2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 彭洪娴, 邱洁雅, 惠秋玲, 徐媛媛, 淳长品, 凌丽俐, 曹立, 何义仲, 彭良志, 付行政
- PENG Hongxian, QIU Jieya, HUI Qiuling, XU Yuanyuan, CHUN Changpin, LING Lili, CAO Li, HE Yizhong, PENG Liangzhi, FU Xingzheng
- 资阳香橙砧木CjSPL基因家族鉴定及表达模式分析
- Identification of CjSPL gene family in Ziyang Xiangcheng rootstock and expression pattern analysis
- 生物工程学报, 2023, 39(2): 625-639
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(2): 625-639
- 10.13345/j.cjb.220672
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文章历史
- Received: August 23, 2022
- Accepted: October 25, 2022
- Published: October 31, 2022
引用本文
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转录因子是启动下游靶基因表达的开关，参与动植物生长发育、逆境应答等一系列生物学过程的响应和调控[1]。鳞片(squamosa)启动子结合类蛋白(squamosa promoter binding protein-like, SPL)家族成员是植物特有的一类转录因子，最早由Klein等[2]在金鱼草(Antirrhinum majus L.)中发现2个被推定为转录因子的蛋白分子SBP1和SBP2，这2个蛋白分子在离体条件下可以与花分生组织特征基因SQUAMOSA启动子序列元件相互作用。之后，通常把含有SBP结构域的蛋白归为一类转录因子，隶属于SPL家族。SBP结构域由约78个氨基酸残基组成，含有3个重要的功能性基序：锌指1 (zinc finger 1, Zn1)、锌指2 (zinc finger 2, Zn2)和核定位信号区(NLS)[3]，经预测锌指结构域位于N端，核定位信号区位于C端[4]，其N端和C端分别用于GTAC碱基序列结合和蛋白入核转运[5-7]。
目前，已在多种植物中分析和鉴定出SPL家族基因，且不同植物中SPL基因数目存在差异，如拟南芥中有17个[8]，水稻中有19个[9]，番茄中有16个[10]，丹参中有15个[11]，陆地棉中有30个[12]，桃中有25个[13]，菠萝中有16个[14]，葡萄中有45个[15]，甜橙中鉴定出15个[16]，Shalom等[17]在克里曼丁橘中也鉴定出15个。
大量研究表明，SPL家族在植物的生长发育和逆境应答中发挥重要功能。Wang等[18]发现，拟南芥SPL2通过调控下游基因AS2来维持植物花器官和果实的正常发育；在拟南芥中过表达SPL7和SPL8促进了植株开花[19]；Unte等[20]发现SPL8可以影响植物花的雄蕊丝伸长；番茄SiSPL基因参与调控果实的成熟[21]；拟南芥和水稻中的SPL10都参与调控植株毛体的形成[22]，马铃薯StSPL9可以调控侧根发育[23]。此外，SPL家族成员参与植物逆境胁迫也有较多相关报道。例如，拟南芥AtSPL1和AtSPL12通过ABA信号通路响应高温胁迫[24]；水稻中OsSPL10负调控其耐盐性[25]，OsSPL3响应干旱胁迫[26]；苹果中miR156-MdSPL3模式通过直接调控MdWRKY33基因的表达响应植物盐胁迫[27]；白桦BpSPL9基因响应盐旱胁迫[28]；茶树CsSBP12响应低温胁迫并影响花青素的积累[29]。
柑橘是世界第一大宗水果，也是我国种植面积和产量第一的水果，其营养成分丰富，不论是鲜果出售或是加工产品都深受消费者的喜爱。柑橘树体是由地下部的砧木和地上部的接穗组成[30-31]。砧木不仅影响果实品质，还极大影响果树抗病、抗旱、抗盐、抗低温等抗逆性[32-35]。资阳香橙(Citrus junos Sieb. ex Tanaka)是近年来柑橘中被广泛应用的新型砧木，耐盐碱、生长势强[36-38]，对该砧木抗性机制的研究，有助于发掘重要抗性基因。本文以资阳香橙为材料，从全基因组范围对资阳香橙SPL家族基因进行鉴定和克隆，从结构和进化角度探讨资阳香橙SPL基因的潜在功能，分析其在不同非生物胁迫下的表达模式，以深入了解和认识SPL基因家族在资阳香橙逆境响应中的作用，为柑橘抗性基因的挖掘和抗性机制的解析奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料与处理本研究以资阳香橙为材料，种子采集于西南大学柑桔研究所948果园，参照张晓勇[39]的方法对种子进行催芽和水培培养。选取水培培养30 d左右生长一致的资阳香橙实生苗进行干旱、低温及盐处理。干旱处理时，将实生苗放在实验台面上进行自然脱水，在脱水后0、1、6、12 h取资阳香橙苗叶片样品放入液氮速冻；盐处理和低温处理时，将正常营养液水培的实生苗分别转移到添加250 mmol/L的NaCl营养液中和4 ℃冰箱中进行处理，在盐处理后0、0.25、4、9 d取叶片样品放入液氮速冻, 在低温处理后0、0.5、4、9 d取叶片样品放入液氮速冻；所有经液氮速冻后的样品，放入–80 ℃超低温冰箱保存。每种处理设3个重复，每个重复9株水培苗。
