作为一门新兴的交叉学科，基于自下而上设计理念的合成生物学(Synthetic Biology)为材料科学^[1]、化学品生产^[2]、食品制造^[3]、临床医疗^[4]等领域的发展带来了全新的机遇。合成生物学的一大特征是通过功能元件的模块化组装进行基因线路的构建。经过表征的标准化元件例如人工合成启动子(promoter)^[5]、核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)^[6]、终止子(terminator)^[7]、绝缘子(insulator)^[8]，以及具有特殊功能的模块单元例如光遗传学工具^[9]、基因编辑工具^[10]、诱导系统^[11]、蛋白质标签^[12]等在复杂基因线路构建中的联合使用，为在真核生物或原核生物中设计并实现特定功能带来极大便利。

功能蛋白的释放是合成生物学中的一个重要研究方向，许多由宿主合成的功能蛋白需要释放至胞外以发挥作用。一种常见的方法即通过与宿主的分泌蛋白进行融合表达，再借助其天然的分泌系统运送至胞外。不过，这类方法不仅受到功能蛋白大小和类型的限制^[13-15]，且需要研究人员充分熟悉宿主的分泌系统才能够加以利用，使用门槛相对较高。

相比较而言，采用诱导宿主裂解的方式释放功能蛋白，不受限于蛋白的体积，而且几乎不存在宿主依赖性，具有广泛的应用前景。例如，Hwang等^[16]构建了一个可感知铜绿假单胞菌的工程化大肠杆菌菌株，在环境中存在足够的铜绿假单胞菌时，群体感应系统开启并表达裂解基因E7，使大肠杆菌裂解并释放蛋白DspB和铜绿假单胞菌毒素S5，可有效杀伤生物被膜状态下的铜绿假单胞菌。与分泌释放相比，裂解不仅能够方便地实现多种功能蛋白的释放，而且可以限制环境中活细菌的数量，增强系统的安全性。Din等^[17]和Chowdhury等^[18]同样利用细菌的群体感应系统和肿瘤靶向性，构建了能够在肿瘤组织内持续裂解并释放多种治疗药物的工程菌，使肿瘤组织中的活菌数量被限制在一定的浓度范围之内，从而实现高效且安全的肿瘤治疗。此外，在生物高分子生产^[19]、减毒活疫苗制造^[20]、微细胞纯化^[21]、基因转移^[22]等相关研究中，均有裂解模块的运用。

通过诱导表达噬菌体的裂解基因盒子(lysis cassette)可以实现裂解功能在基因回路中的引入。裂解基因盒子通常由穿孔素(holin)、内溶素(endolysin)、跨膜蛋白(Rz-Rz1)组成。因穿孔原理的不同，可将裂解基因盒子分为holin-endolysin和pinholin-SAR endolysin两类^[23]，分别被称为I型穿孔素和Ⅱ型穿孔素。初始状态下，穿孔素细胞膜上累积，内溶素则在细胞质内累积，当穿孔素累积到一定浓度时，在细胞膜上形成较大孔洞，将内溶素释放至细胞周质中并破坏肽聚糖层，引起细菌的裂解。Pinholin和SAR-endolysin在表达后都会在细胞内膜上累积，且SAR-endolysin的一端锚定在内膜中，另一端活性部分则位于内膜外侧，pinholin达到一定浓度时在内膜上形成小孔，随后SAR-endolysin从内膜上释放并活化，进而破坏肽聚糖层，并引发细菌裂解。

与其他功能模块单元经过系统表征相比，裂解功能模块虽然在多种基因回路设计中均有涉及，但是尚未见有工作对其进行较为详细的表征。本研究对两种类型共计5个裂解基因盒子引发的细菌裂解行为进行了分析，探讨了生长状态、诱导系统、诱导剂浓度、表达载体、诱导系统的背景表达水平和诱导表达水平对细菌裂解行为的影响，为后续利用这些裂解基因盒子构建基因线路提供了研究基础。更进一步地，我们利用可在近红外光照射下合成第二信使分子c-di-GMP的光遗传学工具BphS^[24]和裂解基因盒子LUZ，展示了通过光遗传学技术控制一种可裂解的工程化铜绿假单胞菌进行表面修饰的可能性。本研究通过对若干裂解基因模块的系统表征，强化了我们对其在不同条件下引发的宿主裂解行为的认识，对于不同宿主内裂解系统的构建以及拓展和丰富合成生物学工具箱具有重要的意义。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

本实验中所用菌株和质粒如表 1所示。

1.1.2 主要试剂及试剂盒

实验所用LB培养基配方：胰蛋白胨(OXOID)，10 g/L；酵母提取物(OXOID)，氯化钠[生工生物工程(上海)股份有限公司，以下简称“生工”]，10 g/L。固体培养基中另外含有琼脂A (生工)，20 g/L。

