2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 乐巧娜, 黄梓雯, 戴若惠, 李三峰, 李梦佳, 方媛, 王跃星, 饶玉春
- LE Qiaona, HUANG Ziwen, DAI Ruohui, LI Sanfeng, LI Mengjia, FANG Yuan, WANG Yuexing, RAO Yuchun
- 水稻蒸煮品质相关QTL定位及候选基因分析
- Mapping of QTL associated with rice cooking quality and candidate gene analysis
- 生物工程学报, 2024, 40(1): 122-136
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(1): 122-136
- 10.13345/j.cjb.230207
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文章历史
- Received: March 20, 2023
- Accepted: May 8, 2023
- Published: May 10, 2023
引用本文
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2. 中国水稻研究所 水稻生物学国家重点实验室, 浙江 杭州 310006
2. State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, Zhejiang, China
水稻(Oryza sativa)是全世界最重要的粮食作物之一，占我国粮食总产量的40%以上，其产量与稻米品质的提升一直以来都是中国农业现代化生产与粮食安全的研究热点[1]。随着我国社会经济的快速发展和人民物质生活水平的不断提高，消费者对于稻米的需求逐渐由“吃饱”转向“吃好”，对水稻的蒸煮品质尤为关注，对稻米的味道、硬度和黏度等多维度提出要求[2]。因此，改善稻米的蒸煮品质，培养口感佳、营养价值高的优质稻米是现阶段水稻育种工作者的重要研究方向。
水稻品质是综合性状，主要包括外观品质、加工品质、蒸煮品质、食味品质和营养品质等[3]。水稻的蒸煮品质通常用糊化温度(gelatinization temperature, GT)、胶稠度(gel consistency, GC)和直链淀粉含量(amylose content, AC)这3项指标来表示[4]。糊化温度是指稻米淀粉颗粒在热水中吸水并发生不可逆膨胀时的温度，一般用碱消值(alkali spreading value, ASV)来表示[4]。糊化温度与碱消值有对应关系，糊化温度大于74 ℃：碱消值1‒3级；糊化温度70‒74 ℃：碱消值4‒5级；糊化温度小于70 ℃：碱消值6‒7级。通常稻米的糊化温度为中低等级为最佳，表明蒸煮米饭的时间适中。胶稠度是用来衡量米饭软硬程度的指标，以米胶长度表示。胶稠度通常分为3类：软胶稠度(大于60 mm)、中胶稠度(40‒60 mm)和硬胶稠度(小于40 mm)。一般优质米均为软胶稠度。直链淀粉含量作为稻米蒸煮品质的重要指标，分4个等级：很低(2%‒10%)、低(10%‒20%)、中等(20%‒25%)和高(大于25%)。具有中低直链淀粉含量的稻米更受青睐。稻米的蒸煮品质属于数量性状，受多基因控制，易受环境因素影响，其中氮肥的施用和灌浆期温度差异影响最大[5]。因此，研究水稻蒸煮品质性状相关基因及遗传机制对于利用分子手段培育优质水稻品种具有重要意义。
近年来，随着数量性状基因座(quantitative trait locus, QTL)研究的不断深入，已有多个水稻蒸煮品质相关QTL与基因被精细定位或克隆。包劲松等[6]利用窄叶青8号和京系17为亲本构建的双单倍体(doubled haploid, DH)群体及其遗传连锁图谱，对水稻蒸煮品质的3个性状进行了QTL定位，最终将控制糊化温度的主效QTL定位于Alk基因位点，将调控直链淀粉含量的主效QTL定位于Wx基因所在区间；还发现水稻胶稠度的遗传调控机制较为复杂，除主效QTL参与调控外，还存在微效QTL控制。田瑞[7]利用武育粳2号与珍汕97B衍生了重组自交系群体，运用区间作图方法，结果检测到5个与水稻蒸煮品质相关的QTLs，这5个QTLs分别位于第1、2、6号染色体上，在第6号染色体上RM276‒RM121区域能够扫描到1个控制糊化温度的主效QTL，而对于胶稠度和直链淀粉含量，解释最大变异情况的QTLs都位于第6号染色体上的RM190‒RM510区间内。邵高能等[8]以D50/HB277为亲本构建DH群体，并对水稻蒸煮品质3项指标进行检测，共检测到了6个具有显著加性效应的QTLs，分别位于第2、6、7、9号染色体上。