1.2 甜橙SPL家族成员鉴定首先在plantTFDB (http://planttfdb.gao-lab.org/download.php)转录因子数据库下载拟南芥SPL家族成员的氨基酸序列(AtSPLs)，然后提交到甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php)进行比对，E-value设定为1e-5，得到候选的甜橙SPL家族成员氨基酸序列，去除重复序列后再提交到NCBI保守结构域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)进行比对，验证所得到氨基酸序列是否含有SBP特征结构域。经过去重和结构域分析，最终获得15个甜橙SPL家族成员，命名为CsSPLs。
1.3 资阳香橙SPL家族基因CDS序列克隆采用植物总RNA提取试剂盒(Cat#DP432, Tiangen Biotech Co., Ltd. Beijing)提取资阳香橙根部总RNA，取1 μg总RNA用反转录试剂盒PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#6210A, TaKaRa Bio Co., Ltd. Beijing)合成资阳香橙cDNA。根据CsSPLs的编码序列(coding sequence, CDS)序列设计引物(NMDCX0000145)，以资阳香橙cDNA为模板PCR扩增资阳香橙SPL家族基因全长序列。上述扩增产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳验证条带大小后，使用天根DNA产物纯化试剂盒(Cat#DP204, Tiangen Biotech Co., Ltd. Beijing)对目的条带进行回收并连接到PGBO载体，每个SPL基因挑选5个阳性单克隆送测序，将测序一致性高的序列确定为资阳香橙SPL基因序列并命名为CjSPLs。
1.4 SPL家族成员多序列比对和系统发育树的构建将AtSPLs、CsSPLs和CjSPLs的氨基酸序列利用MUSCLE软件[40]进行多序列比对，比对结果通过TrimAL软件[41]剪裁对齐，然后提交到IQ-Tree软件[42]进行进化树的构建，所有步骤均采用默认参数进行。
1.5 SPL基因保守基序、基因结构和启动子元件分析通过在线预测工具MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)对拟南芥、甜橙、资阳香橙的SPLs氨基酸序列进行分析，预测其保守基序，保守基序分析查找的数量值设为20，其他运行参数设置为默认，预测结果用TBtools软件[43]进行可视化。基因结构分析是通过甜橙基因组提取基因结构注释文件，并获取SPL家族成员在染色体上的分布信息。为预测SPL基因启动子元件，从甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php)提取CsSPLs基因上游2 000 bp的序列作为启动子序列，然后将提取得到的序列提交至Plantcare进行启动子元件预测(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。使用TBtools对上述步骤获得的信息进行基因结构信息分析和可视化分析。
1.6 CjSPLs在不同胁迫处理下的表达分析采用植物总RNA提取试剂盒(Cat#DP432, Tiangen Biotech Co., Ltd. Beijing)，提取资阳香橙干旱、盐和低温处理样品总RNA，再用反转录试剂盒HiScript Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR (+gDNA wiper) (Cat#R222-01, Vazyme Biotech Co., Ltd. Nanjing)合成cDNA。qRT-PCR引物使用NCBI Primer-BLAST进行设计，以actin (Cs1g05000)为内参基因(NMDCX0000145)。参照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Cat#Q771-02, Vazyme Biotech Co., Ltd. Nanjing)试剂盒方法，在仪器Bio-Rad CFX Connect Real Time system上完成实时荧光定量PCR反应，最后用2‒∆∆Ct法计算CjSPLs家族基因的相对表达量，采用Excel统计数据及作图，SPSS软件分析基因表达量间的差异显著性(P < 0.05)。