实验所用限制性培养基FAB配方：Na₂HPO₄∙12H₂O (阿拉丁试剂有限公司，以下简称“阿拉丁”)，12.02 g/L；(NH₄)₂SO₄ (阿拉丁)，2 g/L；CaCl₂∙2H₂O (阿拉丁)，14 mg/L；KH₂PO₄ (阿拉丁)，3 g/L；FeCl₃ (阿拉丁)，1 μmol/L；NaCl (生工)，3 g/L；MgCl₂ (阿拉丁)，93 mg/L；微量金属元素溶液，1 mL/L。微量金属溶液含有：MnSO₄∙7H₂O (阿拉丁)，200 mg/L；CaSO₄∙2H₂O (阿拉丁)，200 mg/L；NaMoO₄∙H₂O (阿拉丁)，10 mg/L；ZnSO₄∙7H₂O (阿拉丁)，20 mg/L；CoSO₄∙7H₂O (阿拉丁)，10 mg/L；CuSO₄∙5H₂O (阿拉丁)，20 mg/L；H₃BO₃ (阿拉丁)，5 mg/L。

所用试剂盒包括：质粒提取试剂盒(Omega)，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega)，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，无缝克隆连接试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。其他试剂还有硫酸庆大霉素(阿拉丁)、氨苄青霉素(阿拉丁)，甘油(阿拉丁)，阿拉伯糖(生工)，鼠李糖(生工)，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)预聚物(美国道康宁公司)，agarose (BBI)，cy5-甘露糖染料(西安齐岳生物科技有限公司)，蔗糖(阿拉丁)，谷氨酸盐(生工)，琼脂糖(生工)。

1.1.3 主要仪器

激光共聚焦显微镜(Olympus，型号Ⅸ-71)，注射器泵(Harvard, 型号Mask aligner)，功率计(Newport，型号为818-ST2)，去离子水机(Merck Millipore，型号Advantage A10)，摇床(SUSS MicroTec，型号MJB4)，酶标仪(Biotech，型号SYNERGY H1)，Nanodrop 2000 (Thermo Fisher)，微量离心机(Thermo Scientific，型号Pico21)，电穿孔仪(Bio-Rad，型号617BR109469)，生化培养箱(上海丙林电子科技公司，SPX系列)，高温高压灭菌锅(SANYO，型号MDF-U538)，多功能成像仪(耶拿)。

1.2 方法 1.2.1 大肠杆菌菌株及铜绿假单胞菌菌株构建

质粒构建过程中的各基因片段或载体通过PCR反应扩增得到，所涉及的引物及其序列如表 2所示，引物均由生工合成。裂解基因盒子相关基因的NCBI序列号如下，S₁₀₅: holin, 5740919; endolysin, 2703480; Rz, 2703481; Rz1, 5739319. LKD: holin, 5687451; endolsin, 5687445; Rz, 5687434; Rz1, 5687423. LUZ: holin, 5896758; endolsin, 5896761; Rz, 5896767; Rz1, 5896763。通过无缝克隆连接试剂盒进行质粒构建，加入各PCR片段的量均为100 ng左右，于37 ℃反应30 min。连接完成后，使用化学转化法将连接产物转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中，冰上孵育30 min后，于42 ℃水浴中热激90 s，再次置于冰上3–5 min，加入800 μL LB培养基，随后置于温度为37 ℃、转速为250 r/min的摇床中孵育1 h。将菌液离心后涂布至含有相应抗生素的LB琼脂板上，于37 ℃培养箱中培养12 h。次日，挑取单克隆点进行PCR鉴定，选取鉴定正确的单克隆点进行扩大培养并送至生工进行测序。本研究中所用的质粒均由测序确认其正确性，使用终浓度为35%的甘油溶液将测序正确的菌株保存至–80 ℃冰箱，以便后续使用。所有PCR反应以及无缝克隆连接的组分配置及反应条件均参照试剂盒说明书。

将测序正确的菌株扩大培养并提取质粒，随后用电化学转化法(电转)将质粒转化至对应铜绿假单胞菌中，即获得相应的铜绿假单胞菌菌株，所有的铜绿假单胞菌菌株均在终浓度为35%的甘油溶液中–80 ℃保存，以便后续使用。电转的方法参照标准流程^[25]进行：将待电转的铜绿假单胞菌菌株离心收集后，用1 mL浓度为300 mmol/L的蔗糖重悬，随后用1 000 r/min离心1 min收集菌体，弃去上清液后再次用1 mL浓度为300 mmol/L蔗糖重悬并离心收集菌体，再次弃去上清液。使用100 μL浓度为300 mmol/L的蔗糖重悬菌体，加入待电转质粒后静置3–5 min。电转miniTn7质粒时，除加入500 ng对应的miniTn7质粒外，还需加入200 ng pTNS2辅助质粒；其余质粒加100 ng即可，无需额外加入pTNS2质粒。电转时使用的电压为2.5 kV，电转后在电转杯中加入1 mL LB液体培养基并转移至15 mL摇菌管中，于温度为37 ℃、转速为250 r/min的摇床中孵育。电转miniTn7质粒后孵育时间为3 h，其余质粒孵育时间为1 h。将菌液离心后涂布至含有相应抗生素的LB琼脂板上，于37 ℃培养箱中培养12 h。Tn7质粒可将目的基因片段整合至铜绿假单胞菌基因组中，在Tn7质粒电转入铜绿假单胞菌菌株后，需要对琼脂板上的单克隆点进行PCR鉴定，随后，再次电转pFPL2质粒到鉴定正确的菌株中以通过FRT位点去除庆大抗性基因片段。将生长出的单克隆点划线于LB+15%蔗糖的琼脂板上，以迫使细菌丢弃pFLP2质粒，挑选生长出的单克隆点并分别划线于LB、LB+Gen30和LB+Carb300琼脂板上，选择仅能够在LB上生长的单克隆点并测序，确保目的基因通过Tn7载体准确插入基因组中。

