WOX (WUSCHEL-related homebox)基因家族属于同源盒(homeobox, HB)转录因子家族^[1]，是一种植物特异性转录因子，在植物中广泛存在。WOX基因家族成员含有一个保守的HB结构域，该结构通常含有60–66个氨基酸，通过螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)特殊结构结合DNA，进而调控下游基因表达^[2]。WOX基因家族广泛参与植物生长发育活动，如胚胎早期发育和极性形成、叶片发育和干细胞分化等^[3-4]。

近年来随着分子技术的发展，WOX基因家族成员的功能逐渐得到解析，其中在模式植物拟南芥中的功能研究相对比较清晰。拟南芥中AtWOX基因家族的鉴定是基于AtWUS (AtWUSCHEL)基因的编码序列，通过序列比对，在拟南芥数据库中查找相关序列并最终确定了15个AtWOX基因。根据其进化关系，Haecker等^[3]将15个AtWOX基因划分到3个进化支(亚类)：AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14属于古老进化支；AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12属于中等进化支；AtWUS及AtWOX1–AtWOX7属于年轻进化支也称为WUS进化支。通常高等植物的WOX基因存在于以上3个进化支上，而低等植物如藻类、苔藓中的WOX基因只存在于古老进化支^[1]。年轻进化支上的AtWOX基因成员主要参与拟南芥干细胞调节、胚胎发育及生殖发育，而其他进化支上的AtWOX基因不具有调节干细胞的功能^[5]。

AtWUS基因通过维持多能干细胞参与植物细胞去分化过程，进而调控细胞命运。在芽分生组织中，AtWUS和AtCLV基因(AtCLAVATA)形成反馈环动态平衡调节干细胞稳态^[4]。AtWUS主要参与芽和花分生组织干细胞调节^[6]，在植物中被广泛研究。此外，研究发现AtWUS是植物中唯一一个已被证实可参与调节全能干细胞和多能干细胞的转录因子。AtWOX1和AtWOX3具有一定的功能冗余，均能参与叶缘分生组织及板状分生组织活性调控，促进叶片细胞增殖，增大叶片面积^[7]。AtWOX2参与调控植物胚胎发育，如分裂时间及方向等^[3]，其在裸子植物海岸松(Pinus pinaster)中的同源基因PpWOX2表现为组成型表达，调控子叶胚胎的数量及质量^[8]，影响胚胎发育。AtWOX4和AtWOX5参与拟南芥形成层和根分生组织中的干细胞调节^[9-10]。AtWOX6参与调节拟南芥胚珠发育，并在胚珠中大量表达^[11]。AtWOX7通过直接抑制细胞周期基因调节侧根发育^[12]。中等进化支上的AtWOX8和AtWOX9主要参与受精卵极性建立，进而完成不对称的细胞分裂^[13]。位于古老进化支的AtWOX10目前还未有相关文献报道其功能。AtWOX11和AtWOX12具有一定的功能冗余，主要参与干细胞从原形成层细胞向根器官发生的过渡过程^[14]。AtWOX13主要参与植物从营养生长向生殖生长的转变^[15]，该基因也被证明是拟南芥愈伤组织形成及器官重新连接的关键调节因子，参与嫁接过程中供受体器官重新连接^[16]。AtWOX14促进生物活性赤霉素(gibberellins, GAs)的积累，并诱导茎维管组织径向生长的木质化^[17]，与AtWOX4在木质部信号通路调控途径中具有一定的功能冗余作用^[18]。

以上可以看出WOX基因家族成员主要参与拟南芥关键发育过程的调控。除拟南芥外，在其他物种中也鉴定出了WOX基因家族，如双子叶植物中的杨树(Populus)^[19]、油菜(Brassica napus)^[20]、黄瓜(Cucumis sativus)^[21]和茄子(Solanum melongena)^[22]等；单子叶植物中的水稻(Oryza sativa)^[19]、玉米(Zea mays)^[19]、小麦(Triticum aestivum)^[23]和松树(Pinus Linn)^[24]等。在豆科植物中，部分WOX基因家族也被报道，如：蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、菜豆(Phaseolus vulgaris)和大豆(Glycine max)，分别含有19、19和33个WOX基因^[25]。对于豆科植物中的一些基因功能也有相关研究，如蒺藜苜蓿中STF (STENOFOLIA, 拟南芥AtWOX1同源基因)是叶缘分生组织中细胞分裂的必需基因^[26]，STF可抑制MtWOX9活性，两者拮抗调控叶片生长^[27]；MtWOX5可参与苜蓿结瘤分生组织的发育^[28]；在大豆中过表达GmWOX18能够促进丛生芽的再生，提高大豆的遗传转化效率^[25]；另外在豌豆(Pisum sativum)中有研究表明，AtWOX1的同系物LATH (LATHYROIDES)参与控制叶片扩展和花的发育过程^[29]。

