2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李心蕊, 李文芳, 霍嘉兴, 李龙, 陈佰鸿, 郭志刚, 马宗桓
- LI Xinrui, LI Wenfang, HUO Jiaxing, LI Long, CHEN Baihong, GUO Zhigang, MA Zonghuan
- 苹果柠檬酸合酶3基因家族成员鉴定及表达分析
- Identification and expression analysis of citrate synthase 3 gene family members in apple
- 生物工程学报, 2024, 40(1): 137-149
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(1): 137-149
- 10.13345/j.cjb.230166
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文章历史
- Received: March 5, 2023
- Accepted: May 22, 2023
- Published: May 25, 2023
引用本文
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2. 天水师范学院生物工程与技术学院, 甘肃 天水 741000
2. College of Biotechnology and Technology, Tianshui Normal University, Tianshui 741000, Gansu, China
柠檬酸合酶(citrate synthase 3, CS3)是细胞内多种重要代谢途径的关键酶。CS3催化了草酰乙酸和乙酰辅酶A之间的缩合反应，从而促进了柠檬酸和辅酶A的生成。该催化剂对底物具有选择性好、催化活性高的优点，在医药和食品加工领域有着广泛的应用前景。作为细胞代谢途径中的重要酶之一，CS3的活性调节着生物体的物质和能量代谢过程，而CS3的活力则受到运动、神经刺激和激素分泌等一系列生理过程的影响而发生变化。
苹果(Malus×domestica Borkh.)为蔷薇科苹果属植物，分布广泛，苹果果实中富含维生素和矿物质，为人们最常食用的水果之一。近年来，苹果产业发展迅速，苹果品种的多样化、品质的差异化都是不同苹果品种性质差异的体现。苹果酸、柠檬酸和奎宁酸等有机酸对水果的感官品质有很大影响，是水果风味形成的关键成分[1]。苹果酸和柠檬酸是成熟苹果果实以及许多其他肉质果实中的主要有机酸[2]。2种酸在果实细胞中的积累是发生在细胞不同区域的几个相互关联的过程的结果，并且受到许多因素的控制[3]。
柠檬酸合酶是一种高度保守的酶，几乎遍布于所有生物体内，其参与的生理过程包括线粒体能量代谢、种子萌发、植物生长发育以及抗逆等多个方面。研究发现，通过农杆菌介导法导入外源基因CS到水稻基因组中，改善了水稻低磷敏感性能[4]；油茶受到低磷胁迫后根系的CoCS基因的表达受到低磷诱导，表达量呈现先升高后降低的趋势[5]；控制CS基因的过量表达可更有效地增加转基因烟草中CS的酶活性及叶片中柠檬酸的合成量，同时也能更有效地提高转基因烟草柠檬酸的分泌量，从而增强其对铝毒害的抵御能力[6]；紫花苜蓿的耐铝性和对磷的吸收方向的研究已取得初步进展[7]；甜橙叶片中柠檬酸合酶基因的表达与果实酸含量呈正相关[8]；香蕉果实成熟与CS基因的关系研究已经取得初步进展[9]；柠檬酸在许多果实中占重要地位，柠檬酸的含量会影响果实的口感和酸度，在榔梅、酸橙、草莓中已有柠檬酸活性与果实品质的相关关系的研究[10-12]；在相关研究中已经发现植物根瘤固氮与柠檬酸合酶有关[13]；此外种子的萌发也受到柠檬酸合酶的影响[14-15]。综上所述，该酶基因对掌握苹果生长发育的调控机理与果实的品质均有重要的研究意义。但有关CS家族基因的序列特性、组织表达特性和不同酸含量苹果中的表达模式尚未见报道。本研究采用生物信息学方法，对苹果CS3基因家族成员进行鉴定和序列分析比较，分析苹果CS3基因家族成员组织表达特异性，并测定不同品种中苹果的酸含量，为进一步研究苹果CS3家族成员的结构与功能，并应用于苹果品种的遗传改良提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 材料和处理试验材料为静宁县果树果品研究所的‘艾斯达’和‘成纪1号’苹果果实。2021年10月分别取已经成熟的‘艾斯达’和‘成纪1号’苹果的果皮和果肉各1 g，设置5个生物学重复，液氮速冻后置于−80 ℃超低温冰箱贮藏，用于苹果CS3基因的表达水平分析。