在光控裂解基因线路的构建部分，使用实验室已有的BphS-PAO1菌株作为初始底盘菌株，随后将pR’-tR’-B0034-LUZ-T0T1-J23109- B0034-PA2133-miniTn7基因按照上述方法插入BphS-PAO1菌株中并去除庆大抗性基因片段，得到BphS-LUZ-PAO1菌株，随后将PcdrA- RBS(N)-Q(ASV)-PUCP20质粒电转入BphS- LUZ-PAO1中，即得到菌株Q(N)，其中N=10, 16, 23, 24, 25, 57, 70。

1.2.2 细菌裂解曲线的测量

本研究使用酶标仪测量细菌的裂解曲线。实验前一天，将保种于–80 ℃冰箱中的甘油菌划线于对应抗性的琼脂板上，挑选单克隆点于2 mL LB液体培养基中扩大培养至目标OD₆₀₀值附近。对于需要重新扩大培养的菌液，吸取10 μL过夜培养(约12 h)的菌液于1 mL LB液体培养基中培养至目标OD₆₀₀值附近。对于需要稀释的菌液，吸取500 μL原菌液后加入500 μL新鲜培养基，轻轻吹打均匀后备用，注意避免产生气泡。随后，吸取菌液加入96孔板中，每孔加入菌液体积为100 μL，每个样品设置3–4个重复组。加完样品后，用排枪快速加入相应的诱导剂，放入酶标仪中进行生长曲线测量。所有OD₆₀₀曲线中的0时刻即为加入诱导剂的时间点。如无特殊说明，本研究中使用的诱导剂为的0.2%阿拉伯糖(l-arabinose，母液浓度为20%)，0.1%的鼠李糖(l-rhamnose，母液浓度为10%)。酶标仪温度设置为30 ℃，双轨道快速振荡模式，每隔3 min读取一次600 nm处的吸收值。

1.2.3 不同诱导系统的背景表达量和诱导表达量的测量

本研究使用酶标仪测量不同诱导系统在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的背景表达量和诱导表达量。实验前一天，将保存于–80 ℃冰箱中的甘油菌划线于对应抗性的琼脂板上，挑选单克隆点于2 mL LB液体培养基中扩大培养至OD₆₀₀值约为0.2，随后以1:100的比例稀释于新鲜LB培养基中(含有对应浓度的抗生素)。按照每孔100 μL的体积加入96孔板中，对照组中不加诱导剂，实验组中加入终浓度为0.2%的阿拉伯糖或者0.1%的鼠李糖。每个样品设置4个对照组。酶标仪温度设置为30 ℃，双轨道快速振荡模式，每隔30 min读取一次激发波长为561 nm、发射波长为605 nm的荧光强度值和600 nm处的吸收值。

1.2.4 光控可裂解菌斑的筛选

实验前一天，将保存于–80 ℃冰箱中的甘油菌划线于含有终浓度为30 μg/mL的庆大霉素(Gen 30)的琼脂板上，挑选单克隆点于1 mL LB+Gen 30液体培养基中扩大培养至OD₆₀₀值约为1.0。随后分别滴加5 μL或10 μL体积的菌液于4块Gen 30琼脂板上，其中2块避光培养，另2块放置于红光下进行光照培养，光强约为2 mW/cm²。培养温度约为26 ℃，培养时间为48 h，菌斑的黑白图片由多功能成像仪获取。

1.2.5 显微镜图片的采集

本研究使用Olympus公司的Ⅸ-71倒置显微镜采集细菌的明场及荧光图片。显微镜配备有60×和100×的浸油物镜(Olympus)，显微镜xy移物台(Ludl)，Zyla 4.2 sCMOS相机(Andor)，Spectra X固体光源(Lumencor)和一批定制的滤光片。

图 2C的图片采集方式如下：实验前一天，将保种于–80 ℃冰箱中的甘油菌划线于对应抗性的琼脂板上，挑选单克隆点于1 mL LB液体培养基中扩大培养至OD₆₀₀约2.0。随后，用新鲜培养基将菌液稀释至OD₆₀₀值约为0.05，用旋涡混匀仪混匀，使细菌充分分散。吸取3–5 μL菌液滴加至约2 mm厚的1% (质量体积分数)琼脂糖薄片(FAB培养基含有1 μmol/L氯化铁+30 mmol/L谷氨酸盐+1% 琼脂糖)上，待液体风干后，倒扣在盖玻片上，即可进行显微镜图片采集。拍摄mScarlet所用的激发波长为(561±25) nm，发射波长为(598±25) nm。为了保证荧光数据的可靠性，每个菌种采取4×4视野的蒙太奇拍摄方式以拍摄尽可能多的细菌。