绿豆(Vigna radiata)是一种重要的豆科作物，是蛋白质、膳食纤维、矿物质和维生素的极好来源^[30]，且可改善“三高”，预防癌症，并具有保肝和提高免疫的功能，是一种药食同源的功能性杂粮作物^[31]，具有非常重要的营养价值。然而目前在绿豆中还没有关于VrWOX基因家族的报道。WOX基因在各种生理和发育阶段发挥着关键作用，绿豆VrWOX基因家族的鉴定与功能研究将为定向改造绿豆，提高绿豆的产量和生态适应性提供重要的基因资源。本研究鉴定了42个绿豆VrWOX基因家族成员，对该基因家族成员进行了分类，解析了其基因结构、种内和种间共线性、启动子顺式作用元件、基因表达模式及蛋白互作网络等。本研究的开展有助于了解绿豆VrWOX基因家族的结构和功能，为进一步解析绿豆中该家族成员的功能提供了一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 基因组数据获取

根据Haecker等^[3]提到的拟南芥15个AtWOX基因家族成员，利用AtWOX基因号从TAIR10 (https://www.arabidopsis.org)^[32]网站上获取AtWOX氨基酸序列。大豆、菜豆和蒺藜苜蓿的WOX基因家族成员的氨基酸序列均从Phytozome (https://phytozome-next.jgi.doe.gov)网站上获取^[25]。

1.2 绿豆VrWOX基因家族成员鉴定

根据WOX基因家族的pfam family编号PF00046，利用HMMER^[33]工具对绿豆全基因组进行鉴定，筛选出含有保守结构域的绿豆VrWOX基因家族候选基因。根据文献中提到的15个拟南芥的AtWOX基因家族成员的氨基酸序列^[3]，通过序列比对(BLAST)^[34]在NCBI (National Center for Biotechnology Information)网站上获得绿豆VrWOX基因家族候选基因。进一步通过BLAST和HMMER双重筛选确定VrWOX基因家族成员。VrWOX基因家族成员的染色体位置、氨基酸数目从NCBI数据库中获得；同时利用在线工具ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)对VrWOX基因进行等电点、分子量分析。

1.3 VrWOX基因序列比对及进化分析

为探究绿豆与拟南芥、大豆、菜豆和蒺藜苜蓿WOX基因之间的进化关系，将获得氨基酸序列通过MUSCLE软件进行多重序列比对，然后利用FastTree^[35]构建最大似然法(maximum likelihood method, ML)系统发生树，最后将ML系统发生树文件输入到ITOL网站(https://itol.embl.de/itol.cgi)中进行注释和优化。为鉴定绿豆VrWOX基因进化关系，利用FastTree^[35]对绿豆VrWOX基因家族成员的氨基酸序列进行分析，并利用近邻相接法构建系统发生树，最后利用ITOL网站进行优化。

1.4 基因结构和motif分析

为鉴定VrWOX基因结构，利用从NCBI获取的VrWOX基因家族成员的内含子和外显子等基因信息，在GSDS (Gene Structure Display Server)^[36]网站上进行可视化分析。为鉴定VrWOX蛋白保守区域位置，通过pfam (http://pfam.xfam.org/)网站查找所有VrWOX基因蛋白结构域，使用GSDS软件绘制VrWOX基因蛋白的保守HB结构域。为鉴定VrWOX蛋白motif，利用VrWOX基因氨基酸序列，在MEME (Multiple Em for Motif Elicitation)^[37]网站上进行分析，参数为默认参数，每个基序的序列长度范围：6–150，最后利用ITOL网站进行可视化分析。