2 结果与分析 2.1 CjSPL家族成员鉴定与克隆以拟南芥已知的17个SPL基因(AtSPLs)为参考序列，与甜橙基因组数据库进行序列比对，去除重复序列后获得15个候选基因序列，将其提交到NCBI数据库进行保守结构域分析表明均含有SBP结构域，因此将此15条序列确定为甜橙SPL家族成员。根据上述序列与AtSPLs的相似性，将鉴定的15个甜橙SPL家族基因命名为CsSPL1–CsSPL15 (表 1)。为进一步获得资阳香橙中SPL基因序列，根据CsSPLs序列设计全长引物，以资阳香橙cDNA为模板进行了PCR扩增并测序。将资阳香橙中扩增出的15个SPL基因对应命名为CjSPL1–CjSPL15。如表 1所示，CjSPLs和AtSPLs的序列相似性为33.29%–61.64%，CjSPLs的ORF长度为393 bp–2 865 bp，编码130–954个氨基酸，等电点在5.99–11.50之间，分子量为14.73–118.51 kDa；其中蛋白序列最长的为CjSPL14，其次是CjSPL1，最短的是CjSPL5。
| Gene name | Gene ID | BLAST to Citrus sinensis | BLAST to Arabidopsis | Identity (%) | ORF length (bp) | Mw (kDa) | pI |
| CjSPL1 | NMDCN00011S2 | Cs9g01380 | AT2G47070 | 54.5 | 2 613 | 97.0 | 9.9 |
| CjSPL2 | NMDCN00011S3 | Cs7g10830 | AT5G43270 | 50.8 | 1 350 | 49.3 | 6.9 |
| CjSPL3 | NMDCN00011S4 | Cs2g05730 | AT2G33810 | 46.0 | 432 | 21.6 | 11.5 |
| CjSPL4 | NMDCN00011S5 | Cs2g23550 | AT1G53160 | 54.0 | 570 | 21.1 | 9.1 |
| CjSPL5 | NMDCN00011S6 | Cs1g07620 | AT3G15270 | 46.3 | 393 | 14.7 | 8.8 |
| CjSPL6 | NMDCN00011S7 | Cs5g12260 | AT1G69170 | 36.2 | 1 674 | 61.2 | 8.8 |
| CjSPL7 | NMDCN00011S8 | Cs9g05200 | AT5G18830 | 61.0 | 2 397 | 88.6 | 6.7 |
| CjSPL8 | NMDCN00011S9 | Cs1g03630 | AT1G02065 | 47.5 | 987 | 36.8 | 9.0 |
| CjSPL9 | NMDCN00011SA | Cs1g03640 | AT2G42200 | 38.6 | 1 170 | 43.2 | 6.5 |
| CjSPL10 | NMDCN00011SB | Oange1.1t02265 | AT1G27370 | 38.4 | 1 161 | 40.7 | 9.3 |
| CjSPL11 | NMDCN00011SC | Cs7g11770 | AT1G27360 | 35.7 | 1 521 | 56.6 | 8.4 |
| CjSPL12 | NMDCN00011SD | Orange1.1t01758 | AT3G60030 | 33.3 | 1 503 | 55.0 | 6.0 |
| CjSPL13 | NMDCN00011SE | Orange1.1t02597 | AT5G50570 | 52.0 | 1 134 | 41.7 | 6.6 |
| CjSPL14 | NMDCN00011SF | Orange1.1t04043 | AT1G20980 | 61.5 | 2 865 | 118.5 | 8.1 |
| CjSPL15 | NMDCN00011SG | Cs7g10990 | AT3G57920 | 37.7 | 939 | 34.2 | 9.3 |
如图 1所示，通过IQ-tree构建拟南芥、甜橙和资阳香橙SPL家族进化树，结果表明CjSPLs和CsSPLs被分为9个亚族，而AtSPLs分在除第7亚族外的其他8个亚族。其中3种植物的SPL7单独聚为第1亚族；AtSPL13和CjSPL13、CsSPL13、CjSPL15和CsSPL15聚为第2亚族；3种植物的SPL2、SPL6、SPL11和AtSPL10聚成第3亚族；第4亚族含有AtSPL9、AtSPL15、CsSPL10和CjSPL10；AtSPL8、CsSPL8、CjSPL8组成第5亚族；第6亚族由3种植物的SPL3、SPL4、SPL5构成；CsSPL9和CjSPL9单独构成第7亚族；AtSPL14、CsSPL14、CjSPL14和AtSPL16组成第8亚族；3种植物的SPL1和SPL12聚为第9亚族。9个亚族中，成员占比最多的是第3亚族，占比最少的是第7亚族，仅由CjSPL9和CsSPL9两个成员单独构成。从进化关系上看，CjSPLs与对应的CsSPLs关系最近，编号相同的AtSPL、CsSPL和CjSPL同源关系较近且一般处在同一亚族，在生物学上可能有相似的功能。
