水稻白叶枯病是由一种水稻黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)侵染引起的细菌性病害，发病后叶片迅速枯死，导致水稻减产10%–30%，严重时可达50%以上或绝收，是水稻的“三大病害”之一^[1]。化学农药易残留，造成环境污染，不仅破坏了生态平衡，还间接影响人类健康；而选育抗白叶枯病的水稻品种虽是经济、环保的防治方法，但是育种周期长，大面积使用单一抗源也容易导致抗性丧失^[2]。因此，开发针对水稻白叶枯病的新型防治方法具有重要的意义。生物防治以其高效环保的防治手段，在植物病虫害防治方面迅速发展。其原理是利用某种生物抑制病原生物的生长繁殖^[3-5]。该防治方法所用的生物制剂来自于自然环境，绿色环保；且作用机制多样，如产生和分泌有毒化合物、释放化学信号、进行有限资源的竞争、提高寄主系统抗性和促进寄主生长等^[6-9]，可减少病原生物对某一制剂产生抗性，抑制作用持久。其中，最理想的制剂是具有抑菌活性的微生物，其分布广、数量大、易分离、生长繁殖快，在农产品种植和生产过程中，发挥着重要作用。

目前，芽孢杆菌是应用最广泛的生防细菌之一，对于各种真菌、细菌和病毒的侵染所造成的植物病害均能有效抑制^[10]。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)作为芽孢杆菌属的一个新种被广泛关注，最早在1999年被分离，2005年被首次报道和命名^[11]。这一新种确立较晚，但该细菌广泛分布于自然界的水体、土壤、空气、植物根系、植株表面和动物肠道等，种质资源相对丰富。当其分类地位被确定以后，特别是2016年以来，发表的与该菌相关研究论文、专利呈现快速增长态势^[11]，在生物防治、药物研发、食品发酵和工业应用等方面均具有重要的应用价值。贝莱斯芽孢杆菌能产生具抑菌活性的次级代谢产物，如脂肽类抗生素(表面活性素、芬枯草菌素、伊枯草菌素等)、抗菌蛋白、水解酶类(如纤维素酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶等)等^[12]，种类丰富、稳定性好、抗菌谱广，目前已在番茄、马铃薯、玉米和葡萄等农作物^[13-16]病害的实验研究中取得初步成效。还有一些植物内生的贝莱斯芽孢杆菌，可诱导激发植株自身防御系统，提高抗性来抵抗病菌侵害，同时还能够产生吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)，促进植物生长^[17]。然而，在应用过程中，贝莱斯芽孢杆菌的菌株特性、作用对象以及使用的剂型、方式、周期都会影响其应用效果。目前，在对主要粮食作物水稻的细菌病害防治研究方面，贝莱斯芽孢杆菌作为生防制剂还尚未见系统的研究报道。

本研究筛选到一株有效拮抗Xoo的菌株，经形态学和分子生物学鉴定，确定为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)，命名为Bv-303 (保藏号：CGMCC No. 23395)。针对Bv-303菌株对Xoo的拮抗作用及其在水稻白叶枯病的生防效果，通过体外、体内的抑菌实验，分析其抑制Xoo的最佳培养条件、各种环境因素下的稳定性以及自然环境下的生防效果，挖掘Bv-303菌株在水稻白叶枯病绿色防控中的应用价值。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

拮抗菌株Bv-303，分离自浙江省金华市赤松镇樱桃园短柄樱桃健康叶片。白叶枯病菌Xoo：中国生理小种浙173、C2以及菲律宾生理小种PXO86、PXO71、PXO99等，由中国农业科学研究院作物科学研究所提供，用于拮抗菌株筛选、培养条件筛选、发酵液稳定性试验以及生物防效试验。

1.2 植物材料及培养条件

水稻(Oryza sativa L.)品种：中花11、武运粳7号、南粳9108。取籽粒饱满的水稻种子，清水37 ℃浸泡催芽，水培7 d后移栽到温室土壤中，28 ℃ (光照16 h/黑暗8 h)培养至分蘖盛期(约60 d)，用于拮抗菌株抗病效果测定。

