钙离子(Ca²⁺)是一种关键的胞质第二信使，胞内Ca²⁺浓度发生改变会通过Ca²⁺传感蛋白及其靶蛋白调节各种细胞反应^[1]。目前，Ca²⁺传感器主要分为4类：钙调素蛋白(calmodulin, CaM)、钙调神经磷酸酶B样蛋白(calcineurin B-like protein, CBL)、钙依赖性蛋白激酶(Ca²⁺-dependent protein kinases, CDPKs)以及缺乏EF手基序的Ca²⁺传感器^[2]。其中，CaM是钙信号转导途径中的主要信号分子，与Ca²⁺结合后构象发生变化，激活靶蛋白即钙调素结合蛋白(calmodulin- binding proteins, CaMBPs)。CaM能与CaMBPs中的钙调素结构域(CaM binding domains, CaMBDs)发生相互作用^[3-4]。CaMBD氨基酸序列包含3种基序(motif)：一个不依赖Ca²⁺的IQ基序与2个依赖Ca²⁺的1-5-10和1-8-14基序^[5]。由于CaMBDs基序的数量以及排列不同，造成了CaMBPs具有可变性，从而在植物发育^[6]、激素调节^[7]、防御反应^[8]等过程中发挥多样性的功能。IQD (IQD67-domain containing protein)基因编码一类植物特有的CaMBPs，均含有一个由67个保守氨基酸组成的IQ67结构域，具有IQ基序(IQxxxRGxxxR)或([ILV]QxxxRxxxx[R, K])、1-5-10基序([FILVW]x3[FILV]x4[FILVW])和1-8-14基序([FILVW]x6[FAILVW]x5[FILVW])^[9-10]。拟南芥AtIQD1是最早发现的IQD基因，之后在拟南芥中又鉴定出32个IQD1同源基因^[11]。IQD基因普遍存在于各种植物中，从低等的苔藓到高等的被子植物，在高等植物中多以基因家族的形式存在，如水稻^[11]、玉米^[12]、大豆^[13]、番茄^[14]、黄瓜^[15]、葡萄^[16]、二穗短柄草^[17]、毛果杨^[18]等IQD基因都有相应的报道。

研究发现AtIQD1定位于细胞核中，正调节拟南芥植株的芥子糖含量，从而提高昆虫对草食的耐受性^[19]。AtIQD22在植物激素赤霉素的反应中起负调节作用^[20]。过度表达AtIQD11或AtIQD16的转基因植株的莲座叶、子叶和下胚轴细胞显著伸长，并表现出左螺旋生长，而过表达AtIQD14则使转基因植株出现强烈的器官扭曲，但叶片伸长无明显变化^[21-23]。AtIQD5的功能性缺失会导致表皮铺面细胞形态发生缺陷^[24]，而AtIQD13被证明可以调节次生细胞壁凹坑的大小和密度^[25]。将小麦IQD基因遗传转化到拟南芥中，发现过表达TaIQD18-2后子叶变细长，而过表达TaIQD2-2后子叶形态没有变化，但会明显影响叶片和后期角果的空间排列^[26]。这些研究结果表明IQD蛋白在调节细胞形态和细胞骨架方面功能具有多样性。番茄SlIQD12与拟南芥AtIQD12高度同源，在番茄品种“Sun1642”中其第7号染色体上由逆转座介导插入了一段24.7 kb的片段，该片段中SlIQD12基因被重新排列，使SlIQD12基因的拷贝数增加，从而表达量上升，导致番茄果实变得细长，并影响叶片、花器官等形态的变化^[27-28]。此后，又将IQD基因称为SUN基因。SUN基因在开花期对果形的影响是显著的，尤其是在授粉及受精之后子房形状出现较大差异。SUN基因的表达量与子叶、花器官、子房细长表型呈正相关，与种子生物量呈负相关。总的来说，番茄果实的形态变化是由SUN基因通过影响生长素分布，增加了果实纵向的细胞分裂、减少了果实横向的细胞分裂导致的^[29]。

草莓是一种口感好、营养丰富的水果，属蔷薇科植物^[30]。草莓栽培种多为八倍体，而野生种森林草莓(Fragaria vesca)是二倍体，其基因组大小为240 Mb，已完成高质量测序^[31]，为草莓的基因家族鉴定提供了很好的工作基础。尽管SUN基因已在多种植物中被研究，但是草莓SUN基因的研究还未见报道。本文通过生物信息学方法鉴定了森林草莓的SUN基因家族，并对基因的结构、蛋白保守结构域、系统进化、顺式作用元件以及组织表达模式进行了分析，为进一步研究草莓SUN基因的生物学功能及其分子机制奠定了基础。

