个果实测3次取平均值；
果实色差：使用色差仪对果实赤道处颜色进行测量，每个果实测3次取平均值。株高图片及果实图像均使用相机拍摄，实验使用的番茄均为同时期收获。
1.2.3 叶绿素含量测定叶绿素的提取与测定参照国家标准NY/T 3082–2017。
液氮研磨新鲜的番茄果皮，称取1 g粉末加入15 mL离心管中，然后迅速加入10 mL提取液，涡旋10 s混匀。将离心管置于4 ℃冰箱中，避光静置提取过夜。4 ℃、5 000×g离心10 min。使用提取液作空白溶液进行调零，再吸取上清分别测定上清在470、645、663 nm的吸光值。每组测3个生物学重复，每个生物学重复取2次上清进行技术重复。
计算叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素的总含量，公式如下：
叶绿素a含量(mg/kg)=[(12.72×A1)−(2.59× A2)]×V/m
叶绿素b含量(mg/kg)=[(22.88×A2)−(4.67× A1)]×V/m
叶绿素总含量(mg/kg)=[(8.05×A1)+(20.29× A2)]×V/m
式中，A1：上清在663 nm处的吸光度值；A2：上清在645 nm处的吸光度值；V：试液的体积，单位为毫升(mL)；m：试液质量，单位为克(g)。
1.2.4 叶绿素荧光成像本试验叶绿素荧光成像参照已报道的方法[15]。叶绿素荧光测量使用多相荧光闪光(multiphase fluorescence flash, MPF)测量技术，植株整体需要经过30 min预黑暗处理。实验叶片为最年轻的完全展开叶，即番茄植株第5枝上第3或第4叶位完全展开的叶片。测量光强为1 μmol/(m2∙s)，饱和光强为8 500 μmol/(m2∙s)。利用软件控制开关，使用ImagingWin读取所拍摄图像中样品的PSII最大光化学效率(Fv/Fm)的参数值，取叶片上随机3个点的平均值。
1.2.5 光合速率测定方法参照Zhang等发表的文章并根据检测时环境条件稍作修改[4]。使用LI-6400XT光合作用系统(Li-Cor Biosciences, Lincoln)，并配备叶室荧光计(Li-Cor Part No.6400-40，封闭叶面积：2 cm2)对第5枝上3叶或4叶位完全展开的叶片进行光合气体交换和叶绿素荧光测量。所有测量均在叶温25 ℃、叶-空气蒸汽压差0.7− 1.0 kPa、空气通过系统的流速为400 μmol/s的条件下进行。
1.2.6 RT-qPCR方法野生型及amiR-SlRBP1沉默植株的叶片RNA使用Omega R6827 RNA提取试剂盒提取，琼脂糖凝胶电泳确定RNA完整性。以Actin为内参基因，利用RT-qPCR观察各基因表达量，所需引物序列见表 1。
| Gene | Forward primer (5′→3′) | Reverse primer (5′→3′) |
| Actin-Solyc11g005330 | CAGCAGATGTGGATCTCAAA | CTGTGGACAATGGAAGGAC |
| PsaE-Solyc09g063130.2 | TTTTCTGGCAACTTTCTCCCC | TTGGGGGTTCTGATCATTCTTT |
| PsbP-Solyc07g044860.2 | ATGGATTCAAGCTCCAAGTCC | GTAGTCGGTGATGGACTTCTTG |
| PsbQ-Solyc02g079950.2 | GTTGCTAAAGCAGCTTTTGCT | TCCTTAACTCTCTGGGCTGC |
| PsaL-Solyc06g082940.2 | GGTGATCCTTAGCATGTGTTTG | CCACCAGTGAATTTAGCCCAT |
| PsbY-Solyc10g077120.1 | CCTCCCCAAAGGTCTCTTAACT | CCCTGTTATCTCCTCCTTCAGC |
| L1-Solyc02g068740.2 | TGCTGTTGAAAGTGTCAAGGC | TCAGGGTCCATCAATGCTTTG |
| L2-Solyc11g011380.1 | ATTGTTGACGCCCATTACAAG | CAGCAATCTCTGCAATCCTCTC |
| L3-Solyc06g069730.2 | ACTTGAGATGGTTTGTTCAGGC | TTGACGATGATGCAAAGTAGTCTG |
| H1-Solyc10g055800.1 | GATAACACTGCACGAAAAAGGG | CAAGGCCATTGACTACTTGGT |
| H2-Solyc00g174340.1 | AGCACAAAACTATGCCAACTCA | ACCAACACATTGGTTGGTAGC |
| H3-Solyc02g082920.2 | GGTATTGGTGTTGGACAAGAGT | GGCGTCCATTGTCCAATGAT |
| L1−L3: Gene expression decreased groups; H1−H3: Gene expression increased groups. | ||
