番木瓜(Carica papaya L.)是番木瓜科(Caricaceae)番木瓜属(Carica)植物，原产墨西哥南部及中美洲。番木瓜科包含6个属35个种，分布在世界各地，我国的主要产区为广东、广西、海南、福建、台湾等地。番木瓜既可以作为食品，又在传统医药中具有广泛用途，深受人们青睐^[1]。

在光合作用过程中，碳的同化、储存和利用之间的平衡取决于淀粉和蔗糖之间光同化物的分配，果糖-2, 6-二磷酸(Fru-2, 6-P₂)是生物体内糖代谢的重要调节物，在这其中发挥重要作用^[2-4]。果糖-6-磷酸, 2-激酶/果糖-2, 6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate, 2-kinase/fructose-2, 6-bisphosphatase, F2KP)是一个独特的双功能酶，具有激酶和酯酶双功能域，能通过催化果糖-2, 6-二磷酸(Fru-2, 6-P₂)的合成和降解来控制其含量，由此可见F2KP对参与植物淀粉和蔗糖之间的分配平衡有重要关系^[5-6]。众多F2KP的转基因植物研究结果表明，在光合组织中F2KP通过调控Fru-2, 6-P₂的含量，从而协调生物体内碳分配。2001年，有报道证明F2KP的活性与Fru-2, 6-P₂含量成正相关。在F2KP活性降低的转基因拟南芥中，Fru-2, 6-P₂含量大大降低，并且碳分配发生了变化，这为Fru-2, 6-P₂是光合作用碳代谢的主要调节剂提供了直接证据^[7]。在Fru-2, 6-P₂的含量高于野生型2倍的烟草中，蔗糖的含量相对于野生型显著降低，而淀粉的含量则增加。相反，在Fru-2, 6-P₂含量低于野生型水平一半的烟草中，蔗糖合成速率增加，而淀粉合成速率下降^[8]。马铃薯和草莓对Fru-2, 6-P₂含量的改变也具有相同的反应^[9-12]。在非光合作用的组织中，Fru-2, 6-P₂含量还跟许多非生物胁迫应答反应相关。目前诸多研究的真核生物中都已经克隆到编码F2KP的基因序列，其蛋白大小预测约为83 kDa。

目前，在番木瓜中CpF2KP的基因功能及其在碳同化过程中是否发挥调控淀粉-蔗糖分配平衡的功能均尚未见报道。本研究对番木瓜的重要基因CpF2KP初步开展了分子生物学研究。首先从番木瓜的基因组序列中提取该基因的CDS序列，全长2 274 bp，序列分析发现其具有F6P, 2-K的保守结构域。根据序列设计CDS全长的引物，克隆得到CpF2KP全长片段；随后将其构建到原核表达载体上，探索诱导蛋白表达的最适条件，得到CpF2KP的纯化蛋白。此外，利用实时荧光定量PCR技术检测了该基因的组织表达特性，我们的研究结果将为进一步研究CpF2KP蛋白的生物学功能奠定坚实基础。

大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)、原核表达载体pGEX-4T-1(该载体由福建农林大学免疫中心赠送)、番木瓜中白品种(取自于福建农林大学试验基地)。

DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；限制性内切酶(BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ)购自Thermo Fisher公司；DNA连接实验使用南京诺唯赞生物科技有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒；高保真酶(PrimeSTAR)及蛋白质Marker(M)均购自TaKaRa公司；异丙基β-d硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(ampicillin, Amp)、Tris、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)、Mag-Beads GST融合蛋白纯化磁珠均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；RNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、反转录试剂盒PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time）和实时荧光定量PCR试剂TB Green^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)均购自TaKaRa公司；一抗GST-Tag(12 G8) Mouse mAb和二抗Goat Anti-Mouse IgG HRP均购自Abmart公司。

提取番木瓜(Carica Papaya L.) SunUp品种的总RNA，反转录获得cDNA，用含有目的载体同源的引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增，引物序列为F: 5′-CTGGTTCCGCGTGGATCCATGGGGACGGGTGTGTCAAAG-3′；R: 5′-CTCGAGTCGACCCGGGAATTCTCAGTCCATGAGCTTGTATCTTTTC-3′ (下划线部分表示包含BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点和部分载体序列的接头序列)，PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min，30个循环。该引物由福州尚亚生物技术有限公司合成。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增基因符合目的条带，进行扩增基因的纯化回收。用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切载体pGEX-4T-1，连接目的基因片段转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，对重组质粒进行PCR和测序鉴定，测序由北京擎科生物科技有限公司完成。