1.3 Bv-303菌株发酵液、上清液、菌悬液制备

将活化好的Bv-303菌株用接种环挑取一环接种于牛肉膏蛋白胨培养基(nutrient broth, NB)中，28 ℃、180 r/min振荡培养24 h，获得母液。然后按1% (母液体积/培养基体积)接种于NB培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，获得发酵液(cell-culture broth, CCB)；发酵液18 700×g离心10 min，分别收集上清与沉淀，上清液采用0.22 μm微孔过滤器过滤，获得上清液(cell-free supernatant, CFS)；沉淀用无菌水稀释，获得菌悬液(cell-suspension water, CSW)。

1.4 拮抗菌株Bv-303的鉴定

挑取拮抗菌于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(nutrient agar, NA)上划线，在28 ℃培养箱中培养24 h，参考《微生物学实验》中微生物的染色、形态和表面结构观察^[18]，观察菌落大小、形态、色泽等特征；用光学显微镜观察细菌革兰氏染色、芽孢染色结果；用扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察拮抗菌及后期实验中经过处理后的拮抗菌的表面形态^[19]。挑取长势良好的Bv-303单菌落接种于NB培养基，培养至对数期，取培养液离心后收集菌体，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取DNA；根据文献[20]报道的引物，对细菌的5个保守基因16S rDNA、gyrA、gyrB、rpoB与purH进行PCR扩增，并寄送生物技术公司进行测序。采用多位点序列分析(multilocus sequence analysis)^[20-21]，先将5个基因片段的测序结果进行串联，再通过Mega 7.0软件的ClustalW与其他细菌的相应片段进行比对，最后按照邻接法(neighbor-joining, N-J)构建多基因联合系统发育树(bootstrap值为1 000)，对Bv-303菌株进行分子分类鉴定。

1.5 Bv-303菌株抑菌效果的培养条件优化

按1.3方法，分别获得菌株Bv-303在NB、培养基、马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose broth, PDB)、Luria-Bertani培养基(Luria-Bertani, LB)、YS培养基和Landy培养基中培养的发酵上清液；用无菌水将已活化好的浙173菌液稀释至OD₆₀₀=0.3，取100 μL均匀涂布于改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)平皿上，将牛津杯垂直插入平皿中央，勿接触平皿底部。吸取200 μL发酵上清液滴入牛津杯中，平皿封口并放置于28 ℃培养箱中培养2–3 d。取出平皿并测量抑菌圈大小，确定最佳抑菌效果的最适培养基。每个样品3次重复，采用SPSS软件进行显著性分析。

将活化好的菌株Bv-303接种于最适培养基中，分别培养24、48、72、96、120、144 h，依照1.3方法获取相应的发酵上清液进行抑菌试验，测量抑菌圈大小，确定最佳培养时间。

1.6 菌株Bv-303抑菌作用的稳定性分析

取菌株Bv-303的发酵上清液，分别进行如下处理。(1) 酸或碱：用1 mol/L的HCl或NaOH溶液将其pH值调至偏酸(1–2、5–6)、偏碱(9–10、11–12、13–14)或中性(7–8)，静置24 h后调回发酵液原pH；(2) 紫外线：在紫外灯(254 nm)下照射0.5、1、2 h；(3) 热处理：于20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃恒温水浴1 h；(4) 保存时间：在4 ℃下保存5、10、20、30、40 d。以未处理的上清液作为对照，采用牛津杯法，测定以上不同处理后的上清液对Xoo的抑制。

1.7 Bv-303菌株的体外抑菌效果分析

取Bv-303菌株的发酵上清液，将多种Xoo生理小种活化后，分别涂布在改良PDA平板培养基上，方法同1.5，测定上清液对不同Xoo生理小种的抑菌效果。

1.8 Bv-303菌株在水稻体内的抑菌效果分析

先获取Bv-303菌株的发酵上清液、菌悬液和发酵液，方法同1.3；用剪刀蘸取Xoo菌液，在水稻叶尖2 cm处剪叶接种^[20]；对接种叶片分别喷施Bv-303发酵上清液、菌悬液或发酵液，以清水为空白对照，每次间隔1 h，连续处理5次，连续处理5 d。接种15 d后，测量病斑长度，计算抗性提高率。