进行去除接头等处理后得到的clean data利用FASTQC确认clean data质量达到要求后，通过WinSCP软件将clean data上传至服务器，并使用服务器中的bowtie2软件建立番茄基因组(SL2.4)和基因组注释(SL2.4)之间的索引。通过TopHat2软件分别将不同样品的clean data比对到番茄基因组上；利用Feature Counts程序包计算每个基因的表达值，然后通过DESeq2程序进行基因表达量的归一化处理，得到csv格式的基因列表，以P-adjust < 0.05且|log2(fold change)| > 0为标准进行差异基因的筛选，得到野生型与沉默植株样品之间变化差异显著的基因列表。利用GO和KEGG数据库比对获得基因功能注释。
1.3 数据处理所有试验均进行3次生物学重复，使用Excel及PowerPoint进行数据统计和图表制作。本文试验结果的数据统计和差异分析及作图均使用GraphPad Prism 8.3.0软件，其中两两比较采用独立样本t检验，多重比较采用单因素方差分析中的Duncan检验。
2 结果与分析 2.1 沉默SlRBP1引起番茄果实形态缩小实验室前期已发表的人工小干扰RNA载体使micro-Tom植株出现黄化表型，利用该载体在AC中实施植物组织培养，通过对其表型观察可知植物叶片黄化的表型具有稳定遗传能力(图 1A)。本研究对32株amiR-SlRBP1沉默植株的T1代植株中的第2−4穗果都进行疏花及疏果，使每一穗上均结出4个番茄。对沉默效率较高的T1代沉默植株番茄红熟时期的果实进行果径(mm)及果重(g)的测量(图 1E)，发现敲低SlRBP1沉默植株的果实横径及纵径均显著减小。
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| 图 1 沉默SlRBP1使番茄果实变小 Fig. 1 Silencing SlRBP1 makes fruits smaller. A: The expression of gene SlRBP1 in amiR-SlRBP1 plants. ****: P < 0.000 5; ***: P < 0.001; **: P < 0.01. B: Comparison of tomato fruit from AC and amiR-SlRBP1 silenced plants (Mature green, MG; Breaker, Br/B; Red ripe, RR). C: Leaf phenotypes of 1-month-old AC and T1 amiR-SlRBP1 silenced plants. D: Sectional views of red ripe fruits from AC and amiR-SlRBP1 silenced plants. E: Diameter, longitudinal diameter, fruit shape index and quality of fruits from AC and amiR-SlRBP1 silenced plants. A：amiR-SlRBP1沉默植株中SlRBP1表达量. ****：P < 0.000 5；***：P < 0.001；**：P < 0.01. B：AC及amiR-SlRBP1沉默植株番茄果实对比(绿熟期：mature green，MG；破色期：breaker，Br/B；红熟期：red ripe，RR). C：1月龄AC及T1代amiR-SlRBP1沉默植株叶片表型图. D：红熟时期AC及amiR-SlRBP1沉默植株果实横剖面图. E：番茄果实横径、纵径、果形指数及质量 |
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果形指数(shape index)即果实纵径与横径的比值，是衡量果实形状的指标。本研究表明AC果实和沉默植株果实的果形指数也具有差异，且果实重量也显著降低，沉默SlRBP1对番茄果实的整体发育具有负面影响。直接观察绿熟、破色及红熟等多时期果实(图 1B)也可得出番茄果实整体变小的结论。观察红熟野生型番茄与沉默植株果实的横剖面(图 1D)可知，SlRBP1表达量降低后番茄果实中产生的种子数量也相应减少，且存在发育不良导致没有种子的果实。
2.2 沉默SlRBP1导致植株光合速率降低植物的光合作用能够在植物体内进行有机物的储存，直接影响果实产量。沉默SlRBP1后，番茄植株出现叶片黄化表型，而正常番茄的成熟叶片主要由叶绿素a/b进行显色，故而对叶片的叶绿素分布进行探究。如图 2A所示，在叶片的荧光成像图中选取3个等面积区域，利用ImagingWin读取Fv/Fm值，并作图。对同时期AC和amiR-SlRBP1植株叶片的叶绿素含量进行测量，见表 2，叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素在amiR-SlRBP1中的含量显著低于AC中的含量。由叶绿素荧光成像可知，AC叶片和amiR-SlRBP1沉默植株的叶片均没有坏死、病害等胁迫，是正常生长的健康叶片，那么这些叶片测量的Fv/Fm即为具有可信度的有效数据。并且AC叶片中叶绿素分布均匀，Fv/Fm稳定保持在0.8−0.9之间，参考已有报道是健康番茄叶片的正常值[16]。而amiR-SlRBP1沉默植株叶片呈现叶绿素分布不均匀，且Fv/Fm仅为AC叶片的一半以下，约在0.3−0.4之间，可见其光合性能损伤程度高。透射电镜观察(图 2D)发现amiR-SlRBP1沉默植株的叶绿体形态变化，边缘不清晰且内部缺少成形的基粒。