森林草莓(F. vesca) “Ruegen”种子来自沈阳农业大学果树分子生物学实验室，种植在含有土壤的塑料盆中，在温度25 ℃/23 ℃ (16 h光照/8 h黑暗)条件下生长。在播种75 d后，挑选生长状况一致的森林草莓，分别取根、茎、叶、花、花柱、花药、绿色花托、绿色瘦果组织，用于基因的组织表达分析，每个组织3次生物学重复。在播种40 d后，选择生长状况一致的森林草莓“Ruegen”苗，分别用4 ℃、200 mmol/L NaCl和20% PEG6000进行逆境胁迫处理，在处理后0、2、12和24 h进行取样，每个样品3次生物学重复。以上材料均采用液氮速冻，保存于–80 ℃备用。

以拟南芥AtSUNs蛋白序列^[32]为Query，使用蔷薇科基因组GDR数据库的tBlastn工具(https://www.rosaceae.org/blast/protein/nucleotide)，选择森林草莓基因组(F. vesca genome v4.0.a2)作为数据库进行比对；使用Pfam (http://pfam.xfam.org/)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)对候选的FvSUN蛋白进行IQ结构域验证。通过ExPASy在线软件(https://web.expasy.org/protparam/)分析FvSUNs蛋白的分子量、等电点(pI)、脂肪族指数、不稳定性指数等^[33]。采用Cell-PLoc 2.0在线软件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)预测FvSUNs蛋白的亚细胞定位。

从GDR数据库中下载F. vesca v4.0.a2的基因组注释文件，使用TBtools软件对FvSUNs基因的染色体定位进行可视化。使用MCScanX^[34]进行基因组的共线性分析，参数设为默认值E-value≤1e^–10。将森林草莓的基因组进行自身比较，根据结果筛选出森林草莓中的旁系同源基因，即重复基因；若1对重复基因位于染色体上的邻近位置(< 100 kb)，就可以认定为串联重复基因(tandem duplication)，其他则为片段重复基因(segmental duplication)；将森林草莓与拟南芥的基因组进行比较，可筛选出这两者间的直系同源基因。使用TBtools软件绘制共线性图。使用MEGA软件^[35]，选用neighbor-joining法，构建植物SUNs蛋白的无根系统发育树，bootstrap值设定为1 000。

从森林草莓的基因组注释文件中获取基因外显子的信息，用TBtools绘制基因结构图。利用MEME软件(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)鉴定FvSUNs蛋白的保守基序，利用钙调素靶数据库(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/home.html)预测FvSUNs蛋白的钙调素结合位点。

利用已公布的森林草莓RNA-Seq转录数据^[31]，获得其根、茎、叶、花、花托、种子等不同组织、不同发育时期的FvSUNs基因转录本的TPM (transcripts per million)值，并通过TBtools软件对FvSUNs基因的表达水平进行聚类及绘制热图。

采用EASY Spin Plus Plant RNA Rapid Extraction Kit (Aidlab公司)提取森林草莓组织样品的总RNA，再用Prime Script RT Reagent Kit试剂盒(TaKaRa公司)合成cDNA，操作步骤按产品说明进行。用TB Green^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa公司)，10 µL体积中含有5 µL 2×SYBR^®预混料Ex Taq^TM Ⅱ、3.3 µL ddH₂O、0.5 µL基因特异性引物(表 1)、0.2 µL ROX参考染料Ⅱ和1 µL cDNA，在ABI 7500快速实时PCR系统(ABI公司)中运行real-time PCR，程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s和60 ℃ 30 s，共40个循环。实验重复3次，以草莓Actin基因作为标准化的内部对照^[36]，数据分析采用2^‒ΔΔC_t法^[37]。