抗性提高率=(对照组病斑长度–实验组病斑长度)/对照组病斑长度×100%。

1.9 Bv-303菌株对水稻生长发育的影响分析

挑选籽粒饱满的武运粳7号与南粳9108种子，表面消毒后，用Bv-303菌株的发酵液浸泡10 h，后转置于发酵液浸润的滤纸片的培养皿中，28 ℃恒温培养72 h后，计算发芽率，以清水处理为对照；挑选发芽一致的种子，分别在清水和发酵液中28 ℃ (光照16 h/黑暗8 h)培养箱中培养7 d后，测量植株的根长与地上部分长度。

2 结果与分析 2.1 拮抗菌株的鉴定

拮抗菌株Bv-303在NA培养基上呈现乳白色不透明菌落，表面褶皱，边缘不规则，黏稠不易挑起(图 1A、1B)；革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌(图 1C)；能产生芽孢，呈椭圆形，中生(图 1D)；在扫描电镜下观察，菌体呈长杆状(图 1E)。为了进一步对Bv-303菌株进行分子分类鉴定，对该菌株的5个保守基因16S rDNA (获得有效片段的长度为1 360 bp, 下同)、gyrA (936 bp)、gyrB (1 144 bp)、rpoB (533 bp)、purH (822 bp)进行PCR扩增和测序，再利用多位点序列分析法，与芽孢杆菌属的14个种、嗜碱芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属和多粘芽孢杆菌属等菌株进行比对，并构建多基因联合系统发育树(图 2)。结果表明，Bv-303菌株与贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) CBMB205归在同一分支上，综合形态和染色测定结果可以确定菌株Bv-303为B. velezensis。

2.2 Bv-303菌株具有广泛的体外拮抗能力

水稻Xoo进化出了许多不同的生理小种，其致病性与毒性差异较大。从我国与菲律宾多个生理小种中，挑选毒性很强的浙173与PXO99，毒性中等的C2、PXO86、PXO71，通过Bv-303菌株发酵上清液的体外拮抗试验，发现其具有广泛的抑菌性(图 3A–3E)。尽管对抑制不同毒性的Xoo生理小种没有表现出正相关的抑菌趋势，但抑菌圈直径均达到4.2–5.4 cm (图 3F)，抑菌率约为85.7%–88.0%，抑菌效果显著。

为了进一步分析Bv-303菌株对Xoo菌的影响，取以上制备的发酵上清液，经10倍、50倍稀释后，与PXO86共培养，以不添加任何发酵上清液正常培养的Xoo菌为对照，进行直接接触拮抗实验，随后在扫描电镜下观察。对照处理的Xoo菌体呈杆状，两端钝圆，菌体表面光滑、饱满无皱褶，而经过不同稀释度发酵上清液处理的Xoo菌体表面明显变粗糙、皱缩甚至破损，菌体形态异常，稀释10倍的发酵上清液对Xoo菌体的破坏更严重(图 3G–3I)。

2.3 Bv-303菌株最佳抑菌效果的培养基和培养时间

首先，采用5种不同培养基对Bv-303菌株分别进行培养，比较各发酵上清液对浙173的体外拮抗作用，发现其抑菌效果存在显著性差异(图 4A)。其中，PDB培养基的发酵上清液其抑菌效果最佳，抑菌圈直径均值可达4.2 cm，其次是LB、NB、YS培养基，Landy培养基效果最差。因此，本研究的后续实验均采用PDB培养基对Bv-303菌株进行发酵培养。

将Bv-303菌株在28 ℃恒温振荡器培养，每隔24 h取一次发酵上清液，共取6次，进行体外的拮抗实验。结果表明，培养48 h的发酵上清液对浙173的抑菌效果最好，与其他培养时间的发酵上清液的抑菌效果有显著性差异(图 4B)，因此，本研究的后续实验选择48 h作为培养Bv-303菌株的培养时间。通过测定Bv-303的生长曲线(图 4C)可知，该菌在48 h时处于生长平衡期，此时次级代谢产物浓度较高，也有较好的抑菌效果。