1.2 苹果CS3基因家族成员鉴定从NCBI在线数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找苹果CS3基因的基因号。在Pfam (https://pfam.xfam.org/)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/save_-user_preferences.pl)数据库中将没有特定结构域或结构域不完整的基因去除。最后筛选得到6个苹果基因家族成员，从苹果基因组数据库下载编码序列(coding sequence, CDS)、基因全长和蛋白序列。将获得的CDS输入到苹果基因库中，获得苹果CS3基因组成员信息(http://www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl)。
1.3 苹果CS3基因家族进化关系、基因结构、motif序列及生物信息学分析基于ExPASy数据库(https://web.expasy.org/ protparam/) Protparam在线软件分析蛋白质等电点、氨基酸数量、脂肪系数、氨基酸大小、不稳定性系数及分子量等基本信息，通过MEGA 5.0及clustalx.exe分析蛋白系统进化关系，通过邻接法建立系统进化树，通过SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_-hnn.html)在线分析软件预测蛋白质二级结构。用MEME (http://memesuite.org/)在线程序分析CS3基因家族保守基序[16]，将预测基序Motif的数目设定为10个，使用在线软件GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)来展示基因结构。用PlantCARE (http://bioin-formatiCS.psb.ugent.bewebtoolsplantcarehtml)预测并分析苹果CS3基因家族起始密码子上游2 kb的碱基片段顺式作用元件的分布情况，采用WoLF PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html)进行亚细胞定位分析。
1.4 苹果CS3基因家族的实时荧光定量PCR分析利用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的植物萃取试剂盒RNAPlant-RTR2303进行了苹果果皮和果肉RNA的提取。引物设计通过生工生物工程(上海)股份有限公司(https://www.sangon.com/newPrimer Design)的在线软件完成(表 1)，并由该公司合成。cDNA的合成使用M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)反转录聚合酶的反转录试剂盒，反转录合成的cDNA产物可直接用于实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测，并将反转录产物保存在−20 ℃冰箱。qRT-PCR使用Light Cycler® 96 RealTime PCR System(Roche)型实时定量PCR仪，使用所设计的引物，进行PCR扩增，其中，以苹果GAPDH基因为内参基因，整个扩增体系为20 μL，含有2 μL cDNA，上游和下游引物各1 μL, SYBR MIX 10 μL，ddH2O 6 μL；反应步骤为：95 ℃变性30 s；95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，进行40个循环。试验设置3个重复，应用2─ΔΔCT方法，计算各基因的相对表达量。
| Gene | Forward primer (5ʹ→3ʹ) | Reverse primer (5ʹ→3ʹ) |
| MdCS3.1 | CTTTCCAAGCTCCGTTCTCGTCTC | ATCTGTGGAGGTCTGCGTTTGAATC |
| MdCS3.2 | AGGGTCTTCTGTGGCTGCTTTTAAC | GGCACGAGTCCTCAATTCCTTGG |
| MdCS3.3 | CACCTGGTACTATGCGTTCTCTTGG | CACCTGGTACTATGCGTTCTCTTGG |
| MdCS3.4 | TTGTGGTTCAAGCGTAGCCTTCC | GCCAGCCCTAGCAGTTACTATTGAG |
| MdCS3.5 | GAGGGATGCTGGTGCTGTTGTTC | ATCTTCAGGGATTTGTGGAGGCTTG |
| MdCS3.6 | CGGTAAGAGGTATCAGGTCCAGGTC | CGAACAGGGGCGGTATTAAGATAGC |
| GAPDH | CATTCATCACCACCGACTACA | GAAGGGTCTTCTCATCCTTGAC |