1.2.6 微流实验

实验前一天，将保种于–80 ℃冰箱中的甘油菌划线于含有终浓度为30 μg/mL的庆大霉素(Gen 30)的琼脂板上，挑选单克隆点于1 mL LB+ Gen 30液体培养基中扩大培养至OD₆₀₀约为0.5。进行微流实验时，首先利用1 mL注射器将细菌由进液口注入微流装置^[26]中，随后更换为20 mL含有新鲜LB培养基的注射器，推流速度设置为2 mL/h，废液由废液口流出。微流装置的通道长度为15 mm，宽度为1.2 mm，高度为0.2 mm，进液口与废液口的直径均为0.8 mm。显微镜光控实验按照本课题组已建立的方法进行^[27]，通过设置控制程序，对每个视野施加独立的光照强度和光照时间，即可获得不同的光诱导效果。微流实验过程中，每隔20 min获取一组明场图片。实验结束后，在微流装置通道中注入100 μL cy5-甘露糖染料(10 μg/mL)，静置10 min。随后，使用PBS冲洗5–10 min，拍摄各视野的荧光图片。荧光拍摄拍摄条件为：激发波长(561±25) nm，发射波长(598±25) nm。

2 结果与分析 2.1 在大肠杆菌中诱导表达裂解基因盒子及引发的裂解行为

在pJN105质粒中的阿拉伯糖启动子(P_BAD)下游接入5种裂解基因盒子，以探究其在大肠杆菌中引发的裂解行为差异。这些裂解基因盒子包括：来自λ噬菌体(NC_001416.1)的原始裂解基因盒子S₁₀₅-R-Rz-Rz1及S₁₀₅突变体S₁₀₅ (A52G)-R-Rz-Rz1、S₁₀₅ (C51S S76C)-R-Rz-Rz1^[28-29]，来自铜绿假单胞菌噬菌体LKD16 (GenBank登录号：NC_009935.1)的裂解基因盒子LKD^[30]，以及来自铜绿假单胞菌噬菌体LUZ19 (GenBank登录号：NC_010326.1)的裂解基因盒子LUZ^[31]。其中，S₁₀₅、S₁₀₅ (A52G)和S₁₀₅ (C51S S76C)基因编码Ⅰ型holin蛋白，R基因编码endolysin蛋白；而LKD和LUZ所编码holin属于Ⅱ型holin，其裂解基因盒子组成序列类似(图 1)。

在不同生长状态的大肠杆菌菌株Top10中，分别加入终浓度为0.2%的阿拉伯糖诱导裂解基因盒子表达，随后通过OD₆₀₀值的检测来观察细菌的裂解过程，结果如图所示。在OD₆₀₀值为0.5的细菌中(图 2A)，C51S S76C和A52G均可以快速地诱导裂解，裂解行为在加入诱导剂后数分钟内便发生。其中A52G的诱导表达可以引起细菌缓慢且持续地裂解，而C51S S76C的诱导表达在前12 min内即可以引起细菌的快速裂解，随后细菌的裂解逐渐趋于平缓。含有S₁₀₅的菌株在加入诱导剂大约18 min后才开始大量裂解，其裂解起始时间显著明显偏晚。以上结果与前人的结论相吻合，即A52G与C51S S76C是两个快速裂解突变体^[29]。但是我们也发现，在这种生长状态下，S₁₀₅的裂解效率(达到裂解稳态时的OD₆₀₀值越低则裂解效率越高)始终高于A52G与C51S S76C这两个突变体。我们同时观察到，与Ⅰ型holin无法兼顾裂解起始时间和裂解效率不同，诱导表达含有Ⅱ型holin的LKD和LUZ裂解基因盒子能够引起大肠杆菌快速且高效地裂解。LKD和LUZ在加入诱导剂5 min左右后，细菌即开始裂解，并在随后的6 min时间内达到裂解稳态，根据菌落形成单位(colony forming unit, CFU)计数统计，裂解的细菌比例到达99.99%以上(数据未展示)，裂解效率极高。此外，含有不同裂解基因盒子的菌株，在OD₆₀₀值为1.0的细菌中与OD₆₀₀值为0.5时相比，加入诱导剂后的裂解行为相差不大(图 2B)。

继续观察过夜(约12 h)培养后不同菌株的裂解行为。结果显示，在加入诱导物后，所有菌株的裂解行为均趋向平缓，裂解起始时间增加且裂解效率显著下降(图 2C)，而A52G仍然是裂解起始时间最早的裂解基因盒子。为了让细菌的裂解起始时间提前且更快地进入裂解稳态，我们首先将过夜培养的菌液以1:100稀释，再重新扩大培养至OD₆₀₀值约为1.0，再次加入诱导剂诱导裂解，由此引发的各菌株的裂解行为与图 2B中几乎相当。我们也意外地发现，通过稀释的方法使细菌的OD₆₀₀值降低至1.0附近，也能够使含有LKD和LUZ的菌株的裂解起始时间明显提前且能够迅速进入裂解稳态，而含有A52G和S₁₀₅的菌株的裂解起始时间则稍有推迟，这种现象有可能与细菌密度或者生长状态同时有关。

我们探究了不同诱导系统对细菌裂解行为的影响(图 2E、2F)。结果表明，通过鼠李糖诱导系统^[32]表达C51S S76C难以使大肠杆菌发生有效地裂解，诱导表达A52G的菌株可以引起缓慢地裂解，而诱导表达S₁₀₅的菌株在大约120 min开始发生明显的裂解行为，其裂解速度也显著慢于阿拉伯糖诱导系统。此外，在阿拉伯糖诱导系统中裂解起始时间相当的LUZ与LKD裂解基因盒子，在鼠李糖诱导系统中却产生了显著的差异。其中LKD的裂解起始时间在120 min左右，而LUZ的裂解起始时间在18 min左右，显著早于其他4种裂解基因盒子。综合以上结果，我们认为含有Ⅱ型holin的裂解基因盒子与I型holin相比能够更有效地引起大肠杆菌菌株裂解。此外，在对数生长期的细菌中，LUZ的裂解能力强于其他4个裂解基因盒子，在相同的载体中能够引起更快速且高效的细菌裂解。