为找到重组蛋白GST-F2KP的最佳诱导条件，从诱导温度和诱导剂IPTG浓度方面设置3个不同条件。首先将测序成功的重组质粒转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)，在平板上培养过夜，挑取单克隆在5 mL的含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养，培养至OD₆₀₀值为0.6左右，加诱导剂IPTG，分别设置3个IPTG的浓度为(0.1、0.3、0.5 mmol/L)，分别置于3个温度条件(16 ℃、28 ℃、37 ℃)的摇床中，设置28 ℃和37 ℃在200 r/min振荡培养3 h，设置16 ℃在200 r/min振荡培养过夜，富集菌体，用灭菌双蒸水完全重悬，加上样缓冲液，99 ℃煮沸10 min蛋白变性后取5 μL进行SDS-PAGE电泳检测。

参照最佳的诱导条件扩大细菌培养，诱导完成后4 ℃、4 000 r/min离心20 min，富集菌体，用20 mL的GBB缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 120 mmol/L NaCl, 用前加入1 mmol/L二硫苏糖醇(dl-dithiothreitol, DTT)重悬，用超声破碎仪进行破碎，超声开3 s，关8 s，工作时间5 min，重复破碎4次。破碎裂解后在4 ℃、15 000 r/min离心20 min，同时用GBB缓冲液洗GST Beads 3次，每次2 000 r/min，2 min。将平衡好的Beads加入离心好的待纯化的蛋白上清中，于4 ℃结合约2 h。取出3 000 r/min离心5 min。将上清吸出，留管底1 mL左右重悬吸到1.5 mL预冷的离心管里。用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)洗涤，2 000 r/min离心2 min，重复4次，立刻加洗脱缓冲液。于4 ℃孵育60 min左右，取出后2 000 r/min离心2 min，吸出上清，即为纯化后的蛋白溶液，取10 μL加上样缓冲液，99 ℃煮沸10 min变性后进行SDS-PAGE检测。

将GST-F2KP重组蛋白转膜至PVDF上；将膜置于封闭液(用TBST缓冲液配制5%脱脂奶粉) 4 ℃封闭12 h；然后与一抗GST抗体[GST-Tag (12 G8) mouse mAb]室温孵育2 h，用TBST洗涤缓冲液洗涤4次。再在室温条件下与二抗(goat anti-mouse IgG HRP)孵育1 h，再以TBST洗涤缓冲液洗涤4次，膜经ECL显影后拍照。

选取番木瓜中白品种的根、茎、叶、花、果肉和种子，利用实时荧光定量PCR技术检测CpF2KP基因在番木瓜不同组织中的表达量。RNA提取参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书进行，反转录参照PrimeScript^TM RT Master Mix说明书进行。选择番木瓜actin-2作为内参基因对样品进行均一化，设计靶基因CpF2KP的定量引物序列为：RT-F: 5′-CAGGATTGGTGGGGACAGTG-3′；RT-R: 5′-CGCACGCCATTGTATCTTGG-3′。采用TaKaRa公司试剂盒TB Green^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)在Bio-Rad/伯乐CFX96荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测，基因的相对表达水平采用2^–ΔΔCt法计算。

从番木瓜转录组注释的基因序列中提取该基因CpF2KP的序列信息，全长2 274 bp，编码757个氨基酸。利用NCBI数据库里面的CD-search功能对CpF2KP蛋白序列进行注释发现，该基因编码一个果糖2, 6-二磷酸酶。在氨基酸序列的第345到563位有一个6PF2K结构域，能催化果糖2, 6-二磷酸酶的合成和降解(图 1)。为验证CpF2KP的蛋白功能，首先要做的就是得到CpF2KP的纯化蛋白。

图 1 番木瓜CpF2KP蛋白的保守结构域 Fig. 1 Conserved domains of papaya CpF2KP protein.