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| 图 2 沉默SlRBP1降低叶绿素水平及光合作用速率 Fig. 2 Silencing SlRBP1 reduces chlorophyll level and photosynthesis rate. A: Comparison of chlorophyll fluorescence imaging Fv/Fm and leaf images. B: Photosynthetic rate (A) and stomatal conductance (gsw) measured in AC and SlRBP1 silenced plants of tomato at certain flow rates. C: Histogram of chlorophyll fluorescence imaging Fv/Fm. ***: P < 0.001. D: Transmission electron microscopy observation of chloroplast morphology in mature leaves of AC and SlRBP1 silenced plants, bar=5 μm. A：叶绿素荧光成像Fv/Fm及叶片图像对比图. B：AC及SlRBP1沉默植株番茄在流量一定时测量所得光合速率(A)及气孔导度(gsw). C：叶绿素荧光成像Fv/Fm柱状图. ***: P < 0.001. D：透射电镜观察野生型及沉默植株成熟叶片叶绿体形态，标尺=5 μm |
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| Type | Chl a (mg/g) | Chl b (mg/g) | Chl a+b (mg/g) | Chl a/b | Carotenoids (mg/g) |
| AC | 2.63±0.01 | 0.99±0.06 | 3.62±0.06 | 2.66±0.18 | 0.46±0.01 |
| amiR-SlRBP1 | 1.76±0.11**** | 0.65±0.04** | 2.15±0.09**** | 2.31±0.10* | 0.34±0.34*** |
| The differences in pigment content between AC and amiR-SlRBP1 were analyzed using T-test, Chl is the abbreviation of chlorophyll, *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ****: P < 0.000 5. | |||||
对光合速率直接测定可知(图 2B)，当单位面积叶片上单位时间内通过气体量一致时，amiR-SlRBP1沉默植株的叶片气孔导度明显降低，光合速率也显著降低。以上情况均表明在amiR-SlRBP1沉默植株中仅能进行较弱的光合作用。
2.3 转录组数据分析及GO富集差异基因转录组数据显示，以P-adjust < 0.05，log2(fold change)| > 0作为筛选标准，amiR-SlRBP1对比AC得到514个上调基因和439个下调基因。GO富集分析(图 3)表明，差异基因主要富集到10个生物学过程、10个细胞组分和10个分子功能条目中。生物学过程中，富集最多的GO条目是翻译、多肽生物合成过程和酰胺生物合成工艺。细胞组分中，富集基因最多的是核糖核蛋白复合物，而类囊体、光系统均在细胞组分中占据较多条目。分子功能中，差异基因主要富集在结构分子活性和DNA指导的RNA聚合酶活性这两类。在GO富集分析中，富集基因数量达到51个的有3类：翻译、多肽生物合成过程和酰胺生物合成，并筛选得到22个与光合作用相关的富集基因。
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| 图 3 转录组测序数据差异表达基因分析(differentially expressed genes, DEGs)分析 Fig. 3 Analysis of differentially expressed genes (DEGs) with RNA-seq data. A: Volcanic plot of DEGs. B: The GO terms of the DEGs. C: Bubble chart of DEG GO enrichment. D: Bubble chart of DEGs KEGG pathways. A：DEGs的火山图. B：差异基因GO分类. C：差异基因GO富集气泡图，图例中基因编号1−20同B. D：差异基因KEGG富集气泡图 |
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KEGG通路富集以P-adjust < 0.05作为显著性富集的阈值，在KEGG通路富集的20类差异基因中，第2类光合作用(番茄)、第12类光合生物中的碳固定均与光合作用相关。其中，被富集到的基因数量最多的包括光系统Ⅰ相关及类囊体相关基因。根据测序结果，富集得到的光合相关基因表达量均下降。为验证转录组测序结果的可靠性，挑选KEGG通路富集的基因中显著上调的3个与显著下调的3个设计引物进行RT-qPCR。用PEARSON分析表中基因表达水平，RNA-seq和RT-qPCR相对表达水平之间的相关系数达到显著水平(r=0.743 0, P=0.008 8)，表明RNA-Seq数据可靠，转录组数据能反映SlRBP1沉默植株的基因表达水平变化。