随后，我们研究了诱导剂浓度对细菌裂解行为的影响(图 2G)。结果显示，在诱导剂浓度能够引发充分的基因表达的情况下^{[11, 32]}，在阿拉伯糖诱导系统中，不同浓度的诱导剂对裂解行为的影响程度较低；在鼠李糖诱导系统中，不同浓度的诱导剂对裂解起始时间几乎没有影响，而高浓度的诱导剂会引起更剧烈的裂解行为。我们也曾对图 2C中高OD的菌株中进行过高浓度的诱导剂(0.3% l-rhamnose)处理，结果发现其裂解曲线与0.1% l-rhamnose处理时没有显著区别。

我们又继续观察利用不同拷贝数的载体表达裂解基因盒子对细菌裂解行为的影响(图 2H)。结果显示，在观察的两个生长状态下，含有高拷贝载体(Tn7)的细菌裂解起始时间均早于含有低拷贝载体(pJN105)的细菌。我们还发现，含有高拷贝载体的细菌，其在OD₆₀₀约为1.0时的裂解起始时间与OD₆₀₀约为0.5时相比显著提前，这一现象在低拷贝载体中并没有出现。对于含有I型holin的S₁₀₅裂解基因盒子，我们也得到了与图 2F–G类似的结果(数据未展示)。这表明，不仅Ⅰ型holin的裂解行为是浓度依赖型的^[33]，Ⅱ型holin也是如此。

2.2 裂解行为与诱导系统背景表达量与诱导表达量的关系

我们需要在铜绿假单胞菌PAO1内构建含有裂解基因盒子的诱导表达系统，以表征其在PAO1中引起的裂解行为差异。将含有裂解基因盒子的pJN105质粒电转入PAO1后，琼脂板上没有克隆点形成。此外，过夜培养含有P_BAD-RBSII- S₁₀₅-pJN105与P_BAD-RBSII-A52G-pJN105质粒的大肠杆菌菌株难以达到很高的OD₆₀₀值，并有聚

集物残渣产生(图 3A左)。同时，虽然含有高拷贝载体的大肠杆菌的裂解起始时间较早，不过其自身在未加诱导剂时即会产生明显的自溶现象(图 3A右)，而在含有低拷贝载体的细菌中则未观察到类似现象产生。以上实验结果表明，相同的诱导系统中裂解基因本身裂解能力的不同，以及不同诱导系统在不同宿主之间的背景表达水平和诱导表达水平的不同都有可能造成裂解行为的差异。

通过荧光报告系统可以分析不同诱导系统在不同菌株中的背景表达水平和诱导表达水平。首先，我们在荧光显微镜下分别观察了携带P_BAD- RBSII-mScarlet-pJN105质粒的大肠杆菌菌株Top10和铜绿假单胞菌菌株PAO1(图 3B)。结果表明，在未添加诱导剂的情况下，阿拉伯糖诱导系统在大肠杆菌中的背景表达水平较低，而在铜绿假单胞菌中背景表达水平较高。前人也报道了阿拉伯糖诱导系统在铜绿假单胞菌中的高背景表达问题，并声称鼠李糖诱导系统在铜绿假单胞菌内有显著降低的背景表达水平及较高的诱导倍数^[32]。我们在pJN105和Tn7两种质粒载体中分别构建了这两套诱导系统，利用荧光强度的变化来观察它们在大肠杆菌和铜绿假单胞菌内的表达差异(图 3C)。我们发现通过低拷贝载体pJN105表达阿拉伯糖诱导系统或鼠李糖诱导系统时，其在铜绿假单胞菌内的背景表达量显著增加：鼠李糖诱导系统在PAO1中几乎完全失去背景抑制能力，在未加诱导物的情况下，该诱导系统在铜绿假单胞菌中的背景表达量是大肠杆菌中的1 700倍之多，而诱导表达量仅有10倍；阿拉伯糖的背景表达量也增加66倍，诱导表达量则仅有6倍。我们也发现，当保留鼠李糖诱导系统的原始核糖体结合位点时，虽然背景表达降至极低水平，但是在大肠杆菌和铜绿假单胞菌内几乎都丧失了诱导表达能力(数据未展示)。在大肠杆菌内，阿拉伯糖和鼠李糖诱导系统在高拷贝载体(Tn7)中的背景表达量分别是低拷贝载体中的4倍和23倍，诱导表达量则分别为2.8倍和1.0倍。通过Tn7质粒可将目的基因插入铜绿假单胞菌的基因组中^[34]，基因组表达的阿拉伯糖和鼠李糖诱导系统分别是低拷贝载体表达的背景表达量分别为1/12和1/450，而诱导表达量分别为1/4.0和1/4.5。我们意外地发现通过基因组表达鼠李糖诱导系统，可以显著降低背景表达水平，同时对诱导表达水平影响较小，这样就极大地增加了诱导倍数。我们还注意到，在基因组表达鼠李糖诱导系统中，是否含有RBSII对背景表达量影响不大(2倍)，不过诱导倍数却会产生38倍的差异，这提示我们或许可以通过调整RBS的强度来调整某些诱导系统的诱导倍数。