图选项

根据基因CpF2KP序列设计扩增全长的引物，以番木瓜品种SunUp的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，发现条带大小在2 000 bp以上(图 2)，与CpF2KP原始序列2 274 bp大小相符合，表明扩增的条带为目的基因条带。

图 2 番木瓜CpF2KP基因全长的克隆 Fig. 2 Cloning of CpF2K gene from papaya. M：BM5000 DNA marker；泳道1和2：PCR扩增产物 M: BM5000 DNA marker; Lane 1 and lane 2: PCR products.

图选项

将原核表达的质粒载体pGEX-4T-1用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现条带大小约5 000 bp (图 3)，与原始载体基因序列4 969 bp相一致。纯化回收后用基因重组的方式连接目的基因，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR验证，将检测条带与目的基因大小相一致的单克隆提取质粒并测序(图 4)，测序结果与原序列完全匹配，表明CpF2KP的原核表达载体构建成功，得到GST-F2KP重组质粒(图 5)。

图 3 载体PGEX-4T-1酶切电泳图 Fig. 3 Electrophoresis of the double enzyme-digested pGEX-4T-1. M：BM5000 DNA marker；泳道1和2：PGEX-4T-1经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切后电泳图 M: BM5000 DNA marker; Lane 1 and lane 2: Electrophoresis of pGEX-4T-1digested by EcoR Ⅰ and BamH Ⅰ.

图选项

图 4 重组质粒GST-F2KP阳性鉴定 Fig. 4 Identification of GST-F2KP recombinant plasmid. M：BM5000 DNA marker；泳道1、2、5、6、7、8、10、11、12：阳性克隆PCR产物；泳道3、4、9：阴性克隆PCR产物 M: BM5000 DNA marker; Swimming lanes 1, 2, 5, 6, 7, 8, 10, 11 and 12: PCR products of positive clones; lanes 3, 4, 9: PCR products of negative clones.

图选项

图 5 重组质粒GST-F2KP测序结果比对 Fig. 5 Comparison of sequencing results of recombinant plasmid GST-F2KP.

图选项

将测序成功的GST-F2KP重组质粒转入BL21(DE3)感受态，设置不同诱导条件进行蛋白诱导表达，分别设置IPTG浓度为0.1 mmol/L、0.3 mmol/L和0.5 mmol/L，温度为16 ℃、28 ℃和37 ℃。经预测GST-F2KP重组蛋白的大小为110 kDa左右，其中CpF2KP经网站ProtParam预测大小为83.98 kDa，GST标签的大小为26 kDa。诱导表达的产物经10%的SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，脱色后进行结果分析发现，未融合CpF2KP的空载质粒无论有无添加IPTG均不能诱导出目的条带，重组GST-F2KP的融合蛋白在未添加IPTG的情况下也不能诱导出目的条带。在经IPTG诱导以后Marker 100 kDa和140 kDa之间有明显条带，大小与预测目的蛋白相一致(图 6)。但是在28 ℃条件下诱导的蛋白浓度要明显高于16 ℃和37 ℃条件下诱导的蛋白浓度。IPTG浓度为0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的条件下蛋白诱导量高于IPTG浓度为0.3 mmol/L条件下蛋白诱导量(图 6)。根据电泳结果，在温度28 ℃和IPTG浓度为0.5 mmol/L的条件下电泳条带最亮(图 6)。表明在此实验设置的变量条件下，IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为28 ℃是GST-F2KP重组蛋白的最佳诱导条件。