剔除试样的非可食部分，分别取‘艾斯达’和‘成纪1号’的果皮和果肉各1 g切碎混匀，置研钵中研碎，用5 mL水洗入10 mL容量瓶，置85 ℃水浴30 min，期间摇动数次，取出冷却，加水至刻度，摇匀过滤，吸取滤液5 mL放入烧杯中，加酚酞指示剂2滴，用0.1 mol/L NaOH滴定，直至呈淡红色30 s不褪色为终点，记下NaOH液用量，重复滴定3次，取其平均值。
计算公式：
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式中，VT：样品提取液总体(mL)；VB：滴定时所取滤液体积(mL)；c：NaOH滴定液浓度(mol/L)；VA：滴定滤液消耗的NaOH溶液体积(mL)；m：样品质量(g)。
1.6 试验数据统计与分析使用Excel 2010处理试验数据，并用Origin 2018绘图，利用SPSS v.22.0进行统计分析，使用单因素ANOVA的Duncan比较差异显著性(P < 0.05)。
2 结果与分析 2.1 苹果CS3基因家族的系统进化关系从苹果基因组序列中鉴定得到6个CS3家族成员。为分析蛋白间的系统进化关系，采用MEGA 5.0和clustalx.exe分析软件对6个苹果的6个CS3与山茶(CsCS)、大豆(GmCS3)、甜橙(CitCS)、桃(PpCS)、香蕉(MaCS)、亚麻荠(CcCS)和拟南芥(AtCS, AtCS1, AtCS2, AtCS5)等的CS3蛋白序列进行比对分析和系统进化树构建。如图 1所示，根据亲缘关系将所有CS3蛋白分成3组，MdCS3.1–3.6基因分别位于进化树3大分支上，与拟南芥和桃聚类在同一类群，距离最近。
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| 图 1 苹果CS3基因家族的系统进化关系 Fig. 1 Phylogenetic relationship of CS3 gene family in apple. |
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利用拟南芥、苹果氨基酸序列在苹果基因组网站BLAST进行比对，去除重复序列，依据苹果CS3筛选，共获得6个苹果CS3基因。依据染色体位置，将登录号分别为Md00G1055300、Md02G1319300、Md09G1156400、Md13G1153500、Md16G1154000和Md17G1142900的CS3基因家族成员依次命名为MdCS3.1–3.6 (表 2)。对苹果CS3基因家族蛋白质理化性质分析可知，其编码的氨基酸数量以473–608 aa为主，MdCS3.4蛋白的氨基酸序列最长，MdCS3.1和MdCS3.2蛋白的氨基酸序列等长且最短，其分子量为52 606.80–65 903.68 kDa，等电点为7.21–8.82，不稳定系数为27.66–37.80，表明这类蛋白大都为不稳定蛋白，脂肪系数为91.60–96.62。对该基因家族成员进行亚细胞定位分析得出MdCS3.1、MdCS3.2和MdCS3.5基因主要位于线粒体，MdCS3.3、MdCS3.4和MdCS3.6基因主要位于叶绿体。
| Gene | Gene accession No. | Amino acid |
Molecular weight (kDa) |
pI | The instability index | Aliphatic index | Subcellular localization |
| MdCS3.1 | Md00G1055300 | 473 | 52 606.80 | 8.82 | 27.66 | 96.62 | Mitochondria |
| MdCS3.2 | Md02G1319300 | 473 | 52 648.65 | 7.21 | 28.01 | 95.60 | Mitochondria |
| MdCS3.3 | Md09G1156400 | 514 | 56 806.22 | 8.79 | 36.61 | 91.89 | Chloroplast |
| MdCS3.4 | Md13G1153500 | 608 | 65 903.68 | 7.56 | 32.64 | 92.24 | Chloroplast |
| MdCS3.5 | Md16G1154000 | 608 | 65 851.50 | 7.56 | 31.27 | 91.60 | Mitochondria |
| MdCS3.6 | Md17G1142900 | 512 | 56 532.81 | 8.79 | 37.80 | 92.05 | Chloroplast |
通过对苹果CS3基因家族的蛋白质二级结构进行预测分析，发现其主要成分为α-螺旋，然后是无规则卷曲，而β-转角所占的比重最少。在这些结构中，α-螺旋的含量在41.12%–56.24%之间，不规则卷曲的含量在28.33%–39.45%之间。此外，在α-螺旋结构中，MdCS3.1和MdCS3.2所占的比例最大，MdCS3.5所占的比重最小，而在不规则卷曲结构中，则是MdCS3.6所占比重最大，MdCS3.1和MdCS3.2不规则卷曲的比重最小(图 2)。据此可以推测，α-螺旋和不规则卷曲结构支配着基因家族结构的形成过程。
