铁是动植物生长发育所必需的微量营养素，在植物中，铁参与调节光合作用、线粒体呼吸和蛋白质稳定性，并且是有氧转移的辅助因子之一^[1]。虽然土壤中铁含量丰富，但主要以不溶性氧化铁的形式存在，导致铁的溶解度低，尤其是在中性或碱性pH值的有氧条件下，其生物有效性往往不高^[2]。缺铁是世界上限制作物生产的最重要因素之一，生长在低铁土壤中的植物经常表现出萎黄病和光合作用减弱，从而导致作物产量和品质下降^[3]。植物吸收的铁是动物和人类吸收铁的主要来源，缺铁不仅会抑制植物的生长并降低产量，还会通过减少膳食摄入量而导致人类健康障碍^[4]。铁缺乏症是一种主要的微量营养素缺乏症，全球大约有30%的人口患缺铁性贫血症，而在我国患缺铁性贫血的男性约有14.9%，女性约有21.2%^[5]。因此，提高水稻中铁含量对改善中国居民的营养状况具有重要意义。

大米是世界上一半以上人口的主食，尤其是在发展中国家^[6]。一般来说，谷物食品的微量营养素含量较低，特别是在经过大量加工后食用的谷物食品。当以谷物为基础的饮食与其他补充食品不平衡时，微量营养素可能会严重缺乏，从而导致隐性饥饿。此外，谷物中富含微量营养素的组织，即糊粉层、麸皮层和谷壳层在抛光过程中被去除，以延长其保质期，导致微量营养素进一步流失^[7]。水稻经抛光后颗粒只能提供大约2 μg/g的铁^[8]，因此，水稻是铁生物强化的重要目标作物，通过生物学手段可以有效地增加水稻中的铁含量。

由于工业化在全球的快速推进，重金属污染也愈加严重。据报道，在2011年中国就有近2 000万hm²耕地被镉(Cd)、砷(As)或铅(Pb)等重金属污染，造成粮食污染1 200万t^[9]。Cd是一种有毒重金属元素，具有分解周期长、毒性大、易迁移和难降解等特点，从而对环境安全构成重大威胁，并通过食物链危害人类健康^[10]。水稻是人类营养的主要作物和主食之一^[11]。大米的Cd含量标准在中国为0.2 mg/kg (GB2762—2017)^[12]，在食品和农业组织、世界卫生组织食品法典委员会定义的安全阈值为0.4 mg/kg^[13]。尤其是在经济增长迅速且重金属污染普遍存在的东亚或东南亚地区，大米镉含量普遍超标，在部分地区，大米中的镉浓度高达1–2 mg/kg^[14]。因此，迫切需要降低稻米中镉含量来减少摄入过量镉带来的危害。

胚乳是水稻种子的组织，是储存营养物质的结构，积累了高浓度的淀粉，在碾磨后成为种子的可食用部分^[15]。在水稻中，铁向胚乳易位的能力较弱，胚乳的铁含量低于其他组织。提高种子中铁浓度的一种方法就是通过在胚乳特异性启动子控制下表达铁蛋白(ferritin)基因来增强种子中的铁积累^[16]。Qu等^[17]从水稻种子贮藏球蛋白基因Glb-1中分离并鉴定了一个启动子，该启动子指示的β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase, GUS)主要在胚乳中心部位表达，并且表达量高于1.3 kb的Glub-1启动子10倍以上。研究表明，在Glb-1启动子和1.3 kb GluB1启动子的驱动下表达SoyferH1能有效增加种子铁浓度^[18]。在胚乳特异性启动子的驱动下，ferritin的表达不仅能使转基因水稻糙米铁和锌的水平显著上升，在抛光粒中也是如此^[19]。在Glb-1启动子的驱动下，在胚乳细胞中表达的OsYSL2可以增强Fe(Ⅱ)-NA向胚乳细胞的转运，这对于种子中的Fe积累很重要^[19]。但是使用铁蛋白来进行Fe生物强化具有一定风险，可能会导致有毒重金属如镉、锰的积累^[20]。

调节铁稳态的一种重要机制就是液泡螯合，它是植物安全储存铁的一种策略。液泡铁转运蛋白(vacuolar iron transporter, VIT)是一种独特的液泡铁离子转运体家族，拟南芥液泡铁转运蛋白AtVIT1在拟南芥发育中的种子中高度表达，定位于液泡膜，并且参与胚胎前维管束的Fe²⁺的液泡固定^[21]。OsVIT1和OsVIT2是AtVIT1的水稻同源基因，定位于液泡膜，已有研究表明，OsVIT1和OsVIT2的敲除能增加水稻种子的铁含量并降低旗叶中的铁含量，推测OsVIT1和OsVIT2参与了源、库器官之间的铁转运，在酵母中，OsVIT1和OsVIT2不能转运Cd^2+[22]。VIT同源蛋白都不能转运有毒金属镉，这暗示着OsVIT1和OsVIT2可能应用于作物的Fe/Zn生物强化。