鄢宝[9]则使用华恢3号/中国香稻衍生的重组自交系群体作为研究材料，构建分子标记遗传连锁图谱，对蒸煮品质性状进行QTL定位分析，定位到7个与胶稠度相关的QTLs，分别位于第2、4、6、8号染色体上，3个与糊化温度相关的QTLs，分别位于第3、6、8号染色体上，6个与直链淀粉含量相关的QTLs，分别位于第1、3、6、8号染色体上。晁园等[10]以川香29B和中国香稻构建的重组自交系群体为实验材料，建立简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)分子标记遗传连锁图谱，定位结果显示，与直链淀粉含量相关位点qAC6区间包含Waxy基因，糊化温度相关位点qASV6-4和qASV6-5区间包含第6号染色体的Alk基因。许勇[11]则用93-11/日本晴组成的190个重组自交系群体构建图谱，定位到14个与水稻直链淀粉含量相关的QTLs，其中4个分别位于第1、3、10号染色体上的QTLs的贡献率高达74.604 8%‒78.666 7%。
前人虽在水稻蒸煮品质相关QTL定位研究上取得了一些进展，但由于其复杂的遗传机理、不同QTL之间及QTL与环境之间的互作效应等[12]，相关基因的精细定位与克隆受到很大限制，研究进展缓慢，亟需筛选出新的主效QTL及基因。此外，籼稻与粳稻的蒸煮品质存在显著差异，粳稻的蒸煮品质往往优于籼稻。籼粳杂交遗传群体的蒸煮品质可能受到不同亲本遗传组分的影响[13]，进而影响蒸煮品质的QTL定位结果。鉴于此，本研究运用籼稻品种华占(HZ)、粳稻品种热研2号(Nekken2)及其构建的重组自交系(recombinant inbred lines, RILs)群体为实验材料，分别对水稻籽粒糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量这3项蒸煮品质指标进行检测，结合实验室前期构建的遗传图谱进行QTL定位分析，以期挖掘调控水稻蒸煮品质的新位点或基因，为培育具有优良蒸煮品质的水稻新品种提供种质资源和理论支撑。
1 材料与方法 1.1 实验材料华占(Oryza sativa L. subsp. indica cv. ‘HZ’)作为中国水稻研究所培育的优质籼稻，具有产量高、口感佳等优点。热研2号(Oryza sativa L. subsp. japonica cv. ‘Nekken2’)属于粳稻品种，具有很强的亲和性，被广泛应用于挖掘功能基因及水稻育种中。以华占(HZ)为父本、热研2号(Nekken2)为母本，杂交得到F1代，F1代通过单粒传法进行套袋自交至第12代，获得具有稳定基因型和表型的120个重组自交系(RILs)，组成实验所用遗传群体[14]。实验群体于2021年5月在浙江省中国水稻研究所杭州试验基地播种，10月完成群体收种。
1.2 实验方法 1.2.1 水稻种植及管理取亲本及各株系健康饱满且大小相近的种子各60粒，分别用70%乙醇和10%次氯酸钠溶液对种子表面进行10 min的消毒处理，再用去离子水冲洗数次，洗净种子表面残留液。浸种2 d，期间换水1次。浸种后用湿纱布包裹种子，在37 ℃恒温培养箱中催芽48 h。然后，挑选发芽一致的种子进行播种。1个月后，选取各株系长势良好且一致的幼苗24株移栽到常规稻田中，各株系均4行6列。生长期间进行常规田间管理，及时除草除虫等。
1.2.2 样品处理在水稻成熟后收获籽粒，将稻谷晒干后置于室温环境下3个月，以使其理化性质相对稳定。随后，将待测样品置于干燥通风且温度稳定的实验室内7 d，使样品水分含量保持在13%±1%范围内以减小误差。籽粒含水量按GB/T 24896—2010《粮油检验稻谷水分含量测定近红外法》所述方法测定[7]。将收获的120个重组自交系和14组亲本的稻谷样品分别编号，按顺序经砻谷机出糙、碾米机精白、旋风式粉碎磨粉碎，得到的米粉通过0.25 mm的尼龙筛过滤后，所得样品粉末颗粒分别装入带编号的牛皮纸袋中。另备样胶稠度标准品进行比较，对应值为30、50、70 mm。
1.2.3 直链淀粉含量测定称取0.05 g烘干后的待测样品，倒入容量瓶中。吸取0.5 mL 95%乙醇缓慢加入容量瓶中，轻轻振荡润湿后，加入4.5 mL 1.00 mol/L氢氧化钠溶液。将装有样品的容量瓶置于37 ℃恒温箱中过夜，冷却至室温后，加蒸馏水定容至50 mL。吸取待测液0.5 mL，加入到装有一部分蒸馏水的容量瓶中，依次加入0.1 mL 1.00 mol/L乙酸和0.2 mL碘液(称取2.00 g碘和20.00 g碘化钾混合，用蒸馏水溶解后，定容至1 000 mL)，充分摇匀，用蒸馏水定容至5 mL，静置0.5 h。配制0.09 mol/L氢氧化钠溶液为空白对照组，在分光光度计波长620 nm处调零，随后对各编号样品液测定吸光度，记录数据。
与上述方法相同，分别对已知含量的高、中、低3份直链淀粉含量的标准样品进行吸光度测定，绘制标准曲线。以标样的直链淀粉含量为纵坐标，以相对应的吸光度为横坐标，列出曲线的回归方程：Y=a+bx，式中Y代表样品的直链淀粉含量，a代表标准曲线截距，b代表标准曲线斜率，x代表样品的吸光度。