1.5 重复基因分析

为鉴定VrWOX基因在染色体上的位置，在NCBI获取VrWOX基因家族成员的基因注释文件，整理基因的位置信息并利用MapChart软件^[38]进行可视化分析。为分析VrWOX基因家族成员的重复关系，通过MCScanX工具^[39]对家族成员进行共线性分析，使用默认参数输出数据，结果利用CIRCOS软件^[40]进行展示。此外，下载了拟南芥WOX和菜豆WOX基因家族成员的基因注释文件，通过MCScanX工具^[39]对家族成员进行共线性分析，使用默认参数输出数据，结果利用CIRCOS软件^[40]进行展示。

1.6 顺式作用元件分析

为分析VrWOX基因启动子元件，从NCBI上获取VrWOX基因家族各个成员的启动子序列(选取起始密码子ATG上游2 000 bp区域)，并上传至PlantCARE (https://bioinf-ormatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)^[41]对选取序列进行分析，使用GSDS^[36]软件对所分析的顺式作用元件在启动子上的位置进行绘图，并根据每个顺式作用元件功能进行总结归类。

1.7 VrWOX基因在绿豆各组织的表达量分析

为鉴定绿豆VrWOX基因在不同组织的表达，在山东青岛大田中种植中绿一号绿豆。在7月份绿豆植株开花结荚后，收集植株的根、根瘤、茎、茎尖、叶、花、荚和种子的材料。提取RNA，反转录成cDNA，实验方法如Li等^[42]所述。利用NCBI设计VrWOX基因家族成员的实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)引物，通过实时荧光定量PCR测定42个VrWOX基因在这8个组织中的表达，利用VrActin (Vradi03g00210)作为内参计算目的基因表达量。为分析VrWOX基因在不同组织器官的表达情况，对表达量数据进行处理(log₂转换），然后通过Tbtools^[43]工具绘制热图。实时荧光定量PCR实验方法如Ma等^[44]所述，实时荧光定量PCR所使用的引物见表 1。

1.8 VrWOX基因家族Ka/Ks分析

在NCBI上获取绿豆VrWOX基因和蛋白质数据，使用MCScanX软件^[39]对WOX家族进行共线性分析，选择具有共线性的基因对，通过计算非同义替换率(Ka)与同义替换率(Ks)的比值来推断选择压力，进而研究重复基因在进化过程中的选择压力。

1.9 绿豆VrWOX基因家族蛋白互作预测

以拟南芥WOX同源蛋白序列为基础，在STRING (https://string-db.org/)网站上传拟南芥和绿豆的WOX氨基酸序列，分析预测VrWOX互作蛋白，并在该网页上输出VrWOX蛋白互作网络图。

2 结果与分析 2.1 绿豆VrWOX基因家族鉴定

为鉴定绿豆VrWOX基因家族成员，根据WOX基因家族的pfam family编号PF00046，利用HMMER工具对绿豆全基因组进行分析，筛选出含有保守结构域的绿豆VrWOX基因家族候选基因。然后利用15个拟南芥AtWOX基因氨基酸序列，在NCBI数据库中比对，最终确定42个VrWOX基因家族成员(表 2)。根据42个绿豆VrWOX蛋白质序列编号(Gene ID)，按照从小到大的原则，将其分别命名为VrWOX1至VrWOX42 (表 2)。根据VrWOX基因染色体位置信息，将42个VrWOX成员在染色体上的位置进行可视化分析(图 1)。由于VrWOX1、VrWOX2、VrWOX3、VrWOX4、VrWOX39缺少染色体位置信息，因而在图 1未显示。在绿豆11对染色体中，7号染色体含有VrWOX基因数量最多，为7个，分别为VrWOX21、VrWOX22、VrWOX23、VrWOX24、VrWOX26、VrWOX27和VrWOX42；而8号、9号和11号染色体均含有2个VrWOX基因，数量最少。对42个VrWOX基因的蛋白质序列和理化性质进行分析(表 2)，发现VrWOX蛋白含有的氨基酸数目范围为151 (VrWOX2)— 847 (VrWOX41)；分子量大小范围为17.48 kDa (VrWOX2)至92.99 kDa (VrWOX41)；等电点大小范围为4.50 (VrWOX39)至10.45 (VrWOX11)，因而VrWOX既存在碱性蛋白又存在酸性蛋白(表 2)。