基于此，本研究使用胚乳特异表达Glb-1启动子，构建了胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2的新的转基因水稻株系，对胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2水稻中不同部位的Fe和Cd含量进行研究，旨从分子和生理方面明确水稻胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2对Fe和Cd积累的影响。为水稻铁的生物强化和籽粒降镉提供借鉴。

供试材料为粳稻品种“中花11” (Oryza sativa L., ZH11)和以其为背景构建的转OsVIT1和OsVIT2基因的材料。所用启动子为胚乳特异性表达启动子Glb-1，载体为pCAMBIA1300^(Kanr)。田间试验于湖南省浏阳市实验基地进行，农田镉浓度背景值为0.32 μg/g。设置5个重复，顺序排列，小区面积为15 m²，采用田间正常施肥，施尿素391.3 kg/hm²，氧化钾(K₂O) 120 kg/hm²，过磷酸钙[Ca(H₂PO₄)₂] 90 kg/hm²，钾肥作底肥一次性基施，氮肥基肥占比60%，分蘖肥占比25%，穗肥占比15%，磷肥基追比为7:3。

采用ZH11的cDNA为模板，用OsVIT1-F和OsVIT1-R引物(表 1) PCR，克隆OsVIT1和OsVIT2的编码蛋白质产物的序列(coding sequence, CDS)的全长，采用ZH11的基因组DNA为模板，用PGLB1-F和PGLB1-R引物(表 1)克隆胚乳特异性表达启动子Glb-1，通过同源重组的方法连入p1300分别构建双元表达载体p1300-GLB1-OsVIT1和p1300-GLB1-OsVIT2，并交予武汉伯远生物技术有限公司分别转化ZH11获得T₀代阳性苗。幼苗生长旺盛后，取叶片提取基因组DNA，用潮霉素B特异的HYG-F和HYG-R引物(表 1) PCR，1%琼脂糖电泳检测目的条带，筛选出基因组中有OsVIT1、OsVIT2基因整合的水稻植株，鉴定过的阳性植株移栽到试验田中继续生长以收获T₁代种子，自交纯化后得到T₂代植株用于后续试验。

取水稻叶片或籽粒鲜样，迅速置于液氮中。用TRIzol试剂(Ambion)提取植物的总RNA^[23]。具体方法如下：样品在液氮中粉碎后加1 mL TRIzol和200 μL氯仿，混匀后室温静置5 min后离心。吸取上清液300 μL，加入等体积异丙醇，混匀后静置5 min后离心，用75%乙醇清洗沉淀后室温干燥3–5 min，加入40 μL ddH₂O溶解。使用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme)合成cDNA模板。使用SYBR Premix Ex-Tag (TaKaRa)试剂和ABI Stepone 7 000进行定量PCR。相对表达量采用2^–ΔΔCt法^[24]，用OsActin基因作为标准化内参。qRT-PCR所用引物采用Primer 6.0软件设计，引物序列见表 1。

每个株系随机取5株水稻，将水稻包括叶片、叶鞘和除种子外的所有茎秆在80 ℃烘箱中干燥24–48 h后进行研磨粉碎，此为秸秆样品。种子在80 ℃烘箱中干燥24–48 h后，取0.02–0.10 g干重的秸秆和种子用1 mL浓硝酸加热消煮，用去离子水定容至10 mL，稀释10倍后，使用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)测定材料中的金属离子浓度^[25]。

成熟期每个株系随机取5株材料，收获野生型与过表达材料，分别测量株高、穗数、生物量和单株产量。在水稻成熟期收获水稻后先脱粒，再将茎、叶和种子分开装袋并105 ℃杀青，65 ℃烘干至恒重后称重。此为生物量的测定。

采用SPSS 18.0软件和DPS软件进行统计分析、单因素方差分析，LSD法进行显著性检验。P < 0.05为差异显著；P > 0.05为没有显著差异。用GraphPad Prism 8软件制作柱形图。

水稻籽粒由胚和胚乳构成，为了研究OsVIT1和OsVIT2对籽粒中的金属积累作用，本研究选用胚乳特异性表达Glb-1启动子驱动OsVIT1和OsVIT2表达构建了载体，转化ZH11得到了表达OsVIT1和OsVIT2的转基因株系。在分蘖期，取水稻幼嫩的叶片，通过对潮霉素抗性基因的PCR鉴定，筛选出纯合阳性植株。分别测定了植株叶片和胚乳的基因表达量，RT-qPCR分析表明，相比于ZH11，OsVIT1在叶片中的表达量显著增加了8–15倍，在胚乳中的表达量显著增加了110–157倍(图 1A)；OsVIT2与野生型相比较，在叶片的表达量较低，在胚乳的表达量显著高于野生型1.9–2.5倍(图 1B)。结果表明，OsVIT1的表达量在转基因植株的胚乳和叶片过量，OsVIT2的表达量在转基因植株的胚乳过量。

图 1   胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2的基因表达量 Fig. 1 Overexpression of OsVIT1 (A) and OsVIT2 (B) genes in endosperm. The * on the square bar indicates a significant difference between treatments at the 5% level (P < 0.05), n=3.