随后，将每个样品用各自测得的吸光度从标准曲线上直接读出或代入标准曲线回归方程中求出所得稻米的直链淀粉含量(以占干重的百分比表示)。重复实验3次，实验数据的误差应在1%以内，标准样品所做标准曲线的R2值大于0.99。
1.2.4 胶稠度测定称取0.1 g烘干后的待测样品置于试管内，滴加百里酚蓝试剂，振荡湿润。滴加0.5 mL 95%乙醇及2.0 mL 0.200 mol/L氢氧化钠溶液，混匀后，将溶液立即置于沸水浴进行糊化，用玻璃球封试管口，保持沸腾的米胶高度在试管的2/3处，持续糊化8 min。糊化后取出试管并移去玻璃球，室温静置5 min，再于冰水中放置15 min。在室温(25±2) ℃下，将试管平放在水平台上。1 h后，测量试管底至冷胶沿的距离，即为样品胶稠度。此外，还需测定内标样品。内标样品测定数据与标准数值的相对相差应在下列范围内：软、中胶稠度5 mm；硬胶稠度3 mm。实验重复3次。胶稠度分3类(表 1)[15]。
| Class | Length of rice gel (mm) |
| Hard gel consistency | < 40 |
| Medium gel consistency | 40‒60 |
| Soft gel consistency | > 60 |
从每袋样品中取出6粒无破损、无干瘪、饱满的精米放入方盒中，加入10.0 mL 1.70%氢氧化钾溶液。平稳转移至(30±2) ℃的恒温箱内，保温1 d，每个米粒都要观察其胚乳的状态[16]，按标准(表 2)进行分级并记录。
| Grade | Alkali spreading behavior |
| 1 | Grain not affected; kernel white |
| 2 | Grain swollen; kernel white, with powdered collar |
| 3 | Grain swollen; kernel white, collar incomplete or narrow |
| 4 | Grain swollen; kernel cotton white, collar complete and wide |
| 5 | Grain cracked; kernel cotton white, collar complete and wide |
| 6 | Grain partially dispersed and dissolved; kernel cloudy white, collar disappeared |
| 7 | Grain completely dispersed; kernel and collar both dispersed |
碱消值=(G1×N1+G2×N2+……+Gn×Nn)/总粒数
式中：G代表每粒米的级别；N代表同级米粒数。
内标样品同时进行实验，其实际测量数值与已知标准数值的相对误差保持在0.5级以内。参照NYT83—2017《米质测定方法》，根据稻米糊化时现象的不同，糊化温度可分为3类(表 3)。实验重复3次，每次测定的结果之间相差≤0.5级。
| Grade | Alkali spreading value (ASV) | Gelatinization temperature (℃) |
| High | 1‒3 | > 74 |
| Medium | 4‒5 | 70‒74 |
| Low | 6‒7 | < 70 |
提取亲本与120个重组自交系群体的DNA，进行全基因组测序，构建测序文库。比较各株系之间的变异位点，采用隐马尔可夫模型[17]确定群体基因型。再将具有相同基因型的连续单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点集中成区块，筛选出小于100 kb的SNP位点。对筛选后的结果进行整理分析，共获得4 858个均匀分布在水稻12条染色体上的分子标记，以此构建相应的高密度SNP遗传图谱[18]。
1.2.7 QTL定位结合实验室前期构建的高密度SNP遗传图谱，运用区间作图法，借助Mapmaker/QTL1.1B软件，分别对各株系中蒸煮品质的直链淀粉、胶稠度和糊化温度3项指标进行QTL定位分析，将LOD=2.5作为阈值。QTL的命名方法遵循Mccouch等[19]的原则。
1.2.8 基因表达定量分析使用TRIzol总RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取HZ和Nekken2成熟期叶片的RNA，DNase I处理RNA样品，用逆转录试剂盒ReverTra Ace® qPCR RT Kit (Toyobo)进行反转录。根据QTL定位结果，利用水稻基因组注释数据库(http://rice. plantbiology.msu.edu/)，在QTL区间内筛选与水稻蒸煮品质相关的候选基因。运用实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)法检测候选基因在亲本间的表达量。qRT-PCR反应体系总体积为20 μL，包括2 μL cDNA模板、10 µmol/L正反引物各0.8 μL、10 μL SYBR qPCR Mix (Toyobo)，用ddH2O补足至20 μL。qRT-PCR扩增程序(循环40次)：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s[20-21]。qRT-PCR反应所用引物序列见表 4。以OsActin为内参基因，采用2–ΔΔCT法[22]进行双亲基因定量分析。实验重复3次。利用SPSS 22.0软件进行t检验，比较不同处理间在0.05和0.01水平上差异显著性。