2.2 绿豆VrWOX基因进化分析及重复基因鉴定

为研究VrWOX基因家族成员的进化关系，利用拟南芥、菜豆、大豆、蒺藜苜蓿和绿豆WOX基因家族成员的氨基酸序列构建了系统发生树。根据系统发生树分支，将VrWOX基因家族成员分为3个亚类(亚类Ⅰ古老进化支、亚类Ⅱ中等进化支、亚类Ⅲ年轻进化支也叫作WUS进化支)(图 2)^{[1, 3]}。亚类Ⅰ古老进化支含有19个VrWOX基因，亚类Ⅱ中等进化支含有12个VrWOX基因，其余11个VrWOX属于亚类Ⅲ年轻进化支。在这几个物种中，绿豆VrWOX与菜豆PvWOX同源关系较近，普遍存在同一亚支上。多个VrWOX基因与已知功能的其他物种中WOX基因同源关系较近，因而它们可能具有类似的功能。例如，VrWOX37与拟南芥AtWUS基因位于同一个分支上，因而VrWOX37可能与AtWUS具有类似的功能，参与植物干细胞稳态平衡(图 2)。绿豆基因组在长期进化过程中经历过一次全基因组加倍，因而可能存在重复基因^[45-46]。利用MCScanX软件对VrWOX的基因重复模式进行分析(图 3)。通过共线性分析，共发现12对VrWOX重复基因，分别为VrWOX7/20、VrWOX10/29、VrWOX11/38、VrWOX12/31、VrWOX14/19、VrWOX16/32、VrWOX16/41、VrWOX25/30、VrWOX26/36、VrWOX28/40、VrWOX32/41、VrWOX34/42。VrWOX重复基因在绿豆11对染色体中均有分布，其中包含2个染色体内重复事件(VrWOX16/41、VrWOX25/30)和10个染色体间重复事件(图 3A)。

为鉴定绿豆VrWOX重复基因在进化过程中的选择压力，对12个VrWOX重复事件进行了Ka/Ks分析(表 3)。若VrWOX基因Ka/Ks比率大于1，则认为VrWOX基因在进化过程中受到正选择效应，可加速基因进化；若VrWOX基因Ka/Ks比率等于1，则认为VrWOX基因存在中性选择，即自然选择对VrWOX基因进化没有影响；若VrWOX基因Ka/Ks比率小于1，则认为VrWOX基因经过了纯化选择^[47]。我们发现12个VrWOX重复事件的Ka/Ks值在0.040 795– 0.284 845之间，所有Ka/Ks值均小于1。因而VrWOX重复基因在进化过程中得到了纯化选择(表 3)。

此外，为了研究绿豆VrWOX基因家族在种间的进化关系，选取模式生物拟南芥和与绿豆进化关系较近的菜豆作为研究对象，分别对绿豆和拟南芥及绿豆和菜豆的WOX基因进行了共线性分析。研究发现42个绿豆VrWOX基因和15个拟南芥AtWOX基因中有15个WOX同源基因对(图 3B)，42个绿豆VrWOX基因和17个菜豆PvWOX基因间有22个同源基因对(图 3C)。这些同源基因对之间可能存在功能保守现象。

2.3 VrWOX基因结构分析

为研究VrWOX的基因结构，利用从NCBI数据库中获得VrWOX基因序列(包括非编码区域、外显子和内含子)，绘制了VrWOX基因结构图(图 4B)。从基因结构图中可以看出所有VrWOX基因均含有2个及以上内含子；另外，除VrWOX2和VrWOX11外，所有VrWOX基因都包含UTR结构。VrWOX基因家族成员含有不同数目的内含子和外显子。VrWOX基因含有的外显子数目为2 (VrWOX2、VrWOX4、VrWOX7、VrWOX11、VrWOX20和VrWOX33)−18 (VrWOX5、VrWOX16、VrWOX27、VrWOX32、VrWOX35和VrWOX41)(图 4B)。亚类Ⅰ古老进化支中VrWOX外显子数目为2−9个；亚类Ⅱ中等进化支中VrWOX基因外显子数目变化较大，为2−18个，其中一半的亚类Ⅱ中等进化支中VrWOX基因含有18个外显子(VrWOX5、VrWOX16、VrWOX27、VrWOX32、VrWOX35和VrWOX41)；亚类Ⅲ年轻进化支中VrWOX外显子数目为2−4个。