图选项

为了研究胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2是否会影响各部位的Fe含量，将水稻种植在含轻微Cd污染的农田中直至成熟。使用ICP-MS检测了成熟期野生型和纯合转化植株的水稻籽粒和秸秆的Fe浓度。结果表明，与野生型相比，OsVIT1在秸秆中Fe浓度无明显差异，而在籽粒中Fe浓度显著降低(图 2)；OsVIT2在秸秆中Fe浓度显著升高，而在籽粒中Fe浓度显著下降(图 2)。转OsVIT1基因株系使得籽粒中Fe浓度显著下降约50%，转OsVIT2基因株系显著增加水稻秸秆中Fe浓度45%–120%，而显著降低籽粒中Fe浓度约50%。

图 2 OsVIT1/OsVIT2胚乳过表达材料成熟期秸秆、籽粒的铁浓度 Fig. 2 Iron content in rice straw and grain of OsVIT1/OsVIT2 endosperm specific materials at mature stage. The * on the square bar indicates a significant difference between treatments at the 5% level (P < 0.05), n=5.

图选项

为了研究增强胚乳OsVIT1/OsVIT2的表达是否对Cd吸收产生影响，本研究测定了成熟期ZH11、OsVIT1和OsVIT2水稻籽粒和秸秆的Cd浓度。通过ICP-MS检测发现，与ZH11相比，生长在Cd污染的农田中，OsVIT1在秸秆和籽粒中Cd浓度无明显差异(图 3)；OsVIT2在秸秆中Cd浓度无显著差异，而在籽粒中Cd显著降低约50% (图 3)。表明胚乳过表达OsVIT2会减少Cd向籽粒的转运，从而降低籽粒Cd的累积。

图 3 胚乳过表达OsVIT1/OsVIT2材料成熟期秸秆、籽粒的镉浓度 Fig. 3 Cd content in rice straw and grain of OsVIT1/OsVIT2 overexpressed endosperm at mature stage. The * on the square bar indicates a significant difference between treatments at the 5% level (P < 0.05), n=5.

图选项

使用ICP-MS测定了胚乳过表达OsVIT1/OsVIT2中的其他阳离子，发现秸秆中OsVIT1的Zn浓度显著增加20%–40% (图 4A)，Cu浓度显著增加100%–150% (图 4B)，而K、Ca、Mg浓度则无明显差异(图 4C–4E)，在籽粒中，OsVIT1的Cu浓度显著上升100%–150% (图 4B)，Zn、K、Ca、Mg浓度都无明显差异；OsVIT2在秸秆和籽粒中都未出现Zn、Cu、K、Ca、Mg浓度的差异(图 4A–4E)。这些结果表明，胚乳过表达OsVIT1提高了秸秆中的Zn浓度，提高了秸秆和籽粒中的Cu浓度，而胚乳过表达OsVIT2不影响水稻秸秆与籽粒的其他金属离子浓度。

图 4 胚乳过表达OsVIT1/OsVIT2材料成熟期秸秆、籽粒的金属浓度 Fig. 4 The straw and grain metal concentration of endosperm overexpressed OsVIT1/OsVIT2 material at mature stage. Zn (A), Cu (B), K (C), Ca (D), and Mg (E) concentration of plants in the mature stage. The * on the square bar indicates a significant difference between treatments at the 5% level (P < 0.05), n=5.

图选项

在成熟期，收获了ZH11以及胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2材料，并测定了它们的株高、分蘖数、单株产量和生物量。相比于ZH11，OsVIT1、OsVIT2的株高、分蘖数、单株产量和生物量均无显著差异(图 5)，这表明，胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2材料不会对水稻的农艺性状指标产生影响。

图 5 胚乳过表达OsVIT1/OsVIT2材料的成熟期农艺性状 Fig. 5 The endosperm overexpressed the agronomic traits of OSVIT1 and OSVIT2 at maturity. Height (A), panicle number (B), yield (C), and dry weight (D) of plants in the mature stage. The * on the square bar indicates a significant difference between treatments at the 5% level (P < 0.05), n=5.