综合以上结果，我们认为，质粒表达的阿拉伯糖和鼠李糖诱导系统在大肠杆菌内背景表达低且诱导倍数高，因此能够引起快速高效地裂解；而在铜绿假单胞菌内的背景表达水平很高，因此裂解基因的泄露表达造成电转入铜绿假单胞菌后无单克隆点形成。背景表达略高的质粒(Tn7质粒，含有RBSII)则能够成功转化入大肠杆菌内，虽然其在加入诱导剂后能够很快裂解，不过泄露表达的裂解基因极易造成细菌的自溶。对于背景表达很低的诱导系统，若诱导倍数较高，则能引起细菌的快速裂解；若诱导倍数较低，则细菌的裂解起始时间均会延长，甚至造成某些裂解基因盒子难以引发细菌裂解(图 2E)。在诱导表达量较低的情况下，细菌能否有效裂解与裂解基因盒子的裂解能力有关。

2.3 在铜绿假单胞菌中诱导表达裂解基因盒子及引发的裂解行为

根据对诱导系统的摸索，选择用Tn7载体将鼠李糖诱导系统控制表达的裂解基因盒子整合入PAO1基因组中，以观察这些裂解基因盒子在铜绿假单胞菌PAO1中引发的裂解行为的差异。在含有原始RBS (AATGAAATTCA)的低诱导倍数表达系统中(图 4A)，仅有LKD和LUZ能够引起PAO1的裂解，而诱导表达属于I型holin的S₁₀₅及其突变体均无法引起PAO1的有效裂解。在添加了RBSII (AAGAAGGAGA)的高诱导倍数表达系统中(图 4B)，S₁₀₅与A52G也能够引起细菌的裂解，不过裂解效率并不高；而LKD和LUZ的裂解起始时间大幅提前，在1 h内即达到裂解稳态。上述结果表明，相同条件下，Ⅱ型holin在PAO1内的裂解效率也高于I型holin。我们继续测试了裂解基因盒子在稳定期铜绿假单胞菌中的裂解能力。结果如图 4C所示，在高OD₆₀₀值的菌株中加入诱导剂30 min内并没有引起细菌的有效裂解，裂解效率降低；在稀释处理后，裂解起始时间如大肠杆菌中那样发生前移，而LUZ的裂解效率在稀释前后始终高于LKD。此外，将过夜培养的菌液以1:100的比例分别稀释于LB和限制性FAB培养基中并培养至OD₆₀₀约为1.0后(图 4D)，细菌的裂解曲线没有显著的区别，表明营养成分的差异对裂解行为的影响较小。在起始细菌数量约为4×10⁸ CFU/mL的P_rhaBAD-RBSII-lysis cassettes-Tn7-PAO1的各菌株内加入鼠李糖诱导诱导10 h后，残存菌液的CFU统计结果如图 5所示。结果显示，C51S S76C的诱导表达无法使PAO1裂解；诱导S₁₀₅或A52G表达，超过99%的PAO1会发生裂解；诱导LKD或LUZ表达，裂解效率高于前3种裂解基因盒子。CFU统计结果与OD₆₀₀值结果一致，这也说明了通过OD₆₀₀对细菌裂解能力进行表征的可靠性。

2.4 光控裂解的基因线路设计

我们尝试将裂解基因盒子和光遗传学工具结合，构建可响应光进行裂解的工程化菌株。本课题组曾将可响应近红外光的光遗传学工具BphS用于PAO1胞内环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)浓度的控制，能够使c-di-GMP响应型启动子PcdrA在光照前后产生10倍左右的变化量^[27]。受此启发，首先将在PAO1裂解能力最强的裂解基因盒子LUZ放置于PcdrA启动子下游，以期构建光控裂解菌株。然而，该质粒在电转入BphS-PAO1菌种后没有单克隆点形成，这表明其背景表达水平过高；将PcdrA-LUZ片段整体插入PAO1基因组后，由于诱导倍数较低，光照之后未能有效引起PAO1裂解。

基于λ噬菌体表达裂解基因盒子的策略对基因线路进行了重新设计(图 6)。该基因线路的工作原理为：工程菌接受近红外光照射后，细菌胞内c-di-GMP浓度升高，开启Q蛋白的表达，当Q蛋白达到浓度阈值时，可以开启tR’下游裂解基因盒子的表达，使工程菌裂解，该转录终止系统已证实可应用于铜绿假单胞菌内控制基因的表达^[35]。具体来说，将LUZ放置于λ噬菌体转录终止系统pR’-tR’下游，在抗终止蛋白Q达到浓度阈值前，RNA聚合酶难以越过终止子tR’对下游基因进行转录^[36]，再利用Tn7质粒将这套系统插入PAO1基因组中，降低其拷贝数。希望通过这两种策略降低裂解基因的背景表达量，避免细菌的提前裂解。将抗终止蛋白Q放置于PcdrA启动子下游，同时在Q蛋白的N端添加SsrA蛋白水解标签ASV^[12]，以降低未诱导时Q蛋白在胞内的累积浓度。