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| 图 1 资阳香橙CjSPL、甜橙CsSPL和拟南芥AtSPL家族系统进化分析 Fig. 1 Phylogenetic analysis of the CjSPL, CsSPL and AtSPL family. |
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如图 2所示，对甜橙和资阳香橙SPLs的氨基酸序列进行多序列比对，表明它们的SBP结构域由79个氨基酸组成且高度保守，部分位点上的氨基酸序列一致性达到80%以上。例如，CsSPLs的SBP结构域中有51个位点的氨基酸一致性达到80%，CjSPLs中有47个位点氨基酸一致性达到80%。另外，CsSPLs和CjSPLs的SBP结构域保守氨基酸位点都含有第2、7、24、27位的CCCH (Zn1)，第43、46、50、62位的CCHC (Zn2)和第59、60、63、64、65、72、73、74、75位的KR7K (NSL)，且NSL的C端与Zn2有部分重合。虽然甜橙和资阳香橙多数SPL的SBP结构域序列高度保守，但也发现CsSPL1和CjSPL1的氨基酸序列保守性较低。CsSPL1的SBP结构域氨基酸序列与其他14个CsSPLs的一致性仅38%，只在Zn2、NSL功能性结构基序上表现出保守性；CjSPL1的SBP结构域氨基酸序列保守性最低，只在NSL区域的63、65位点上表现出保守性。
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| 图 2 甜橙CsSPLs (A)和资阳香橙CjSPLs (B)氨基酸序列比对[A1] Fig. 2 Amino acid sequence alignment of CsSPLs (A) and CjSPLs (B). |
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为进一步了解SPLs家族成员的生物学功能多样性，对AtSPLs、CsSPLs和CjSPLs的氨基酸序列进行了保守motif的预测。如图 3A所示，在AtSPLs、CsSPLs和CjSPLs中共预测出20个不同的保守motif；其中motif 1、motif 3和motif 4除不存在于CsSPL1和CjSPL1之中，在其他SPLs中均含有此3个motif，且所处位置与SBP结构域的位置相同(图 3B)，由此推测这3个motif是SBP结构域的3个特征基序；motif 2只出现在第1、8亚族和第9亚族的SPLs中，motif 19只存在于第8亚族，而motif 20只出现在第9亚族。另外，第8、9亚族的SPLs包含的motif种类和数量最多，而第6亚族最少。保守结构域预测表明，除CsSPL1和CjSPLs1外，其他SPLs均都含有完整的SBP结构域；另外，在AtSPL1、AtSPL12和AtSPL14的3′端包含一个由重复锚蛋白构成的Ank-2结构域，而在其他SPLs中缺乏。
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| 图 3 资阳香橙CjSPL、甜橙CsSPL和拟南芥AtSPL家族保守基序(A)和结构域分析(B) Fig. 3 Conserved motif (A) and domain analysis (B) of CjSPL, CsSPL and AtSPL family. |
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由于资阳香橙还没有完成基因组测序，本研究通过分析与其亲缘关系较近的CsSPLs家族基因的序列结构和启动子元件来推测对应的CjSPLs序列结构和启动子元件，以期预测它们的潜在功能。根据提取的CsSPLs基因结构注释文件，用软件进行可视化得到CsSPLs基因结构，如图 4A所示。除CsSPL12外，其他14个基因成员均含有5′ UTR和3′ UTR；在外显子数量上，CsSPL1、CjSPL13和CsSPL14的外显子数量最多(10个)，而CsSPL3和CsSPL5的外显子数量最少(2个)。如图 4B所示，15个CsSPLs启动子中共预测出20种启动子元件，其中CsSPL15含有种类最多的16种启动子元件，而CsSPL6含有种类最少的9种启动子元件；在这20种启动子元件中，包括植物生长发育相关元件(如响应脱落酸、生长素和分生组织表达的元件)、非生物胁迫相关元件(如响应低温、干旱、厌氧等的元件)、次生代谢物相关的元件(如响应水杨酸、茉莉酸、光敏下类黄酮合成的元件)；所有CsSPLs都含有核心启动子元件、启动子和增强子，这些启动子元件均起到启动激活或增强基因转录的功能。另外，全部CsSPLs成员都含有光反应元件。同时，我们也注意到，某些启动子元件只存在于单个CsSPL基因的启动子序列中，如仅有CsSPL10的启动子序列含有响应栅栏叶肉细胞的元件。