图选项

在本研究中，我们使用胚乳特异性表达启动子Glb-1构建了胚乳过量表达OsVIT1和OsVIT2的材料，该启动子驱动的GUS报告基因主要在胚乳表达^[17]。在胚乳特异性表达启动子Glb-1的驱动下表达ferritin基因，能有效增加精白米中的Fe和Zn含量^[19]。OsVIT1和OsVIT2在水稻的各个组织都有表达，OsVIT1在成熟叶片、旗叶以及旗叶鞘中呈现较高的表达水平，OsVIT2在旗叶鞘中有较高表达^[22]。通过对转基因材料的胚乳及叶片进行基因表达量的鉴定，发现OsVIT2仅在胚乳的表达量显著高于野生型；OsVIT1在叶片中和胚乳中表达量都显著高于野生型，但在胚乳的表达量远高于叶片，这可能是由于启动子泄露导致的。由此得到了胚乳过量表达OsVIT1和OsVIT2的材料。

胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2后，秸秆的铁浓度显著增加而籽粒铁浓度显著下降(图 2、图 3)，这表明胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2使得地上部叶片中液泡的铁储存能力增强，但是这种累积并不能运输到籽粒中去，由于水稻中铁向胚乳易位的能力较弱，导致胚乳中的铁浓度远低于其他组织。水稻植株吸收一定量的铁，但植株可能不会将铁转运到胚乳中去，其中可能存在严格的调控系统来控制铁在水稻中向胚乳的转运。目前已有的研究报道了所有的VITs都是液泡Fe²⁺转运蛋白^{[21-22, 26-28]}，但是它们在不同的植物体内发挥不同的作用。OsVIT1和OsVIT2具有将Fe²⁺、Zn²⁺转化到酵母中液泡的功能，调节水稻“源”——旗叶和“库”种子之间的铁、锌分配。最近的研究表明，OsVIT2在节Ⅰ中高表达，并定位在节Ⅰ的薄壁细胞桥中，敲除OsVIT2会增加铁从节到种子以及从糊粉层到胚乳的分配，从而提高了精米中的铁含量^[29]。本研究结果显示，成熟时期，胚乳过表达材料的秸秆铁浓度升高，而籽粒铁浓度下降。种子中的Fe积累减少可能是由于VITs的表达增加，使Fe更多地被运输到叶片中的液泡内。

我们发现胚乳过表达OsVIT2也影响Cd的吸收。近些年来铁转运蛋白一直备受关注，它具有存储和释放生物可利用的Fe²⁺能力^[30-34]。在植物和哺乳动物中，许多二价过渡金属转运蛋白具有Cd²⁺吸收活性^[35-37]，对Cd进行转运。虽然OsVIT1和OsVIT2检测不到Cd²⁺转运活性，但当OsVIT1和OsVIT2的突变体材料生长在受Cd污染的稻田中，水稻的种子中Cd²⁺出现了过度积累^[22]。VIT家族在转运底物特异性上存在一定的差异，如AtVIT1转运Fe²⁺和Mn²⁺，但是敲除AtVIT1后不会对Mn产生影响，只影响Fe的分布^[21]；TaVIT2在酵母中表现出Fe²⁺、Mn²⁺转运活性，在胚乳特异启动子的驱动下，小麦胚乳中过表达TaVIT2能提高种子中的Fe积累，但在大麦中转基因植株的Fe、Mn含量均显著增加^[28]；在本研究中，胚乳过表达OsVIT2降低了籽粒Cd²⁺浓度，这表明不同的VITs之间、酵母与植物之间转运底物的机制存在差异，其原因还需进一步的研究来阐明。

胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2后对叶片和籽粒中其他金属元素的转运影响很小。Zhang等^[22]报道了OsVIT1和OsVIT2调节源和库的组织之间的铁和锌分配，Bashir等^[38]报道了突变体osvit2植株的枝条中Zn、Cu和Mn的浓度也发生了显著变化。而在本研究中，胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2后只有OsVIT1的秸秆部分Zn浓度出现变化，种子中无明显变化。而OsVIT1的秸秆和籽粒中Cu浓度也升高了，这表明胚乳过表达OsVIT1可能会影响Cu²⁺的转运。胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2后对大量金属元素无明显影响。本研究发现胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2不会影响植株的正常生长发育，这也为植物富铁和籽粒降镉提供了一种新的研究思路和参考。

胚乳过表达OsVIT1和OsVIT2后不影响水稻的农艺性状。与野生型相比，胚乳过表达OsVIT1增加秸秆的Zn、Cu浓度和籽粒中的Cu浓度0.2–1.5倍。同时种子中的Fe浓度降低50%。与野生型相比，胚乳过表达OsVIT2显著增加秸秆的Fe浓度0.45–1.20倍，而种子中的Fe、Cd浓度下降50%，对其他金属元素的吸收不产生影响。