2.4 Bv-303菌株发酵上清液具有稳定的抑菌效果

为了研究Bv-303菌株发酵上清液的抑菌稳定性，选取加热、酸碱、紫外线及保存时间处理，并分别对其抑菌效果进行分析。结果表明，其发酵上清液具有良好的热稳定性和较好的酸碱耐受性，紫外线照射2 h内或保存时间40 d内对浙173的抑菌效果均无显著性影响。具体表现为：20–40 ℃热处理对抑菌效果无影响，50–60 ℃热处理使抑菌效果有小幅下降(图 4D)；在偏酸性的条件下有更好的稳定性，pH在5–8之间，抑菌效果稳定，而在偏碱性条件下，抑菌效果显著下降(图 4E)；紫外线照射0–2 h无显著性差异(图 4F)；不同保存时间对抑菌效果影响不大，10 d后虽有下降趋势，但直至40 d，其抑菌圈仍能达到4.3 cm左右(图 4G)。

2.5 Bv-303菌株可提高水稻对白叶枯病的抗性

在体外拮抗实验的基础上，进一步在水稻体内分析Bv-303菌株及其发酵产物对Xoo的抑制效果。在水稻高感品种中花11叶片接种浙173或PXO86，然后分别喷施Bv-303菌株的发酵上清液、菌悬液、发酵液，与喷施清水的对照组相比，3种处理均使水稻叶片的病斑长度明显缩短(图 5A、5B)，显著提高了抗病性，表明Bv-303菌株及其发酵产物对水稻白叶枯病害有较好的防治效果。

通过对PXO86与浙173侵染叶片病斑长度的测量，发现经发酵液处理的水稻其抗病性提高了53.8%–62.7%，而发酵上清液处理分别提高了19.7%与21.4%，菌悬液处理则分别提高了31.1%与39.2% (图 5C、5D)。可见，Bv-303菌株发酵液的抑菌效果最佳，比其菌悬液或发酵上清液对白叶枯病害具有更好的防治效果。

2.6 Bv-303菌株不影响水稻种子的萌发与生长

一株好的生防菌，除了具有好的防治效果外，不影响植物的生长发育也是它能广泛应用的重要特征。通过Bv-303发酵液对不同水稻品种的种子浸泡萌发实验，发现其不影响水稻的发芽率(图 6A)；在水稻幼苗生长过程中，培养液中加入Bv-303发酵液，对苗的地上部分(图 6B)、地下部分(图 6C)进行测量后，发现它也不影响水稻植株的生长发育，反而对武运粳7号根的生长还有显著的促进效果。

3 讨论

贝莱斯芽孢杆菌与其亲缘关系相近的物种通过表型难以区分，因此，保守基因或基因组序列进化分析被广泛用于贝莱斯芽孢杆菌的物种鉴定。在分子水平上，基于16S rDNA基因序列进化分析结果显示，贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌亚种和解淀粉芽孢杆菌序列相似性高达99%，高于物种划分推荐的阈值^[22]。近年来，通过多基因片段联合构建系统发育树进行物种界定的方法为微生物的分类研究提供了新的思路^[23]。相对于16S rDNA单一基因的物种鉴定，多基因联合分析法能够更明确地确定属内种的分类地位。本研究中，我们通过结合多个保守基因16S rDNA、gyrA、gyrB、rpoB、purH构建五基因系统发育树，联合分析确定贝莱斯芽孢杆菌的分类地位^[24]。同时结合菌落形态特征和菌体染色结果，最终鉴定Bv-303为贝莱斯芽孢杆菌。