2.5 可光控黏附指定表面及裂解的菌株筛选

光遗传学工具能够以极高的时空分辨率控制基因的表达^[37]，但是也会受到基因背景表达的干扰。PAO1的黏附行为与c-di-GMP浓度密切相关^[38]，细菌胞内的c-di-GMP浓度升高，细菌倾向于进行表面黏附，并产生大量胞外聚合物^[39]；当c-di-GMP浓度降低时，细菌容易从表面脱附。本课题组曾在PAO1中引入光遗传学工具BphS进行生物打印^[27]，然而背景表达水平的c-di-GMP即可使PAO1黏附于玻璃表面，从而难以进行高分辨率的生物打印。虽然通过引入蓝光响应的磷酸二酯酶可在光照时有效分解c-di-GMP，使细菌难以黏附在蓝光照射的表面，不过这一方法增加了系统的复杂程度及控制难度。通过持续性表达适量水平的磷酸二酯酶PA2133^[40]，降低细菌胞内的c-di-GMP浓度，有望抑制其表面黏附能力。结果证实，通过基因组插入的方式持续性表达PA2133，可以显著降低PAO1的表面黏附能力(图 7)。在未光照且细菌的初始黏附量相当的情况下，未表达PA2133的BphS-PAO1菌株，在表面黏附的数量逐渐增加，大约6 h后表面细菌的数量即达到初始数量的3倍；持续表达PA2133的BphS-PA2133- PAO1菌株，40 min后在表面的黏附数量即迅速下降至不足初始数量的50%，3 h后则几乎没有细菌黏附表面。我们将前期设计好的裂解模块与c-di-GMP分解模块通过miniTn7质粒同时插入PAO1基因组中，即得到在非光照条件下难以在表面黏附的底盘菌株BphS-LUZ-PAO1。

采用原始的PcdrA启动子和核糖体结合位点(RBS)表达抗终止蛋白Q，进行可光控裂解菌株的构建和筛选。多次重复实验后，发现含有该质粒的BphS-LUZ-PAO1菌株在光照时裂解效率较低，表明这套光控裂解系统的诱导表达水平较低。转录和翻译对基因的表达量有着重要的影响，其分别与启动子和RBS的强度有关。考虑到对PcdrA启动子进行突变和筛选的复杂性，而前期的实验也证实了通过调整RBS的强度也可以有效调整诱导系统的诱导倍数。我们使用不同强度的RBS对原始RBS进行替换，从翻译层次上调控Q蛋白的诱导表达水平。将待筛选菌株培养到OD₆₀₀约为1.0后，滴加不同体积的菌液于琼脂板上，随后施加持续光照，通过菌斑的生长情况对细菌的裂解能力进行评估。结果如图 8A所示，菌株Q16在光照48 h的时间内，琼脂板上没有单克隆点形成，表明Q16有极好的光响应裂解能力，而其他菌株则有可见的菌斑长出，说明其裂解不充分。我们还统计了微流装置内玻璃表面细菌的数量，对Q16的裂解行为进行更精确地表征(图 8B)。结果显示，在接受平均光强为50 μW/cm²的近红外光照射时，细菌在光照150 min之前，仍然可以在表面粘附和生长，表面细菌数量逐渐增多；而光照约150 min后，细菌开始缓慢裂解，表面细菌数量逐渐降低。上述结果表明，Q16拥有响应光裂解的能力，且裂解效率极高。

2.6 光控可裂解菌株修饰表面

工程化菌株Q16具有在指定表面黏附并裂解的能力。通过控制程序对指定视野施加近红外光照射后，由于裂解起始时间和施加光照的时间相比存在3–4 h的延迟，在这段时间内，Q16即能够在表面黏附并产生多种胞外聚合物，即完成对光照视野区域内的表面修饰，而非光照视野由于细菌难以黏附，因此表面没有胞外聚合物的修饰。细菌则在裂解开启后从体系中移除(图 9A)，增加了系统的生物安全性。从时序性明场显微镜图片中可以看出，在光照的前3 h内，表面细菌数量逐渐增加；在光照4 h后，表面开始有细菌的裂解残渣出现，细菌开始裂解；光照7 h后，表面出现大量细菌残渣，而存活的细菌数量非常少。

胞外多糖psl是帮助PAO1在生物表面或非生物表面黏附的主要物质之一，其主要成分包括甘露糖、葡萄糖和鼠李糖^[41]。在微流通道中，选择相邻的8组视野进行光照控制，其中4组视野不施加光照，而另外4组视野施加约50 μW/cm²的近红外光照射，实验结束后加入cy5-甘露糖染料对甘露糖进行染色实验，探究是否有胞外多糖存在于细菌黏附并裂解的表面，结果如图 9B所示。可以看出，在光照视野的表面上，可由cy5-甘露糖染料检测到大量甘露糖的存在，而在避光视野中，则几乎没有甘露糖的存在。上述结果表明甘露糖只存在于光照的表面，而避光表面由于细菌难以黏附，并没有甘露糖的存在。这样，本研究利用可光控裂解的菌株Q16，通过具有高空间分辨率的光照控制，实现了对玻璃表面的高空间分辨率修饰。