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| 图 4 甜橙CsSPL基因结构(A)及其启动子顺式作用元件分析(B) Fig. 4 Analysis of CsSPL genes structure (A) and cis-acting elements of their promoters (B). |
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前人研究表明SPL家族基因在植物非生物逆境中发挥重要功能，本研究利用qRT-PCR分析了CjSPLs在干旱、盐和低温下的表达模式，以初步分析不同成员的潜在功能。如图 5所示，在干旱胁迫下，CjSPL2、CjSPL3、CjSPL5、CjSPL7、CjSPL8和CjSPL12的表达量在多个处理时间点相较于0 h对照呈显著增加趋势，且CjSPL2、CjSPL3和CjSPL8的表达呈现出随处理时间延长逐渐上升的规律，表明这些基因可能积极响应柑橘干旱胁迫；另外，CjSPL1、CjSPL4和CjSPL14仅在干旱处理1 h时显著上升，这些基因可能在干旱早期发挥调控作用；CjSPL13表达虽然显著上升，但各时间点表达量极低。CjSPL6、CjSPL9、CjSPL10、CjSPL11和CjSPL15表达水平总体变化不明显，这些基因可能在干旱胁迫下不发挥主要功能。如图 6所示，在盐胁迫下，除CjSPL6、CjSPL10、CjSPL11和CjSPL13的表达变化不明显外，其他CjSPL基因均显著上调表达，其中CjSPL2、CjSPL3、CjSPL4、CjSPL5、CjSPL7、CjSPL8的表达量随处理时间延长逐渐增加，这些基因可能在盐胁迫中发挥重要调控作用。在低温胁迫下CjSPL1、CjSPL3、CjSPL4、CjSPL7、CjSPL8的表达量在处理4 d及之后的时间点与0 d相比显著上升；CjSPL2、CjSPL9、CjSPL12、CjSPL14、CjSPL15的表达量在低温处理9 d时才发生显著增加；CjSPL 6、CjSPL10、CjSPL11、CjSPL13的表达变化不明显(图 7)。
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| 图 5 CjSPL基因在干旱胁迫下的表达 Fig. 5 Relative expression of CjSPL genes under drought stress. Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05. |
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| 图 6 CjSPL基因在盐胁迫下的表达 Fig. 6 Relative expression of CjSPL genes under salt stress. Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05. |
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| 图 7 CjSPL基因在低温胁迫下的表达 Fig. 7 Relative expression of CjSPL genes under low temperature stress. Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05. |
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SPL基因家族在植物生长发育、响应生物和非生物胁迫的过程中发挥着重要作用，已在多种植物中被鉴定和研究[7-8, 16]。在本研究中，共鉴定出15个CjSPL基因，并通过生物信息学分析明确了CjSPL基因家族成员的氨基酸、分子质量、等电点等信息。通过与拟南芥及甜橙的SPL基因家族成员构建系统进化树，将15个CjSPLs分为9个亚家族。根据前人研究结果，不同植物的SPL家族基因数量存在差异，如拟南芥有17个成员[8]，水稻有19个[9]，番茄有16个[10]，克里曼丁橘鉴定出15个[17]。本研究以甜橙的全基因组数据作为参考，我们在甜橙中鉴定出了15个SPL基因与前人的研究结果一致[16, 44]；根据甜橙CsSPLs基因设计引物，我们在资阳香橙中扩增出了15条相应的SPL基因全长序列。