| Primer name | Sequence (5ʹ→3ʹ) | Tm (℃) | Length (bp) |
| LOC_Os04g20270-F-qrt | TGGCTATGCCGAGAAGCTAT | 59.98 | 243 |
| LOC_Os04g20270-R-qrt | GATGCACCAGGAACACCTTT | 60.00 | |
| LOC_Os11g40100-F-qrt | TAACCCCACAACAGATGCAA | 59.82 | 196 |
| LOC_Os11g40100-R-qrt | TTGTTTCCTCGGCCATCTAC | 59.99 | |
| LOC_Os01g04920-F-qrt | TGCTGGTGGTGTTCCTGATA | 60.25 | 226 |
| LOC_Os01g04920-R-qrt | CCAGATCGCAGCATTGTAGA | 60.07 | |
| LOC_Os02g17500-F-qrt | GCCTGAGATTTTCCCAAACA | 59.86 | 163 |
| LOC_Os02g17500-R-qrt | TGCTACCACACAAGCTGAGG | 60.07 | |
| LOC_Os03g02650-F-qrt | GACGACGTCTTCGAGATGC | 60.01 | 152 |
| LOC_Os03g02650-R-qrt | GAATGGTTCCACAGGCTCAT | 60.02 | |
| LOC_Os04g20330-F-qrt | CACCCGAGAAGAGAGGTCAG | 59.66 | 241 |
| LOC_Os04g20330-R-qrt | GTGGATGAGAAGCCCAATGT | 59.99 | |
| LOC_Os05g25840-F-qrt | AACAACAGGTCAGGGGCTAA | 59.59 | 178 |
| LOC_Os05g25840-R-qrt | GTGCTCCTTCTCCTCCTTCC | 60.36 |
亲本(华占和热研2号)及重组自交系群体水稻籽粒的糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量呈正态分布(图 1A‒1C)。结果表明，水稻籽粒的糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量在两亲本之间均差异显著，其中糊化温度在两亲本之间的差异最大，华占的碱消值为3.78，表现为中糊化温度；热研2号的碱消值为7.00，表现为低糊化温度(表 5)。结果显示，重组自交系群体(RILs)中水稻籽粒的糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量均呈现连续的正态分布，分布范围广泛，且存在超亲变异现象，表明水稻糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量为多基因控制的数量性状，符合QTL区间作图要求。
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| 图 1 水稻重组自交系中糊化温度(A)、胶稠度(B)和直链淀粉含量(C)分布 Fig. 1 Distribution of gelatinization temperature (A), gel consistency (B), amylose content (C) in recombinant inbred lines of rice. |
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| Trait | RILs | Parents | |||||
| x±s | Range | Skewness | Kurtosis | HZ | Nekken2 | ||
| GT (ASV) | 5.30±1.56 | 3.08‒7.00 | ‒0.23 | ‒0.94 | 3.78 | 7.00 | |
| GC (mm) | 62.87±12.57 | 22.67‒87.00 | ‒0.89 | 0.90 | 64.17 | 60.24 | |
| AC (%) | 17.49±3.47 | 8.76‒28.13 | 0.47 | 1.31 | 16.28 | 19.32 | |