图 6 GST-F2KP重组蛋白表达的最佳诱导温度和IPTG浓度的筛选 Fig. 6 Optimization of expression temperature and IPTG concentration for GST-F2KP recombinant protein. M：蛋白marker PM2510；1：pGEX-4T-1诱导前；2：pGEX-4T-1 37 ℃ IPTG 0.5 mmol/L诱导后；3：GST-F2KP诱导前；4：GST-F2KP 16 ℃ IPTG 0.1 mmol/L诱导后；5：GST-F2KP 16 ℃ IPTG 0.3 mmol/L诱导后；6：GST-F2KP 16 ℃ IPTG 0.5 mmol/L诱导后；7：GST-F2KP 28 ℃ IPTG 0.1 mmol/L诱导后；8：GST-F2KP 28 ℃ IPTG 0.3 mmol/L诱导后；9：GST-F2KP 28 ℃ IPTG 0.5 mmol/L诱导后；10：GST-F2KP 37 ℃ IPTG 0.1 mmol/L诱导后；11：GST-F2KP 37 ℃ IPTG 0.3 mmol/L诱导后；12：GST-F2KP 37 ℃ IPTG 0.5 mmol/L诱导后 M: Protein marker PM2510; 1: Before pGEX-4T-1 induction; 2: pGEX-4T-1 was induced by 0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃; 3: Before GST-F2KP induction; 4: GST-F2KP was induced by IPTG 0.1 mmol/L at 16 ℃; 5: GST-F2KP was induced by IPTG 0.3 mmol/L at 16 ℃; 6: GST-F2KP was induced by IPTG 0.5 mmol/L at 16 ℃; 7: GST-F2KP was induced by IPTG 0.1 mmol/L at 28 ℃; 8: GST-F2KP was induced by IPTG 0.3 mmol/L at 28 ℃; 9: GST-F2KP was induced by IPTG 0.5 mmol/L at 28 ℃; 10: GST-F2KP was induced by IPTG 0.1 mmol/L at 37 ℃; 11: GST-F2KP was induced by IPTG 0.3 mmol/L at 37 ℃; 12: GST-F2KP p induced by IPTG 0.5 mmol/L at 37 ℃.

图选项

参照上述最佳诱导条件，对GST-F2KP重组蛋白进行大量诱导和纯化，经10%的SDS-PAGE电泳后进行结果分析发现，纯化后的蛋白检测出单一目的条带，证明GST-F2KP纯化成功(图 7)；对照空载质粒在加IPTG前后，不能诱导出蛋白条带；GST-F2KP重组质粒在未加IPTG的条件下也不能诱导出目的蛋白；GST-F2KP重组质粒在浓度0.5 mmol/L IPTG、28 ℃的条件下，大量诱导出与目的条带大小相一致的蛋白。超声破碎后上清和沉淀中都检测到目的蛋白条带，说明该蛋白在上清和包涵体中均存在目的蛋白，并且包涵体中的蛋白量多于上清液。在结合完GST磁珠后的上清中几乎检测不到目的条带，说明此时目的蛋白已经结合到GST的磁珠上面(图 7)。洗脱结束后的磁珠上未检测到明显目的条带，说明磁珠上结合的重组蛋白被洗脱下来。值得注意的是，若磁珠上有重组蛋白未洗脱完全，可延长孵育时间或者提高还原型谷胱甘肽的浓度来更高效地洗脱蛋白。

图 7 GST-F2KP重组蛋白的纯化 Fig. 7 Purification of GST-F2KP recombinant protein. M：蛋白marker PM2510；1：GST-F2KP纯化蛋白；2：GST-F2KP诱导前；3：GST-F2KP诱导后原液；4：空载体诱导前；5：空载体诱导后；6：超声破碎后上清液；7：超声破碎后沉淀；8：GST磁珠孵育之后上清；9：洗脱之后的磁珠 M: Protein marker PM2510; 1: Purified GST-F2KP; 2: Before GST-F2KP induction; 3: After GST-F2KP induction, the stock solution was obtained; 4: Before induction of empty plasmid; 5: After induction of empty plasmid; 6: The supernatant after ultrasonic crushing; 7: The precipitates after ultrasonic crushing; 8: The supernatant after incubation with GST magnetic beads; 9: Magnetic beads after elution.

图选项

为进一步检测上述纯化的蛋白是GST-F2KP的重组蛋白，用GST抗体免疫纯化的蛋白，发现在100 kDa和140 kDa之间有明显条带，与考马斯亮蓝的结果一致，进一步说明纯化的蛋白是GST-F2KP目的蛋白(图 8)。

图 8 Western blotting检测GST-F2KP纯化蛋白 Fig. 8 Western blotting detection of purified protein. M：蛋白marker PM2510；1：GST-F2KP纯化蛋白 M: Protein marker PM2510; 1: GST-F2KP was purified.

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在番木瓜中白品种中，检测CpF2KP基因在不同组织中的表达水平，发现该基因在根、茎、叶、花、果肉和种子中均有表达，没有组织表达特异性。该基因在种子中的表达量最高，其次是茎和根，在果肉中的表达量最低(图 9)。

图 9 CpF2KP基因在不同组织中的表达特性 Fig. 9 Expression characteristics of CpF2KP gene in different tissues. 不同小写字母表示显著差异(P < 0.05)，误差线代表标准差 Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05), bars indicate standard deviation.