利用已报道的33个拟南芥AtSUNs蛋白序列在森林草莓基因组中进行BLAST分析，搜索SUN同源基因，并根据基因组注释获取相应基因的编码区序列与编码蛋白序列，再对这些蛋白序列进行保守结构域分析，筛选出含有IQD67结构域的蛋白，确定为SUN蛋白，最终鉴定出31个SUN同源基因。根据基因在染色体上的位置顺序(图 1A)，依次命名为FvSUN1‒ FvSUN31 (表 2)。FvSUNs基因序列的长度存在明显的差异，编码区序列(CDS)为426–4 590 bp，编码蛋白的序列为141–1 529 aa，蛋白的分子量在16.1–591.1 kDa之间；除FvSUN8 (pI 5.28)、FvSUN5 (pI 5.72)和FvSUN12 (pI 6.35)外，其余FvSUNs蛋白均具有相对较高的等电点(pI > 7.0，平均值为9.77)，且大多数含有碱性氨基酸；FvSUNs蛋白的不稳定系数在34.30–69.27之间，都属于不稳定蛋白；蛋白的总亲水性均小于0，均为亲水蛋白；脂肪族氨基酸指数分布在54.81–98.94之间，其热稳定差异较大。FvSUN基因家族各个成员的基本信息与理化特征详见表 2。

图 1 森林草莓FvSUN基因的染色体分布与序列特征 Fig. 1 Chromosome distribution and sequence characteristics of FvSUN genes in Fragaria vesca. A: Chromosome location of FvSUN genes. B: Cluster tree of 31 FvSUN proteins, seven subfamilies (I‒VII) are highlighted with different colors. C: Gene structure, exon and intron are represented by yellow box and black line, respectively, and untranslated regions (UTRs) are represented by green boxes. D: Motif pattern of amino acid, each motif is represented by a different colored box. E: LOGO of the three motifs.

图选项

在系统发育树中，31个FvSUNs被归为7个组(图 1B)。尽管FvSUNs基因间的外显子数目差异较大(2‒38个)，但是同一组基因的外显子数目非常相似，而第Ⅱ组FvSUN基因外显子数目明显多于其他组，其中FvSUN15存在较少的外显子，为29个，而FvSUN6和FvSUN14包含多达38个外显子(图 1C)。在FvSUNs基因编码的蛋白中，鉴定到3类不同的保守基序，基序1即为IQD结构域，所有FvSUNs蛋白都含有；而基序2和基序3是第Ⅱ组特有的，目前功能仍未知(图 1D、1E)。通过FvSUN蛋白的序列比对，也发现同一组内成员的IQD结构域序列一致性更高(图 2)。Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ组成员的IQ67结构域含有3个精确间隔的IQ基序、3个1-5-10基序和3个1-8-14基序；而在第Ⅱ组成员的IQ67结构域则含有4个IQ基序，3个1-5-10基序和4个1-8-14基序；每个IQ基序与1-5-10基序或1-8-14存在部分重叠(图 2)。已有研究表明SUN蛋白通过CaM结合位点与Ca²⁺特异性结合，从而传递细胞核的钙信号^[22]。我们对FvSUNs蛋白的CaM结合位点进行了预测，结果表明FvSUNs蛋白都含有1‒3个高评分的氨基酸残基区(表 3)，这些残基区域可能就是SUN蛋白的CaM结合位点。同时也对FvSUNs蛋白的亚细胞定位进行了预测，发现27个蛋白定位于细胞核，而FvSUN9和FvSUN22定位于细胞核和叶绿体，FvSUN1和FvSUN2定位于叶绿体(表 2)。

图 2 森林草莓FvSUN基因家族编码蛋白的IQ67结构域序列比对 Fig. 2 Sequence alignment of IQ67 domains in the proteins encoded by FvSUN gene family of Fragaria vesca. Five subfamilies (I, II, IV, VI and VII from Figure 1B) of FvSUN proteins were analyzed.

图选项

为了研究森林草莓FvSUNs基因的进化关系，利用森林草莓、拟南芥、玉米、黄瓜和二穗短柄草的SUN蛋白家族共142个成员构建了一个系统发育树(图 3)，可归为6个进化分支。在同一进化分支，来自5个不同物种的SUN成员间的进化关系要比来自同一物种不同亚组的SUN成员间的关系更加亲近一些。进一步的分析表明，同为双子叶植物的森林草莓和黄瓜的SUN结构域进化关系非常接近，从进化树上可以看到存在15对直系同源基因，如FvSUN29/ CsSUN9、FvSUN16/CsSUN20、FvSUN20/CsSUN3、FvSUN1/CsSUN8、FvSUN26/CsSUN21等；单子叶植物的二穗短柄草和玉米之间存在11对直系同源基因，如BdSUN10/ZmSUN26、BdSUN23/ ZmSUN24等；而双子叶的模式植物拟南芥与森林草莓之间存在23对直系同源基因，如FvSUN25/AtSUN33、FvSUN22/AtSUN12等。这些结果与物种间的进化关系一致，双子叶SUN基因通常与最近的双子叶植物直系同源物是姐妹对，而单子叶植物SUN基因也是与最近的单子叶植物直系同源基因共享分支。每个进化分支中都包含玉米、黄瓜、森林草莓、拟南芥和二穗短柄草5个物种的SUN基因，这表明不同物种的成员可能来自共同的祖先，在单子叶和双子叶植物进化之前就已经发生了分化。

图 3 森林草莓FvSUN基因家族的进化分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis of FvSUN gene family of Fragaria vesca. Neighbor-joining tree of SUN proteins was generated by MEGA v7.0 with bootstrap-1 000 repeats tests.