利用重组自交系构建包含4 858个分子标记的高密度SNP遗传连锁图谱并进行QTL定位分析，结果共检测到26个与水稻蒸煮品质相关QTLs，LOD值在2.77‒30.24之间，分布于第1、2、3、4、5、6、7、8、11和12号染色体上(表 6，图 2)。其中与糊化温度相关的QTL 1个，位于第6号染色体上物理距离为3 908 292‒22 732 901 bp区间内，其LOD值高达30.24，由此推测该位点可能是控制水稻糊化温度的主效QTL。共检测到13个与胶稠度相关的QTLs，其中位于第11号染色体上物理距离为21 807 002‒23 985 951 bp区间内的qGC11的LOD值最大，为7.18，推测该位点可能是控制水稻胶稠度的主效QTL。对于直链淀粉含量，共检测到12个QTLs，其中位于第1号染色体上物理距离为1 663 060‒6 064 691 bp区间内的qAC1的LOD值最大，为9.67，推测该位点可能是控制水稻直链淀粉含量的主效QTL。此外，在第6号染色体上存在着与水稻糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量均相关且LOD值较大的重叠QTL区间。
| Trait | QTL | Chromosome | Physical distance (bp) | Position of support (cM) | Likelihood of odd (LOD) |
| Gelatinization temperature | qGT6 | 06 | 3 908 292‒22 732 901 | 16.75‒97.45 | 30.24 |
| Gel consistency | qGC1-1 | 01 | 2 407 127‒2 649 258 | 10.32‒11.36 | 4.49 |
| qGC1-2 | 01 | 14 842 775‒15 336 720 | 63.63‒65.74 | 2.77 | |
| qGC2 | 02 | 10 729 809‒10 871 055 | 46.00‒46.60 | 4.09 | |
| qGC3-1 | 03 | 704 980‒858 167 | 3.02‒3.68 | 2.94 | |
| qGC3-2 | 03 | 20 915 784‒21 003 928 | 89.66‒90.04 | 3.49 | |
| qGC4-1 | 04 | 787 067‒16 903 933 | 3.37‒72.46 | 5.61 | |
| qGC4-2 | 04 | 30 534 081‒30 686 115 | 130.90‒131.54 | 4.32 | |
| qGC5 | 05 | 10 057 827‒10 708 959 | 43.12‒45.91 | 3.34 | |
| qGC6 | 06 | 8 457 698‒17 537 504 | 36.26‒75.18 | 4.56 | |
| qGC7 | 07 | 13 095 659‒13 853 455 | 56.14‒59.39 | 6.15 | |
| qGC11 | 11 | 21 807 002‒23 985 951 | 93.48‒102.82 | 7.18 | |
| qGC12-1 | 12 | 6 897 394‒10 410 938 | 29.57‒44.63 | 3.62 | |
| qGC12-2 | 12 | 17 370 399‒17 901 627 | 74.46‒76.74 | 3.67 | |
| Amylose content | qAC1 | 01 | 1 663 060‒6 064 691 | 7.13‒26.00 | 9.67 |
| qAC2-1 | 02 | 3 999 642‒5 752 314 | 17.15‒24.66 | 4.38 | |
| qAC2-2 | 02 | 9 896 262‒18 043 622 | 42.42‒77.35 | 5.48 | |
| qAC3-1 | 03 | 481 634‒1 377 228 | 2.06‒5.90 | 5.54 | |
| qAC3-2 | 03 | 20 915 784‒21 229 182 | 89.66‒91.00 | 4.70 | |
| qAC4 | 04 | 46 622‒14 135 131 | 0.20‒60.59 | 6.03 | |
| qAC5 | 05 | 10 057 827‒15 200 902 | 43.12‒65.16 | 5.10 | |
| qAC6 | 06 | 8 457 698‒17 655 069 | 36.26‒75.68 | 4.81 | |
| qAC7 | 07 | 13 095 659‒13 314 991 | 56.14‒57.08 | 4.16 | |
| qAC8 | 08 | 18 777 521‒18 935 918 | 80.49‒81.17 | 2.98 | |