3 讨论与结论

本研究通过阿拉伯糖和鼠李糖诱导系统，分析了若干裂解基因盒子在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中所引发裂解行为的差异。结果表明：(1) 在大肠杆菌中，含有LKD和LUZ的菌株在高诱导表达量的系统中引发的裂解行为相似，而在低诱导表达系统中，LKD的裂解效率大大降低，而LUZ依然保持较高的裂解效率，表明LUZ是一种更强的裂解基因；S₁₀₅在加入诱导剂后存在明显的裂解延迟，但裂解开始后很快便进入稳态，而A52G和C51S S76C则能够快速地引起细菌的持续裂解。(2) 在铜绿假单胞菌中，诱导倍数不足的情况下，Ⅰ型holin难以引起铜绿假单胞菌的裂解，Ⅱ型holin所需的裂解起始时间也大幅增加；在高诱导倍数的系统中，Ⅰ型holin中的S₁₀₅和A52G也能够引起细菌裂解，不过裂解起始时间显著晚于LKD和LUZ，且裂解效率不高，而C51S S76C仍旧难以引起铜绿假单胞菌裂解。我们还发现，含有Ⅱ型holin的菌株裂解效率一般高于含有Ⅰ型holin的菌株，不过其在稳定期的裂解起始时间较晚且裂解速度较慢，而通过稀释的方法，可以有效地使菌株的裂解行为恢复至与对数期大致相当。

通过添加小分子诱导物诱导细菌裂解是目前绝大多数基因线路中都采用的方式^[42-44]，不过小分子诱导有其明显的劣势，包括依赖扩散、不可逆、某些诱导剂价格昂贵等，限制了其应用。因此，新型的细菌裂解诱导方式的开发是十分必要的。本研究中基于LUZ裂解基因盒子和光遗传学工具BphS构建的具有光控诱导裂解功能的工程化菌株，为摆脱传统裂解方式对小分子诱导物的依赖提供了思路。虽然通过光照控制细菌的裂解行为并非首次提出^[45]，不过我们设计的基因回路不仅实现了对裂解能力的控制，同时实现了对其黏附功能的控制，拥有更丰富的功能。与传统的表面修饰方法相比，通过工程菌进行表面修饰，不需要对表面进行预处理，具有一定的应用前景。以本研究为基础，可以从以下方面开展进一步的工作：(1) 细菌在粘附表面上形成的EPS中含有丰富的基团，这些有望成为可功能化修饰的位点；(2) 许多凝集素可以和EPS中的多糖结合^[46]，如果利用工程菌生产与凝集素融合的功能蛋白，将有望实现“功能蛋白合成-胞外聚合物产生并表面修饰-蛋白释放并固定-细菌移除”的高时空分辨率的原位一体化表面修饰；(3) 由于铜绿假单胞菌可在多种表面产生黏附，因此可继续探究对其他表面进行修饰的可能。当然，我们也注意到了这种修饰方法的不均匀性，主要原因是光照时间不久后细菌便开始裂解，表面黏附的细菌数量不足。如果可以增加新的控制元件对黏附行为和裂解行为进行解耦，或者使用类似S₁₀₅这类有较长延迟时间的裂解基因盒子，或许可以解决这个问题。

裂解基因盒子作为一种极其特殊的“毒性蛋白”，需要采用严谨型的诱导系统控制其背景表达，以降低其泄露表达对宿主的损伤。一般来说，由于诱导系统均存在背景表达量，而随着拷贝数的增加，这种背景表达量会被放大，因而拷贝数越大则相应的背景表达量也会越高，因此低拷贝载体或者基因组表达是进行裂解基因功能构建的优选策略。而在添加诱导剂后，又需要裂解蛋白达到一定的诱导表达水平，才能够使宿主有效裂解，因此，表达裂解基因的理想诱导系统需要足够低的背景表达量和足够高的诱导表达量。许多诱导系统在模式菌株例如大肠杆菌和沙门氏菌中，已做过详细的表征，因此基于这些诱导系统可以方便地构建出不同的裂解系统^[15-16]。我们的研究表明，不同的诱导系统在不同的载体中表达、用相同的载体在不同的宿主中表达或者简单地调节RBS强度，都会使诱导系统的性质产生巨大的差异。将已有的诱导系统移植到非模式菌株中，若其诱导表达量水平较低，可能无法诱导细菌的裂解；而如果背景表达量过高，可能造成细菌的自溶或者无法成功构建菌株。因此，对于非模式菌株而言，由于缺少对诱导系统的系统表征，在不同的宿主内构建裂解系统仍是一个巨大的挑战。

除了诱导系统，裂解基因盒子本身裂解能力的差异也是裂解系统构建的一大关键考虑因素。以本研究中涉及的5种裂解基因盒子为例，在高诱导表达下，其都能够引起细菌裂解，不过裂解行为有一定的差异；在低诱导表达下，某些裂解基因盒子裂解效率较低甚至难以引起宿主的裂解。高诱导倍数系统的开发是一项复杂的工作^[47]，大多数现有诱导系统的诱导幅度远低于本研究中所使用的阿拉伯糖或鼠李糖诱导系统。当与低诱导倍数的诱导系统联合使用时，需要使用裂解能力强的裂解基因盒子以完成可裂解菌株的构建。因此，未来在其他宿主内开发与表征更多高效的裂解基因盒子，对于合成生物学工具箱的进一步拓展是十分必要的。