图选项

通过森林草莓基因组自身的共线性分析(图 4A)，检测到7对FvSUN基因是由染色体片段复制而产生的：FvSUN4-FvSUN12、FvSUN7- FvSUN24、FvSUN14-FvSUN18、FvSUN16-FvSUN29、FvSUN17-FvSUN27、FvSUN17-FvSUN31、FvSUN21-FvSUN28；而在7号染色体上存在一对串联重复基因，FvSUN27和FvSUN31。进一步对森林草莓与拟南芥的SUN基因家族共线性分析(图 4B)，发现了23对直系同源基因，其中10对直系同源基因为一对一，如FvSUN7-AtSUN6、FvSUN8-AtSUN32、FvSUN11-AtSUN19、FvSUN16-AtSUN22、FvSUN17-AtSUN16、FvSUN22-AtSUN12、FvSUN23-AtSUN27、FvSUN25-AtSUN33、FvSUN28-AtSUN3和FvSUN31-AtSUN15，这些基因很可能来自森林草莓和拟南芥的共同祖先；而其他直系同源基因则显示更加复杂的情况，多个森林草莓片段重复基因FvSUN在拟南芥中存在SUN直系同源基因，如FvSUN18-AtSUN29/AtSUN30/AtSUN31和FvSUN14-AtSUN28/AtSUN29等。

图 4 森林草莓FvSUNs基因家族的共线性分析 Fig. 4 Synteny analysis of FvSUNs gene family of Fragaria vesca. A: Synteny between FvSUN family members; the number in the outer circle represents the chromosome length (Mb); gray lines represent the syntenic regions, red lines represent the segmental duplication and blue line represents the tandem duplication. B: Synteny of SUN family members between A. thaliana and F. vesca; gray lines represent the syntenic regions and red lines represents the syntenic gene pairs of SUNs; Fv1‒Fv7 refer to the chromosomes of F. vesca; Chr1‒Chr5 refer to the chromosomes of A. thaliana.

图选项

首先，利用RNA-Seq数据对FvSUN家族31个基因的时空表达模式进行了聚类分析(图 5)，其基因的表达情况可分为3类：第一类基因在苗期、叶片、花药和果实的发育过程和种子的形成过程中广谱表达，包括FvSUN2、FvSUN8、FvSUN10、FvSUN13、FvSUN14、FvSUN15、FvSUN18、FvSUN21；第二类基因在整个植物的各个发育时期(根、茎、叶、花柱、花药、花托和瘦果)的表达量均比较低，包括FvSUN3、FvSUN5、FvSUN12、FvSUN17、FvSUN19等9个基因；第三类基因在组织中特异性表达，如FvSUN30在2–5期子房壁中具有高表达水平，FvSUN28在花药和子房壁中具有较高的表达量。为了验证RNA-Seq结果的可靠性，利用qRT-PCR对31个FvSUN基因在森林草莓各组织中进行了表达分析，其表达情况与RNA-Seq结果基本一致(图 6)，进一步验证森林草莓FvSUN基因的组织表达特征。

图 5 基于RNA-Seq数据的森林草莓FvSUN基因家族组织表达情况 Fig. 5 Expression of FvSUN gene family in different tissues of Fragaria vesca based on RNA-Seq data. Heatmap was generated using the TPM (transcripts per million) value from RNA-Seq and then normalized by log2. The numbers after the tissues represent different development stages[31].

图选项

图 6 森林草莓FvSUN基因家族组织表达的定量PCR分析 Fig. 6 Expression analysis of FvSUN gene family in different tissues of Fragaria vesca by qRT-PCR. Error bars indicate the standard deviation.