2.4 绿豆VrWOX基因家族保守序列分析

为进一步鉴定VrWOX蛋白之间的保守性，利用MEME^[37]软件对VrWOX成员的氨基酸序列保守区域进行预测(图 4C，图 5)。总共发现20个motif，其中motif 1和motif 2存在于所有的VrWOX家族成员中。然而不同进化支上VrWOX蛋白的motif组成模式差异很大。亚类Ⅰ古老进化支上VrWOX成员的motif分布很有特点，例如，VrWOX10、VrWOX15和VrWOX29含有相同的motif 20，并且motif 20只存在于这3个蛋白中；VrWOX6、VrWOX8、VrWOX23、VrWOX33和VrWOX39含有3个相同的motif：motif 1、motif 2和motif 4；VrWOX12、VrWOX13、VrWOX18、VrWOX22、VrWOX24、VrWOX26、VrWOX31、VrWOX33、VrWOX36和VrWOX40含有5个共同motif：motif 1、motif 2、motif 4、motif 16和motif 19。亚类Ⅱ中等进化支上的VrWOX5、VrWOX16、VrWOX27、VrWOX32、VrWOX35和VrWOX41均含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 4、motif 6、motif 7、motif 8、motif 9、motif 10、motif 11、motif 12、motif 13、motif 14、motif 15、motif 16和motif 19。亚类Ⅲ年轻进化支上的VrWOX成员均有motif 1、motif 2、motif 14和motif 19。由以上可以看出，VrWOX基因同源关系越近，结构相似性越大。对42个绿豆VrWOX蛋白HB保守结构域所在位置进行分析，发现VrWOX蛋白HB保守结构域均位于VrWOX蛋白的N端或中间位置，没有HB保守结构域分布在C端(图 4D)。

2.5 绿豆VrWOX基因顺式作用元件分析

顺式作用元件通过与转录因子结合影响基因表达，进而调控基因的转录起始和转录效率，鉴定分析42个VrWOX基因启动子区域的顺式作用元件，可为预测其基因功能奠定基础。

首先，在NCBI数据库中获取42个VrWOX基因起始密码子ATG上游启动子区域碱基序列，利用PlantCARE^[41]预测这些区域包含的顺式作用元件。从结果中选取具有潜在功能的顺式作用元件，并根据其功能特性，将它们分为4个组，激素相关元件、非生物胁迫相关元件、光反应相关元件和发育相关元件(图 6A，已提交国家微生物科学数据中心，编号：NMDCX0000153)，其位置分布在图 6B中展示。从图中可以看到，所有VrWOX基因的启动子都含有一定数量的激素相关元件，如：除VrWOX1、VrWOX11、VrWOX16、VrWOX27、VrWOX33和VrWOX39外，其他VrWOX基因均含有脱落酸响应相关元件(已提交国家微生物科学数据中心，编号：NMDCX0000153)；VrWOX14、VrWOX23和VrWOX35含有的茉莉酸甲酯响应相关元件最多(已提交国家微生物科学数据中心，编号：NMDCX0000153)；除VrWOX3、VrWOX6、VrWOX7、VrWOX8、VrWOX10、VrWOX15、VrWOX17、VrWOX22、VrWOX25、VrWOX27、VrWOX33、VrWOX36、VrWOX39、VrWOX40和VrWOX42外，在其他VrWOX基因中激素相关元件在所有元件中数目最多(已提交国家微生物科学数据中心，编号：NMDCX0000153)。除VrWOX35外，其他VrWOX基因的启动子区域均含有光反应相关元件；除VrWOX37外，其他VrWOX中均存在着非生物胁迫相关元件。例如，VrWOX14、VrWOX25、VrWOX35和VrWOX38均含有3个非生物胁迫相关元件：防御和应激反应相关元件、低温响应元件和厌氧诱导元件；VrWOX27仅含有厌氧诱导元件；只有40%的VrWOX基因含有发育相关的顺式作用元件，其中VrWOX33和VrWOX36含有较多的发育相关元件，分别为5个和4个。