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| 图 2 苹果CS3基因家族的二级结构分析 Fig. 2 Secondary structure analysis of apple CS3 gene family. |
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利用GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线分析获得6个CS3基因家族成员的基因结构图(图 3)。MdCS3.1–3.6均具有上游和下游基因序列，且包含内含子和外显子，结构完整。MdCS3.1基因较长，不同于其他MdCS3基因，具有18个内含子和19个外显子。
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| 图 3 苹果CS3基因家族的基因结构分析 Fig. 3 Analysis of gene structure of apple CS3 gene family. |
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利用Circoletto@the BAT cave (http://tools.bat.infspire.org/circoletto/)在线分析6个CS3基因家族成员的共线性(图 4)。由图可知，MdCS3.1–3.6分别位于Chr0、Chr2、Chr9、Chr13、Chr16和Chr17这6条不同的染色体上，通过共线性分析发现，MdCS3.5和MdCS3.4的共线性较弱，其余4个基因间均存在基因对。
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| 图 4 苹果CS3基因家族成员基因定位和共线性分析 Fig. 4 Gene localization and collinearity analysis of CS3 gene family members in apple. |
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所有CS3基因家族成员中均包含motif 1、motif 2和motif 3，且MdCS3.5和MdCS3.4的motif 1位点数量多于motif 2和motif 3位点数量(图 5)。通过进化树分析，该基因家族成员分为3个分支，同一进化树分支上的motif位点相同，由此推测MdCS3.3和MdCS3.6、MdCS3.5和MdCS3.4、MdCS3.1和MdCS3.2基因间分别具有相同的结构和特性。
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| 图 5 苹果CS3基因家族进化树及motif序列分析 Fig. 5 Phylogenetic tree and motif analysis of apple CS3 gene family. |
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选取苹果CS3家族中每个成员上游2 000 bp启动子序列，用PLANT Care在线分析软件对其顺式作用元件进行了预测。结果如表 3所示，苹果CS3家族中不仅存在着CAAT-box、TATA-box等转录调控元件，而且还存在着许多与植物逆境、生长发育、激素应答和光诱导等密切相关的顺式调控元件。MdCS3.1、MdCS3.4、MdCS3.5这3个基因中与逆境反应有关的基因数目最多，说明这3个基因在逆境反应中可能发挥着重要的功能；MdCS3.2、MdCS3.4、MdCS3.5、MdCS3.6这几个基因中包含了大量与激素反应有关的顺式作用元件，可能与多种激素反应有关。
| Type | Elements | MdCS3.1 | MdCS3.2 | MdCS3.3 | MdCS3.4 | MdCS3.5 | MdCS3.6 |
| Transcription related | TATA-box | 6 | 5 | 10 | 5 | 9 | 16 |
| CAAT-box | 16 | 17 | 31 | 40 | 36 | 29 | |
| Stress related | ARE | 4 | 4 | 0 | 4 | 3 | 0 |
| CAT-box | 1 | 0 | 3 | 0 | 0 | 3 | |
| GCN4-motif | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | |
| HD-Zip 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | |
| MSA-like | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | |
| W-box | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 | 1 | |
| Hormone response | LTR | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| MBS | 4 | 5 | 0 | 1 | 1 | 1 | |
| MYB | 3 | 10 | 5 | 11 | 7 | 7 | |
| MYC | 3 | 4 | 7 | 6 | 3 | 3 | |
| STRE | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 3 | |
| WUN-motif | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | |
| ABRE | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | |
| ERE | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | |
| GARE-motif | 1 | 1 | 0 | 2 | 2 | 0 | |
| TATC-box | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| CGTCA-motif | 3 | 3 | 1 | 2 | 2 | 3 | |
| TGACG-motif | 2 | 3 | 1 | 2 | 2 | 3 | |
| TCA | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | |
| Photoinduction | G-box | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| GT1-motif | 1 | 1 | 0 | 2 | 3 | 0 |
用Helm制作热图(图 6)，结果表明，所有基因在不同组织中均有表达，其中品种M67的花中MdCS3.4表达量最高，随后依次是MdCS3.6、MdCS3.3、MdCS3.2、MdCS3.1和MdCS3.5；品种M74的果实中MdCS3.4表达量最高，随后依次是MdCS3.3、MdCS3.6、MdCS3.2、MdCS3.1、MdCS3.5，品种M74的花中MdCS3.4表达量最高，随后依次是MdCS3.6、MdCS3.3、MdCS3.2、MdCS3.1和MdCS3.5；品种M20的果实中MdCS3.4表达量最高，随后依次是MdCS3.6、MdCS3.3、MdCS3.2、MdCS3.1和MdCS3.5；品种M14的叶片中MdCS3.4表达量最高，随后依次是MdCS3.3、MdCS3.6、MdCS3.2、MdCS3.1和MdCS3.5；品种M49的果实中MdCS3.4表达量最高，随后依次是MdCS3.6、MdCS3.3、MdCS3.2、MdCS3.5和MdCS3.1。
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| 图 6 苹果CS3基因家族成员的组织特异性分析 Fig. 6 Tissue-specific analysis of CS3 family genes in apple. |
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通过酸碱滴定试验，对‘艾斯达’苹果的果皮和果肉，‘成纪1号’的果皮和果肉的酸含量分别进行了测定，结果发现，‘艾斯达’的果皮和果肉的酸含量显著高于‘成纪1号’的果皮、果肉(图 7A、7B)。
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| 图 7 苹果CS3基因家族成员在不同苹果品种中的表达分析A：成纪1号和艾斯达苹果的表型. B：成纪1号和艾斯达苹果果皮和果肉中酸含量的测定分析. C：苹果CS3基因家族表达分析. 不同小写字母表示显著差异(P < 0.05) Fig. 7 Analysis of the expression of apple CS3 gene family members in different apple varieties. A: Phenotypes of Chengji No.1 and Asda apples. B: Determination and analysis of acid content in peel and pulp of Chengji No.1 and Asda apple. C: Analysis of CS3 gene family expression in apple. Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