| qAC11 | 11 | 14 212 356‒22 421 559 | 60.92‒96.12 | 6.75 | |
| qAC12 | 12 | 17 268 215‒17 694 262 | 74.02‒75.85 | 6.62 |
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| 图 2 水稻重组自交系籽粒蒸煮品质相关QTL定位 Fig. 2 Mapping of QTL associated with cooking qualities in grains of rice recombinant inbred lines. GT: Gelatinization temperature; GC: Gel consistency; AC: Amylose content. |
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利用水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)与国家水稻数据中心基因库(http://www.ricedata.cn/gene/)的基因注释信息，并结合前人研究成果，对上述QTLs所在染色体区间内的基因信息进行分析，初步筛选得到8个与水稻蒸煮品质相关的候选基因，并对基因功能进行整理(表 7)。这些基因主要调控硫代异鼠李糖基转移酶、单糖转运体、乙烯应答因子、组蛋白去乙酰化酶、UDP-葡萄糖转移酶、ABC1激酶和GRF互作因子等。通过实时荧光定量PCR对部分基因在双亲间的表达量进行检测，结果表明(图 3)，位于胶稠度/直链淀粉含量QTL重叠区的LOC_Os04g20330在亲本间的表达量无显著差异；位于胶稠度QTL定位区的LOC_Os04g20270和LOC_Os11g40100在亲本间的表达量均差异显著，在父本华占中的表达量均显著高于母本热研2号；位于直链淀粉含量QTL定位区的基因LOC_Os01g04920、LOC_Os02g17500、LOC_Os03g02650和LOC_ Os05g25840的表达量在双亲间差异显著，其中LOC_Os01g04920和LOC_Os02g17500在父本华占中的表达量高于母本热研2号，LOC_ Os03g02650和LOC_Os05g25840在母本热研2号中的表达量高于父本华占。综上所述，共有6个基因在双亲间的表达量存在显著差异，LOC_Os04g20270和LOC_Os11g40100可能参与调控水稻籽粒的胶稠度，LOC_Os01g04920、LOC_Os02g17500、LOC_Os03g02650和LOC_ Os05g25840可能参与调控水稻籽粒直链淀粉的合成代谢过程，进而影响水稻的蒸煮品质。
| Chromosome | QTL locus | Gene | Function | Regulation object |
| 1 | qAC1 | LOC_Os01g04920 | Decreased seed setting rate and increased the level of glycoside flavonoids[23] | Thioredoxin isorhamnosyltransferase |
| 2 | qAC2-2 | LOC_Os02g17500 | Associated with total soluble sugar content | Monosaccharide transporter localized in the Golgi apparatus |
| 3 | qAC3-1 | LOC_Os03g02650 | DNA transcription factor activity, which affects photosynthesis and thus increases starch content[24] | Ethylene response factor |
| 4 | qGC4-1, qAC4 | LOC_Os04g20270 | Involved in starch accumulation and transposon repression, involved in rice seed development[25] | Histone deacetylase gene |
| 4 | qGC4-1, qAC4 | LOC_Os04g20330 | Associated with UDP-glucosyltransferase expression, involved in nucleotide sugar metabolism[26] | UDP-glucosyltransferase |
| 5 | qAC5 | LOC_Os05g25840 | Plays an important role in grain shape and seed size in rice[27] | ABC1 kinase |