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果糖-6-磷酸, 2-激酶/果糖-2, 6-二磷酸酯酶(F6P, 2K/F26BPase)是一个独特的双功能酶，该酶具有激酶和酯酶2个功能域^{[6-7, 11-12]}。在植物和动物中分别简称为F2KP与PFKFB。目前已证明动物中PFKFB同工酶由多种不同基因编码^[13-15]，而每种植物只有一个基因编码一个双功能F2KP蛋白^[16]，并且动物、植物和酵母等多种真核生物中已经克隆到编码该基因的序列^[17-18]。植物胞浆中果糖-2, 6-二磷酸(Fru-2, 6-P₂)的含量就由F2KP来决定。多篇文章已经报道通过超量表达或者抑制表达F2KP来调节Fru-2, 6-P₂的水平，影响蔗糖和淀粉之间碳的分配^[7-12]。

为响应光合速率的增加，基质中甘油酸-3-磷酸(3-PGA)和磷酸丙糖(triose-P)运输到胞质中交换Pi，胞质中3-PGA和triose-P的增加、Pi的减少能通过抑制F6P2K的活性，激活F26BPase的活性降低Fru-2, 6-P₂的水平。低水平的Fru-2, 6-P₂可以减轻对胞质果糖-1, 6-二磷酸酯酶(FBPase)活性的抑制，增加向蔗糖合成的通量。当蔗糖的合成速率超过出口速率时，胞浆中Fru-2, 6-P₂的增加激活F6P2K活性抑制F26BPase活性，增加的Fru-2, 6-P₂水平抑制胞质FBPase并限制蔗糖的合成，由此导致3-PGA的增加和基质中Pi的减少，激活ADPglc焦磷酸化酶来刺激淀粉合成。植物F2KP的活性影响细胞中Fru-2, 6-P₂的水平，从而控制蔗糖和淀粉的碳分配^[6]。

据文献报道，目前已经从多种生物中克隆到F2KP的基因序列^[5]，其中有些物种通过原核表达和蛋白纯化得到了单一的F2KP蛋白，例如拟南芥和玉米，但是不同的物种诱导条件是不同的。拟南芥基因AtF2KP选用pThioHisC载体，在温度为37 ℃、IPTG浓度为1 mmol/L的条件下诱导16 h可诱导出AtF2KP蛋白^[19]；玉米基因mF2KP选用pET-30载体，在温度为25 ℃、IPTG浓度为1 mmol/L的条件下诱导5 h可诱导出mF2KP蛋白^[20]。

长期以来，研究者较为关注F2KP在光合组织中的表达，例如在橡胶树中HbF2KP基因在叶片中表达最高，推测该基因在橡胶树叶片的光合细胞蔗糖合成过程中发挥着重要的调控作用^[21]。F2KP在非光合组织中也有表达，例如在玉米中，F2KP除在茎和叶中表达，在雄花序和未成熟的种子中也有较低的表达^[22]。

关于番木瓜中CpF2KP的基因功能至今未见报道，猜测CpF2KP可能跟其他植物中的F2KP有相似功能。因此对番木瓜的基因CpF2KP展开分子生物学研究。为验证CpF2KP的蛋白功能，首先要做的就是得到CpF2KP的纯化蛋白，检测其F6P, 2-K和F26BPase的酶活。本研究首次从番木瓜的转录组序列中提取该基因的cDNA序列，全长2 274 bp，序列分析发现其具有F6P, 2-K的保守结构域。扩增CpF2KP的cDNA全长，克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，确定该基因编码的蛋白最佳诱导条件为IPTG浓度0.5 mmol/L、温度28 ℃。并且根据福建农林大学免疫中心的蛋白纯化方法，纯化到单一蛋白。此外还发现该基因在种子中高度表达，推测该基因可能在番木瓜种子发育过程的蔗糖淀粉代谢通路中发挥重要功能。为后续研究CpF2KP的酶活特性及其作用物Fru-2, 6-P₂对蔗糖和淀粉之间碳分配的分子调控机制提供了基础，为番木瓜的分子育种提供重要的基因资源。