2.6 VrWOX蛋白互作网络分析

为进一步分析VrWOX蛋白可能的工作机制，我们对VrWOX蛋白互作网络进行分析。以拟南芥WOX同源基因为基础，使用STRING数据库对VrWOX基因家族蛋白进行分析。研究发现VrWOX蛋白质之间存在着不同的调控通路(图 7)。由于是根据拟南芥氨基酸序列为基础匹配绿豆氨基酸序列，图中VrWOX37蛋白所在节点代表AtWUS (At2g17950)和VrWOX37两个蛋白(图 7)。在图 7中，VrWOX37蛋白与拟南芥中的AtTPL (At1g15750)、AtCLV2 (At1g65380)和AtWOX14 (At1g20700)以及绿豆中的VrWOX29、VrWOX34、VrWOX38相互作用。在拟南芥中，AtCLV与AtWUS通过反馈回路来调节芽尖大小和芽尖完整^{[5, 48]}，AtTPL (AtTOPLESS)可与AtWUS蛋白相互作用参与拟南芥干细胞稳态^[5]。VrWOX37与AtWUS同源关系最近(图 2)，并且在网络中与CLV1/2/3 (AtCLV1/2/3)和TPL (AtTPL)存在相互作用(图 7)，说明VrWOX37可能在维系绿豆干细胞稳态中发挥重要作用。此外，VrWOX6、VrWOX8、VrWOX9、VrWOX17、VrWOX21和VrWOX23并未表现出有相关蛋白互作。

2.7 绿豆VrWOX组织表达模式分析

在植物的不同组织部位，不同基因发挥不同的功能。为了进一步研究VrWOX基因的功能，我们在绿豆根、根瘤、茎、茎尖、叶、花、荚和种子8个组织中检测了绿豆VrWOX基因的表达(图 8)。从图 8中可以看到，不同基因在不同组织中表达不同。Ⅰ类古老进化支上的VrWOX26和VrWOX33在花中表达量较高，这两个基因和AtWOX13在同一进化枝上，AtWOX13主要参与拟南芥营养生长向生殖生长的转变^[15]，说明VrWOX26和VrWOX33可能参与绿豆生殖发育过程。该分支上的其他VrWOX基因在其他7个组织中均有不同程度地表达，如：VrWOX6、VrWOX10、VrWOX29、VrWOX33和VrWOX36在豆荚中表达较高，VrWOX6、VrWOX10和VrWOX39在种子中表达较高，VrWOX6在叶片中大量表达。Ⅱ类中等进化支上的VrWOX5、VrWOX35和VrWOX41在种子中表达量较高。AtWOX8和AtWOX9参与拟南芥中胚胎极性建立^[13]，且与这3个绿豆VrWOX基因属于同一进化支，因而VrWOX5、VrWOX35和VrWOX41在绿豆中可能发挥与AtWOX8和AtWOX9相似的功能。Ⅲ类年轻进化支上的VrWOX基因表达量普遍偏低，与该年轻进化支上的其他基因相比，VrWOX30在种子的表达量较高。

3 讨论

WOX基因参与植物干细胞分化、叶原基形成、体外植株再生等过程^[2]，在植物生长发育过程中具有重要作用。开展WOX基因功能的研究，对于解析植物发育调控网络具有重要的意义。近年来，随着生物技术的发展，WOX基因已在多个豆科植物中报道，如蒺藜苜蓿、大豆和菜豆^[25]。然而绿豆VrWOX基因家族信息尚不清楚。

本研究共鉴定出42个绿豆VrWOX基因，通过对VrWOX基因染色体位置分析，发现7个VrWOX基因位于7号染色体上，而其余染色体上含有的VrWOX基因数目较少，因而VrWOX基因在绿豆基因组进化过程中出现了分布不均的现象(图 1)，与其他豆科植物相似^[25]。在绿豆11条染色体上都有VrWOX重复基因的出现(图 3)，因而VrWOX重复基因可能是在绿豆全基因组加倍过程中形成的。多重复事件的出现说明VrWOX基因家族在绿豆基因组进化过程中不断扩增。对绿豆12个VrWOX重复事件的Ka/Ks分析，发现其比值均低于1 (表 3)，说明VrWOX基因主要在纯化选择下进化，与大多数基因家族进化是相同的^[47]。通过共线性分析，发现多个与拟南芥AtWOX和菜豆PvWOX同源的VrWOX基因(图 3)，这些VrWOX基因可能与拟南芥和菜豆中的WOX同源基因来源于同一个祖先，可能具有类似的功能。此外，拟南芥、水稻、绿豆基因组分别为125、466和543 Mb，而绿豆中VrWOX基因数量(42个VrWOX)分别接近拟南芥(16个AtWOX)和水稻(14个OsWOX)的3倍^{[5, 19]}，因而植物中WOX基因数量和基因组大小不存在直接关系。绿豆VrWOX基因Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类亚家族分别含有19、12和11个成员，而大豆含有6、6和20个成员，菜豆含有4、3、10个成员(图 2)^[25]。3个亚类WOX基因在豆科作物绿豆、大豆和菜豆中呈现比例不同，因而WOX基因在豆科作物基因组进化过程中出现了严重的分化现象。