| 6 | qGT6 | Alk | Involved in branched starch crystal building, associated with the synthesis of the main component of branched starch branching clusters (medium-length dextran chain)[28] | Soluble starch synthase Ⅱ |
| 11 | qGC11 | LOC_Os11g40100 | Increased seed length, grain width and thousand grain weight in transgenic rice[29] | GRF intercropping factor |
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| 图 3 候选基因在亲本中的表达量差异 Fig. 3 Differential expression of candidate genes in parents. *: P < 0.05; **: P < 0.01. |
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消费者对稻米的选择偏好很大程度上取决于稻米的蒸煮食味品质[30]。稻米的蒸煮品质主要包括糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量，这3项指标反映了稻米在烹饪和食用过程中的理化特性[31]。蒸煮品质性状在本质上均属于数量性状，受主效基因或微效基因等多基因的共同调控，它们的上位性和环境交互作用也会影响稻米的蒸煮品质[32]。因此，定位与水稻蒸煮品质相关的QTL及筛选相关主效基因是改良、培育优质稻米的有效方法之一。
本研究以华占、热研2号及其构建的RILs群体为实验材料，以水稻籽粒的糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量为检测指标，将表型数据进行统计分析，结合已构建的高密度遗传图谱进行QTL定位，共检测到26个QTLs，其中与糊化温度相关的位点1个，与胶稠度相关的位点13个，与直链淀粉含量相关的位点12个。在对相关基因进行初步筛选及表达分析后，发现6个基因在双亲间表达量差异显著，其中2个基因可能与稻米胶稠度有关，4个基因可能参与调控稻米直链淀粉含量。与以往研究结果相比，本研究有效地证实了部分前人的研究成果，同时也发掘出新的QTL位点和基因。
本研究获得的部分QTL区间与以往研究所得结果存在重合区间。高振宇[28]将控制糊化温度的主效基因Alk定位于水稻第6号染色体SSR标记rm50‒rm527之间，该基因所在区间与本研究定位到的qGT6重叠，且本研究测得其LOD值高达30.24，表明本研究群体的糊化温度受Alk基因控制，这与前人的研究成果一致。本研究在第4号染色体上检测到一个范围较大且与直链淀粉含量相关的QTL qAC4，其与Lanceras等[33]的QTL检测区间存在部分重叠，且张杰等[34]在G264‒G177标记区间内检测到的qAC4也在本研究定位到的区间内，说明该区间真实存在一个稳定控制水稻直链淀粉含量的位点，具有较高的研究价值。谢黎红[35]利用珍汕97B/密阳46杂交衍生的F10重组自交系群体及247个分子标记连锁图谱，在第6号染色体上Wx基因标记的RM190所处片段检测到1个调控胶稠度和直链淀粉含量的主效QTL，表型贡献率分别为42.0%和61.3%，该区间与本研究定位到的qGC6区间存在重合。同时，本研究还检测到控制胶稠度的微效基因qGC7，位于Wx基因附近区域，与Lanceras等[33]分析得出的结论基本一致。此外，本研究还获得了许多新的QTL位点，例如，在第11号染色体物理距离为21 807 002‒23 985 951 bp区间内定位到1个LOD值高达7.18的qGC11，说明该区间内很可能存在1个影响水稻胶稠度的主效基因；位于第1号染色体物理距离为1 663 060‒6 064 691 bp区间内的qAC1，其LOD值高达9.67，表明该区间内很可能存在1个调控水稻籽粒直链淀粉含量的主效基因。上述研究结果将为水稻蒸煮品质的遗传改良提供理论支撑。