比较CsSPLs和CjSPLs的核苷酸序列发现，两者的序列相似性很高，其中CjSPL2、CjSPL4、CjSPL8、CjSPL10和CjSPL15与对应的CsSPLs序列完全一致；但是CjSPL1与CsSPL1的序列差异较大，前者比后者多了30个碱基的插入；CjSPL3比CsSPL3以及CjSPL14比CsSPL14各少了6个碱基(NMDCX0000146)。另外，CjSPL5、CjSPL6、CjSPL7、CjSPL9、CjSPL11、CjSPL12、CjSPL13与对应的CsSPLs存在部分位点的单个碱基差异。将CjSPLs与AtSPLs进行比对，发现其序列相似性在33.29%–61.64%之间，其中CjSPL14和AtSPL14的序列相似性最高，达到了61.64%，其次是CjSPL7和AtSPL7，两者相似性达到61%。前人研究发现，AtSPL14在拟南芥中的错误表达能够使其抵御细胞程序性死亡[45]；AtSPL7参与调控植物的生长发育和响应非生物胁迫过程，例如过表达AtSPL7会促进拟南芥的开花，Cu缺乏诱导AtSPL7表达[46]。因此，我们可以推测与AtSPL7、AtSPL14序列相似的CjSPL7、CjSPL14可能具有类似的功能。从进化树分析上来看，处于同一亚族的SPL基因可能具有相同功能，例如第6亚族的AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5基因在拟南芥中都参与调控植物的成花诱导[47]，第3亚族的AtSPL2和AtSPL11都参与调控植株的耐热性[48]。因此，结合前人研究结果我们推测处于同一亚族的CjSPLs可能具有与AtSPLs相似的功能。
结构域和motif的种类和数量可以从侧面反应该基因的生物功能多样性，具有相同种类和数量motif的基因功能可能相似。SBP结构域在SPL中高度保守，前人对52个物种的SBP结构域进行多序列比对分析发现最保守的氨基酸残基是第4、9、26、45和48位的半胱氨酸和第29和52位的组氨酸，这些氨基酸用于配位两个锌离子[7]。根据CjSPLs的序列分析结果，除CjSPL1外，其他CjSPLs都含有上述7个保守的氨基酸位点，即含有完整的SBP结构域，该结果暗示CjSPL1可能具有与其他CjSPLs不同的功能。从motif分析上来看，CjSPL14包含的motif种类最多(17种)，表明该基因可能参与多种生物学功能；与前人研究结果一致，本研究也发现位于同一亚族的基因含有大致相同的motif[49]，如位于第6亚族的CjSPL3、CjSPL4、CjSPL5均只含有motif1、3、4，是CjSPLs中含有基序最少的，CjSPL13和CjSPL15同属于第二亚族，均含有motif1、3、4、10，这些含有相同motif的基因成员可能具有类似的功能。
对基因启动子顺式作用元件和基因表达模式的分析，有助于揭示基因的潜在功能。本研究从15个CsSPL基因启动子中预测出20种顺式作用元件，不仅包含植物生长发育相关的脱落酸、生长素和分生组织表达的元件，还有与非生物胁迫相关的响应低温、干旱等的元件。顺式作用元件预测发现，除CsSPL1、CsSPL6、CsSPL9和CsSPL13启动子不含干旱响应元件，其他CsSPLs都含有此元件；qRT-PCR结果表明CjSPL6和CsSPL9对干旱响应不明显，CsSPL13在干旱下表达量极低，CsSPL1仅在1个时间点上调表达；干旱胁迫下qRT-PCR结果较好印证了启动子顺式作用元件的预测结果。前人研究发现，拟南芥在干旱、盐胁迫下生长时，体内的miR156表达量增加，导致下游靶基因SPL9的表达降低[50]；木薯在受到干旱胁迫时MESPL9的表达量下降，抑制MESPL9的活性提高了转基因木薯的抗旱能力[51]；苜蓿适度提高miR156转录水平足以通过沉默SPL13和增加WD40-1表达来增强其抗旱能力[52]。中国野生葡萄VpSBP16基因通过调节ROS和SOS信号网络增强了转基因拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性[53]。结合本研究结果及这些前人研究证据，可以推测CjSPL基因在柑橘干旱胁迫应答中可能发挥重要作用。CsSPL1、CsSPL4、CsSPL8、CsSPL10、CsSPL11、CsSPL12和CsSPL14被预测含有低温响应元件；qRT-PCR结果也显示CjSPL1、CsSPL4、CsSPL8、CsSPL12和CsSPL14的表达量在低温胁迫处理下不同程度显著升高，暗示这些CjSPLs可能在柑橘低温胁迫中发挥调控作用。虽然本研究没有直接预测到CsSPLs启动子响应盐胁迫的顺式作用元件，但表达分析表明大部分CjSPLs在盐胁迫下显著上调表达。前人也有较多研究证明植物SPLs在盐胁迫中的作用，如苹果MDSPL13过表达能增强其耐盐性，通过靶向MdWRKY100正向调节苹果的耐盐性[54]；水稻OsSPL1负调控其耐盐性[55]；葡萄VpSBP3在转基因拟南芥中负向调控盐胁迫[56]；烟草NtabSPL6转入拟南芥提高了拟南芥对盐胁迫的耐受能力[57]。
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