VrWOX基因结构差异很大，不同进化支上的VrWOX基因结构不尽相同，因而VrWOX基因可能具有不同的功能。通过分析保守序列，发现所有VrWOX蛋白均含有motif 1和motif 2，这2个motif可能代表VrWOX基因的HB保守结构域(图 4)。另外，我们发现不同进化支上VrWOX蛋白含有的motif组成模式也不同，和其基因结构相似，即VrWOX基因3个进化支在进化过程中可能出现了不同的分工(图 4)，与大豆中具有相似的现象^[25]。Ⅱ类中等进化支上的VrWOX5、VrWOX16、VrWOX27、VrWOX32、VrWOX35和VrWOX41均含有18个外显子，而其他VrWOX基因最多含有9个外显子(图 4)，说明部分VrWOX基因外显子在进化过程中可能丢失。这6个含有18个外显子的VrWOX基因位于同一进化分支上，同源关系较近，由16个相同的motif组成(图 4B)，并且这6个VrWOX基因中出现了3个重复基因事件：VrWOX16/32、VrWOX16/41和VrWOX32/41。由此说明，VrWOX16、VrWOX32和VrWOX41可能由同一祖先演化而来。此外，大豆WOX基因外显子数目为2–4个，与绿豆存在很大差异，因而豆科作物在进化过程中基因结构发生了很大改变^[25]。

对绿豆VrWOX基因启动子区域顺式作用元件分析，发现除VrWOX35外，其他VrWOX基因均含有光反应元件，因此VrWOX35可能不参与绿豆光反应过程。VrWOX27的启动子区域不含有发育相关元件，但含有较多的非生物胁迫相关元件(图 6)，因而VrWOX27可能不参与植株发育过程，而是主要参与绿豆非生物胁迫响应过程。VrWOX14、VrWOX23和VrWOX35具有最多的茉莉酸甲酯响应相关元件(已提交国家微生物科学数据中心，编号：NMDCX0000153)，说明这3个VrWOX基因可能参与植物生长发育与抵御逆境胁迫等过程。此外，虽然有些VrWOX基因含有多种顺式作用元件，但是VrWOX基因并不是在所有组织中都表达。植物基因表达除受顺式作用元件调控外，还受到很多其他因素调控，例如生物钟和表观遗传。这些VrWOX基因可能会在不同发育时期或不同时间段表达。VrWOX基因表达模式与其功能存在着密切关系，Ⅲ类年轻进化支上的11个VrWOX基因在各个部位表达量均偏低(图 8)，因而Ⅲ类VrWOX基因在绿豆生长发育阶段可能不起作用或起微弱作用。在蛋白互作网络中，VrWOX37与多个VrWOX蛋白及拟南芥AtCLV和AtTPL存在相互作用(图 7)。AtCLV、AtTPL和AtWUS相互作用共同维持拟南芥芽尖干细胞稳态^[48]，因而VrWOX37极有可能也是绿豆茎分生组织干细胞分化过程中的关键基因。

综上所述，本研究共鉴定了42个绿豆VrWOX基因，并对其氨基酸数目、分子量、等电点和蛋白调控网络进行分析。VrWOX基因在绿豆染色体上分布不均匀，其在7号染色体分布最多。VrWOX基因主要分为3个亚类：亚类Ⅰ含有19个成员，亚类Ⅱ含有12个成员，亚类Ⅲ含有11个成员。不同亚类VrWOX基因结构和motif差异较大，并且不同VrWOX基因启动子区域含有不同种类和数量的顺式作用元件，因而VrWOX基因在不同组织中表现出不同的表达模式。本研究的开展不仅鉴定了绿豆VrWOX基因家族，还为后续绿豆植株发育调控机制的解析奠定了一定的基础。