汤圣祥等[36]认为胶稠度受到1对主效基因Wx和若干微效基因的控制。然而黄祖六等[37]通过限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)和SSR标记技术构建了3张分子标记连锁图，得出稻米胶稠度主要受位于第3号染色体上2个连锁位点控制。除主效基因Wx以外，其他与淀粉代谢相关的基因，如ALK和SBE3也对稻米胶稠度发挥调控作用[38-39]。前人研究表明，LOC_Os04g20270的调控对象为组蛋白去乙酰化酶基因，参与调控稻米中的淀粉积累[25]，进而对稻米的胶稠度起控制作用；LOC_Os11g40100主要调节GRF互作因子，属于SSXT超家族基因，能够控制水稻的粒长、粒宽、千粒重及胶稠度[29]。结合基因表达定量分析结果，推测LOC_Os04g20270和LOC_Os11g40100的高表达可能极大地提高水稻籽粒的胶稠度。Fang等[25]通过染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验表明，在水稻种子发育过程中，LOC_Os04g20270参与降低淀粉代谢基因和转座子的组蛋白H3K9乙酰化，该基因的下调会诱导发育种子中水稻淀粉调控因子基因RSR1以及淀粉酶基因的高表达，引起淀粉合成降低以及淀粉降解增加，而直链淀粉含量的降低会使得稻米胶稠度有所增加。Li等[40]已成功克隆LOC_Os11g40100基因，过表达该基因能够增加水稻籽粒的大小和重量，通过调控细胞伸长和细胞增殖，调控籽粒的发育，间接影响稻米的胶稠度。
研究显示，对于水稻中的直链淀粉含量相关调控基因，在栽培稻中首先发现的是Wxa和Wxb，Wx基因能够调控淀粉合成酶GBSS的形成，进而控制稻米中的直链淀粉含量[41]。邵高能等[8]研究得出，控制直链淀粉含量的主效基因Wx位于6号染色体RM508到RM587之间。然而本次研究并未在Wx基因附近检测到直链淀粉含量相关的QTL，推测可能是因为本研究构建定位群体时使用的亲本(HZ和Nekken2)是直链淀粉含量相似的品种，这与张杰等[34]、吴长明等[42]的报道相似。近年来，除主效基因Wx外，对直链淀粉含量起调控作用的微效基因也逐渐被挖掘出来。例如，本研究中的LOC_Os01g04920编码硫代异鼠李糖基转移酶，能够调控结实率及糖苷类黄酮水平[23]；LOC_Os02g17500与高尔基体的单糖转运体有关，具体功能尚未见报道，推测其可能参与调节稻米中可溶性糖的合成；LOC_Os03g02650的调控对象为乙烯应答因子，可调节DNA转录因子活性和光合作用速率，进而调控籽粒中直链淀粉含量[24]；LOC_Os05g25840主要调控ABC1激酶的功能，影响水稻籽粒中淀粉等有机物的积累量[27]。实时荧光定量PCR分析表明，在调控水稻直链淀粉含量的候选基因中，LOC_Os01g04920、LOC_Os02g17500的高表达和LOC_Os03g02650、LOC_Os05g25840的低表达有助于降低稻米中直链淀粉含量，提高稻米的适口性。Zhan等[23]通过实验证明，过表达LOC_Os01g04920基因的水稻植株，相较于野生型，其淀粉合酶活性降低，表现出淀粉水平显著下降、可溶性糖水平升高的性状。Cao等[43]利用反向遗传学方法鉴定出LOC_Os02g17500与水稻单糖转运蛋白家族成员有关，将该基因的表达产物定位于高尔基体，LOC_Os02g17500表达量降低的植株中单糖积累减少。Ambavaram等[24]利用日本晴进行转基因实验，证明了LOC_Os03g02650在水稻中的表达能够增强在干旱和高温胁迫等多种环境条件下的光合作用，转基因植株的淀粉含量较野生型显著提高。Li等[27]研究发现过表达LOC_Os05g25840的稳定转基因水稻株系与野生型和RNAi转基因植株相比，表现出籽粒大小、粒重、灌浆速率和千粒重显著增加的表型，从而影响稻米中的直链淀粉的积累量。这些候选基因在其他学者的研究中，均显示出对水稻蒸煮品质的调控作用，也进一步证明了本研究中挖掘得到的QTLs的正确性和可靠性，有利于这些基因优异等位型的开发，为优质稻育种提供基础。
4 结论本研究共定位到26个与水稻蒸煮品质相关的QTLs，分布于第1、2、3、4、5、6、7、8、11、12号染色体上，其中1个与糊化温度相关，其LOD值高达30.24；13个与胶稠度相关，最高LOD值达7.18；12个与直链淀粉含量相关，LOD值最大为9.16；且在第6号染色体上存在1个同时调控水稻糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量的多效QTL区间。同时，研究表明，定位区间内与水稻胶稠度相关的2个基因(LOC_Os04g20270和LOC_Os11g40100)以及与直链淀粉含量相关的4个基因(LOC_Os01g04920、LOC_Os02g17500、LOC_Os03g02650和LOC_ Os05g25840)在父本华占和母本热研2号中的表达量存在显著差异，与亲本表型相符，说明上述6个基因在调控水稻胶稠度和直链淀粉含量中可能发挥重要的作用，可影响稻米的蒸煮品质和食用口感。本研究进一步挖掘了与水稻籽粒糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量相关的QTLs，揭示了调控水稻蒸煮品质相关基因的功能，为阐明水稻蒸煮品质调控机制提供了新的遗传位点。此外，本研究定位到的QTLs和基因经验证后可应用于低糊化温度、软胶稠度、低直链淀粉含量的水稻分子设计育种，以提升稻米的蒸煮品质，为培育优质水稻品种夯实基础。
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