光合相关显著下调基因13个，包括光系统I反应中心亚基Ⅳ A PsaE、光系统Ⅱ氧演化复合体蛋白PsbP、胞浆蓝蛋白(Solyc04g082010.1)、光系统Ⅱ氧演化复合体蛋白PsbQ、光系统I反应中心亚基Ⅺ PsaL、铁氧化还原蛋白(Solyc11g068430.1)、光系统Ⅱ核心复合体蛋白PsbY等。利用RT-qPCR对测序结果中表达量降低的光合系统的部分基因进行验证，以Slactin作为内参基因，RT-qPCR结果如图 4所示。
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| 图 4 RT-qPCR验证光合相关基因表达水平 Fig. 4 Expression level of photosynthesis-related genes by RT-qPCR. Analysis of the expression of the same gene in AC and in amiR-SlRBP1 silenced plants using t-test, ****: P < 0.000 5; ***: P < 0.001. 使用t-test分析同一基因在AC和在amiR-SlRBP1沉默植株中的表达量，****：P < 0.000 5；***：P < 0.001 |
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植物的光合作用是植物固定有机物的生理活动，光合作用的效率直接影响农作物的产量。植物光合色素主要包括叶绿素和类胡萝卜素，而色素含量决定叶片呈现的颜色。当叶绿体数量大幅减少或结构被破坏可能导致白化突变体产生，叶绿素的合成受到阻碍，且类胡萝卜素含量过高则会引起植株叶片呈现黄化表型。叶绿素在光吸收中起关键作用，光合能力随着叶绿素含量的增加而增加[17]。叶绿素a和叶绿素b主要分布在叶绿体的类囊体膜上，参与光合作用的光能吸收、传递与转换。本试验获得的SlRBP1沉默植株的叶绿体内类囊体数量极少、类囊体不能堆叠形成基粒、叶绿素含量显著降低，从而展现黄叶表型。
前期研究表明，番茄果实的产量和品质与叶片的光合作用强度紧密相关[18]。通过补充光源能够加速植株生长和果实成熟，给番茄植株补充冠层内LED照明，发现下、中冠层叶片气孔导度和光合作用碳吸收/同化能力显著增强，且果实产量显著提高[19]。此外，果实鲜重也受到番茄的光合作用速率提高的正向影响[20]。
光合系统由光合系统Ⅰ (photosynthetic system I, PSI)和光合系统Ⅱ (photosynthetic system Ⅱ, PSII)组成。本研究中显著降低的基因包括PsaE、PsaL和两种铁氧还蛋白，PsaE和PsaL都是光合系统I的组成部分。含氧光合作用包括光反应和暗反应，光反应从光子吸收开始，驱动光合作用中的电子传递链，一直到最终的电子载体蛋白铁氧化还原蛋白1 (ferredoxin, Fd)[21]。PsaL在单体之间的界面处形成连接域，在结构上和功能上连接光合系统I单体。而PsaE是PSI的受体位点亚基，位于光合系统I基质外侧，含有一个可以与铁氧还蛋白独立结合的对接位点。PsaE在铁氧还蛋白的锚定和电子传输中具有重要功能[22]。研究表明PsaE的存在有利于光合电子传递和光抑制条件下光合相关结构的稳定性[23]。PsaE与PsaL基因表达量的降低都表明光合系统Ⅰ的光合水平下降。
RNA-seq数据也表明光合系统Ⅱ受到影响。光合系统Ⅱ是一种嵌入在光合生物类囊体膜中的蛋白质复合物，它将光驱动的水氧化成启动光合过程的电子和氧分子[24]。存在于绿色植物谱系中的PsbP、PsbQ和PsbR亚基组合有助于提高析氧能力。在高等植物PSII中，Ca2+和Cl−在光合作用放氧中心(oxygen-evolving center, OEC)的进入和保留受到PsbP (23 kDa)和PsbQ (17 kDa)亚基的调节[25]。PsbY被证明位于PSII的外围，主要分布在细胞色素B559的两个α螺旋附近，其N端位于类囊体表面。拟南芥中的PsbY对Cytb559的氧化还原特性很重要，可能直接或间接地与其血红素基团相互作用[26]。PSⅡ蛋白复合物的显著下调可能导致基粒的错误堆叠，本研究中的电镜结果符合该描述[27]。
分子水平上的调控对植物的光合作用速率造成影响。杨树中PtrCHLP3基因的沉默通过减少植物叶绿素的合成，阻碍了光合作用过程中的电子传递，从而抑制植株生长[28]。本文中SlRBP1沉默植株的果实表现出体积减小、质量降低、种子数量减少的特征。这表明沉默SlRBP1对番茄果实的农产品价值造成负面影响，通过减弱光合作用使植物产量降低。
综上，amiR-SlRBP1沉默番茄植株相较于相同光照条件下培养的AC，呈现出因光合作用减弱引起的发育受损，叶绿素含量降低导致叶片黄化以及番茄果实鲜重降低、体积减小、整体产量降低的表型。本试验揭示了SlRBP1对AC番茄产量造成的影响，进一步验证了番茄产量直接受到光合作用的影响，为进一步探究RNA结合蛋白与植物光合作用之间的联系提供了理论基础。
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