方园等^[25]筛选到一株贝莱斯芽孢杆菌SF327，平板抑菌活性试验显示，该菌对水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A具有拮抗作用，抑菌率约为75.92%。本研究发现Bv-303发酵液对多个白叶枯小种(PXO86、PXO71、C2、浙173等)均表现出较显著的抑制效果，体外抑菌直径达到了5.4 cm，抑制率可达85.7%–88.0%，显著高于已报道其他生防菌对Xoo的体外抑制效果^[26-28]；同时，Bv-303抑菌物质具有良好的耐酸碱、紫外线、热稳定性与耐储藏特性；展现了较好的应用前景。我们利用发酵液喷施水稻植株，发现抑制白叶枯病害可达到50%–60%，相较于其他Xoo拮抗菌如短小芽孢杆菌AS (抗性提高11.2%)、芽孢杆菌D13 (抗性提高37.0%)^[29]的防治效果有大幅度提高，且相对于农田常用的春雷霉素、噻菌铜等化学药剂(抗性提高20%–40%)也更为有效。

芽孢杆菌对病原微生物的拮抗作用主要是通过分泌抑制活性的次生代谢物起作用。研究表明，贝莱斯芽孢杆菌的发酵液中含有脂肽类抗生素、抗菌蛋白、聚酮类抗生素等多种抗菌物质^{[17, 30]}。陈芳芳等^[31]筛选得到的菌株B. velezensis X49具有11个编码的丝氨酸蛋白酶和30个编码的非核糖体肽合成酶，包括表面活性素、脂肽类化合物等。其中蛋白水解酶可以攻击植物病原真菌细胞壁；而脂肽含有脂肪酸链和疏水性基团，具有很好的脂溶性，易与细菌磷脂层反应，因而可导致细胞溶解和死亡，具有良好的抗菌效果^[32]。结合电镜扫描图中Xoo菌体形态变化，我们猜测菌株Bv-303可能也会分泌某种酶类或者脂肽类化合物破坏Xoo的细胞膜和细胞壁的完整性，使其失活，从而起到抑菌作用。但是菌株发酵液中成分复杂，目前尚未明确具体是哪一些产物或者物质对水稻白叶枯病菌有拮抗作用，需要进一步分析其抗菌物质以及相关抑菌机制。此外，孙平平等^[33]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌体内含有海藻糖运输蛋白基因，合成的海藻糖代谢物具有的抗紫外线、耐酸碱和耐冷热能力，这为发酵产物的稳定性提供了保证。

一些生物防治物或者化学制品经常会对保护作物产生负面影响，而本研究发现Bv-303发酵液对水稻种子的萌发及幼苗的生长均无显著影响，相对发芽率可达到97%，远高于目前市面上广泛应用的化学试剂^[34]，且Bv-303发酵液对水稻幼苗根的生长发育还呈现出一定促进作用。已有研究表明贝莱斯芽孢杆菌HM3-3菌液可以使大豆更好地吸收土壤养分，达到促进生长的效果^[35]，徐欣韵等^[36]将贝莱斯芽孢杆菌B23应用于防治番茄青枯病时，发现番茄植株增高、茎加粗，地上部鲜重增加，且地下部根分叉数增加。经进一步研究发现，该菌处理后的植株IAA关键基因ctd1的表达显著增强，而乙烯的关键基因ERF2表达量下降，从而促进番茄植株的生长。贝莱斯芽孢杆菌SQR9能够与黄瓜根围本身存在的益生假单胞菌协同作用提高菌生物膜的形成以达到促生作用^[37]。Backer等^[38]研究表明，根围益生菌(如芽孢杆菌属)能招募有益菌群的重组促进植物生长或者抑制土传病原菌或者减少根际其他有害微生物的根部病原菌和菌群，从而有利于植物的生长。众多研究均证明贝莱斯芽孢杆菌对植株有促生作用，因此Bv-303对水稻的促生作用及机理也有待继续研究。

贝莱斯芽孢杆菌Bv-303对Xoo具有稳定的抑制作用，在水稻中可有效防治其病害程度，且不影响水稻的正常生长发育，为水稻白叶枯病害的绿色生物防治提供了一种有效的新途径，但目前基于活的微生物作为生防菌剂用于商业化推广受到一定的制约，如自然环境中合成的活性代谢物浓度不足等问题。因此，仍需要进一步研究Bv-303的具体拮抗机理、分离纯化有效抑菌物质等来提高生防制剂的实效性，相信能够在水稻病虫害防治方面发挥重要作用。