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对不同基因在‘艾斯达’和‘成纪1号’果皮、果肉中的相对表达量进行分析，结果显示，MdCS3.1和MdCS3.5在‘成纪1号’果皮中相对表达量最高，‘艾斯达’果肉中MdCS3.2和MdCS3.3基因相对表达量最高，MdCS3.4和MdCS3.6在‘艾斯达’果皮中的相对表达量高于其果肉和‘成纪1号’的果皮和果肉(图 7C)。
3 讨论与结论CS3是一个较小的基因家族，该家族已在多个物种中被鉴定，如童晋等[17]研究表明CS基因参与了油菜植物的代谢调控；胡利华等[4]研究证明了CS基因参与磷的活化；张珊珊等[18]从水稻中获得了柠檬酸合酶基因，间接获得了正确表达的柠檬酸合酶蛋白；迟光红等[9]研究发现香蕉中的柠檬酸合酶蛋白定位于乙醛酸循环体。苹果中筛选获得6个转录因子家族成员，依次命名为MdCS3.1–MdCS3.6。在进化分析中，可以发现这个基因家族可以被划分成3个大类，而苹果家族基因也可以被划分成3个亚家族，并且它的氨基酸保守性很高，因此可以推断出，在这些物种中，CS3基因之间存在着某种相同或者相似的特殊功能。结果表明，苹果中的CS3基因家族在遗传上存在着相近的遗传结构。每个基因中都含有motif 1、motif 2和motif 3，且motif 1包含的位点较多，由此推测motif 1是决定该基因家族功能的关键保守基序。
苹果CS3家族含有种类较为丰富的顺式作用元件，如与转录相关的CAAT-box、厌氧诱导响应元件(antioxidant response element, ARE)、干旱响应元件MBS (MYB binding site)和光诱导相关的GT1-motif等。不同的非生物胁迫因子都在直接或间接影响基因表达水平，通过启动子中顺式作用元件种类及数量对基因表达调控产生影响。不同基因具有不同功能的作用元件，推测CS3基因家族在表达调控上具有不同的功能。
果实中的有机酸的积累是一个复杂的过程，有研究表明果实中有机酸的相对含量是果实成熟中的重要组成因子，并且甜度/总酸值是影响苹果果实甜酸风味的一个重要因素[19]；Saradhuldhat等研究表明，菠萝果实发育过程中酸度的变化是由柠檬酸含量的变化引起的[20]；也有研究表明苹果的甜味和酸味取决于总糖和总酸的含量[21]；同时苹果果实有机酸的总含量与柠檬酸和苹果酸呈极显著正相关[22]，更加表明了苹果酸和柠檬酸是苹果果实酸度的主要决定因子。不同类型果实中有机酸的类型及含量不同，该试验通过对苹果中有机酸含量的测定，对不同苹果果实的分析表明，不同类型苹果有机酸含量有较大差异。推测有机酸含量在不同果实中起到不同的作用，‘艾斯达’苹果和‘成纪1号’苹果在风味上有差异，推测有机酸含量在两种苹果生长发育过程中发挥重要作用。
现有研究已经表明柠檬酸合酶基因对植物的耐铝性和对磷的吸收有很大的影响[6-7]，同时柠檬酸基因的合成与表达对香蕉、甜橙等果实的生长发育有重要作用[8-9]，研究阐述了不同品种的相对表达量不同，调控类型不同，如根系分泌的有机酸在解除根际铝毒害方面的作用[23]，已有研究显示，在铝胁迫下，黑麦的根部可分泌出许多有机酸[24]，还有一些研究显示，黑麦根尖可分泌柠檬酸和苹果酸[25]。通过对MdCS3家族成员在酸含量不同的苹果果皮和果肉中进行荧光定量试验分析发现，MdCS3.1和MdCS3.5基因在酸含量最低的‘成纪1号’果皮中的表达水平最高，酸含量高的艾斯达果肉中MdCS3.2和MdCS3.3基因相对表达水平最高，除MdCS3.3基因外，其他家族成员在酸含量较低的‘成纪1号’果肉中表达水平也相对较低。由此推测，MdCS3基因家族参与了苹果果实酸的积累，不同苹果中酸含量变化趋势与苹果相对表达量变化趋势不同，表明MdCS3基因在不同苹果品种中的表达模式不同。此外，这些基因的相对表达量也可以反映出它们在不同时间段内的变化情况，为研究苹果果皮和果肉中基因的作用提供了重要的参考。试验结果表明不同品种的苹果CS3相对表达量不同，推测柠檬酸对苹果果实的生长发育也具有重要作用。
本研究利用生物信息学方法筛选鉴定出6个苹果CS3家族成员，并对该家族成员的结构和功能进行了初步研究，结果发现不同基因在不同酸含量苹果品种中的相对表达量存在差异，说明它们在苹果果实品质形成过程中可能发挥不同作用，但具体作用机制还有待于进一步研究。本研究为CS3家族基因在苹果生长发育过程中的功能研究提供了参考。
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