图选项

对森林草莓植株分别进行了低温(4 ℃)、高盐(200 mmol/L NaCl)和模拟干旱(20% PEG6000)的逆境处理，并采用qRT-PCR分析了森林草莓中这31个FvSUNs基因在逆境胁迫后不同时间(0、6、12、24 h)的表达变化情况。结果如图 7所示，在冷胁迫下，FvSUN7与FvSUN31受高诱导表达，而FvSUN1、FvSUN12、FvSUN13、FvSUN18、FvSUN20、FvSUN25、FvSUN28等基因也有一定程度的诱导表达；在高盐胁迫中，FvSUN17、FvSUN22、FvSUN31受高诱导表达，FvSUN7、FvSUN3、FvSUN24等基因也有一定程度的诱导表达；在干旱胁迫下，绝大部分FvSUNs基因都受诱导表达，其中FvSUN7、FvSUN11、FvSUN12、FvSUN13、FvSUN23、FvSUN27、FvSUN31受高诱导表达。可见，FvSUNs基因广泛参与非生物胁迫的应答，其中FvSUN31同时受这3种胁迫的高诱导表达，可能在其中发挥重要的作用。

图 7 逆境胁迫下森林草莓FvSUN基因家族表达的定量PCR分析 Fig. 7 Expression analysis of FvSUN gene family of Fragaria vesca under abiotic stresses by qRT-PCR. 0, 2, 12 and 24 h refer to the times after stress treatments. The circles at the right of the heat map represent the relative repression values calculated by the 2‒ΔΔCt.

图选项

SUN基因是一类植物特有的功能基因^[10]。我们在森林草莓基因组中鉴定到了31个FvSUN基因(表 2)。一个物种SUN基因的数量与其基因组的大小似乎没有直接的关联，如拟南芥的基因组为125 Mb^[33]，森林草莓为240 Mb^[31]，番茄为950 Mb^[38]，但它们含有相似数量的SUN基因。异源四倍体陆地棉(Gossypium hirsutum)的SUN基因数量不是二倍体雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)的2倍，说明在进化过程中有些SUN基因发生了丢失^[39]。SUN基因起源于苔藓植物和维管植物分化前450–700 Mya^[40]，不晚于裸子植物和被子植物分离后300 Mya^[41]，并且一直都在扩张，扩张过程中经历了全基因组重复、染色体重排和片段复制等事件。在对森林草莓FvSUN基因的共线性分析中，发现了7对染色体片段重复基因和1对染色体串联重复基因(图 4A)，其染色体片段复制是驱动森林草莓FvSUN基因家族扩张的主要机制。通过拟南芥与森林草莓的共线性分析，鉴定出了23对直系同源的基因(图 4B)，其中包含了参与硫代葡萄糖苷的代谢AtSUN1^[19]，调控植株器官伸长的AtSUN16，调节植物赤霉素途径的AtSUN22^[20]，推测在森林草莓中与之对应的直系同源基因FvSUN21、FvSUN17和FvSUN16可能具有相似的功能。此外，在FvSUNs基因的聚类分析中，发现7个基因(FvSUN2、FvSUN4、FvSUN5、FvSUN6、FvSUN12、FvSUN15、FvSUN19)聚在同一分支上(图 1B)，这类基因的外显子数量明显多于其他FvSUNs，无论从基因结构、编码蛋白的保守基序都高度相似(图 1C、1D)，推测这类基因可能具有特殊或相近的功能。

基因组织表达分析表明，森林草莓FvSUN基因家族成员在不同组织中的表达量存在一定差异，可分为在各组织中低表达、在各组织中均表达和组织特异性表达(图 5)，其中少数基因在瘦果中的表达量显著偏高，猜测其可能在瘦果的发育中具有重要功能。玉米ZmSUN基因的表达模式与森林草莓相似，多数基因在发育阶段低表达，而ZmSUN12和ZmSUN17在胚胎发育中高表达^[12]；大豆GmIQD22基因在幼叶和种子发育阶段高表达^[13]；番茄SlSUN1、SlSUN28和SlSUN33在成熟果实中高表达^[14]。在以前研究中发现，植物中SUN基因在逆境胁迫下，普遍会受到诱导表达，如玉米26个ZmSUN基因受到干旱胁迫诱导或抑制表达^[12]；大白菜29个BrSUN基因在干旱处理后其表达量显著上调^[42]；黄瓜5个CsSUN基因在盐胁迫下表达受到抑制^[15]。森林草莓中的31个FvSUN基因，大部分会受低温、盐、干旱等胁迫的诱导(图 7)，说明FvSUN基因也参与了非生物逆境的应答。综上所述，对草莓SUN基因家族的鉴定及其表达分析，为进一步研究草莓SUN基因的生物学功能、调控草莓生长发育与逆境响应的分子机制奠定了一定的理论基础。