2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王雪花, 韩佳, 马济中, 杨曦婷, 满华丽, 乔亚丽, 高雪琴, 胡琳莉
- WANG Xuehua, HAN Jia, MA Jizhong, YANG Xiting, MAN Huali, QIAO Yali, GAO Xueqin, HU Linli
- 大白菜NHX基因家族的鉴定与表达分析
- Identification and expression analysis of NHX gene family in Chinese cabbage
- 生物工程学报, 2023, 39(2): 552-565
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(2): 552-565
- 10.13345/j.cjb.220622
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文章历史
- Received: August 5, 2022
- Accepted: November 1, 2022
引用本文
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目前约有超过400个编码Na+/H+反向运输载体(Na+/H+ hydrogen exchangers, NHEs)已经在类似于GenBank数据库中注册，该Na+/H+反向运输载体广泛存在于自然界的各种生物，如原核生物霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母和各类植物等。其主要可分为以下2种，定位于质膜上的一类和定位于胞质内膜系统(如内质网，线粒体及液泡)的一类。NHX基因属于后者，现已被证实其编码具有10–12个跨膜结构的蛋白，定位于植物液泡膜上，其作用机理为依靠液泡膜质子泵(TP-H+-ATPase和TP-H+-PPase)建立的膜内外质子浓度差提供能量来进行Na+与H+跨膜反向运输，将Na+区隔化[1]。
NHX基因亚家族属于CPA1基因家族，具有Na+/H+交换(PF00999)蛋白结构域[2]，广泛存在于多种物种中，现已在至少60种物种发现了该基因家族蛋白。在葡萄(Vitis vinifera L.)中有8个NHX基因家族成员[3]；藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)基因组中存在10个CqNHX基因家族成员[4]；杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)有4个基因属于NHX亚家族，4个基因属于CHX亚家族，8个基因属于KEA亚家族[5]；胡杨(Populus euphratica Oliv.)中存在6个NHX基因家族成员[6]；香蕉(Musa nana Lour.)中鉴定到11个MaNHXs基因家族成员[7]。在20世纪90年代以来，人们将单一的Na+/H+反向转运蛋白基因转入植物中，发现超量表达外源液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因能够显著提高受体植物的耐盐性[8]。随后，人们先后在拟南芥发现并克隆了NHX01基因家族的其他成员，已发现拟南芥NHX01基因家族6个基因被标注为编码Na+/H+反向转运蛋白的功能成员[9]。NHX基因具有维持Na+ (K+)浓度、调节细胞内的pH值、控制细胞扩增、维持细胞膨压的功能，是与植物抗旱耐盐性相关的关键因子[10]。
在我国盐碱地总面积约0.33×108 hm2，其中可耕地面积占666.7×104 hm2以上，广泛分布于东北和华北重要农产区、生态脆弱的西北内陆地区以及经济繁荣的沿海地带。由于盐碱地盐浓度过高，不能种植各类农作物而成为荒地，培育耐盐农作物是开发这些盐碱荒地的有效途径。相对于粮食作物，蔬菜的经济价值较高，是开发盐碱地更有前景的农作物[11]，而大白菜(Brassica rapa ssp. Pekinensis)是人们餐桌上不可缺少的蔬菜之一，也是我国种植面积较大的蔬菜作物之一[12]，所以如何提高白菜抗盐性是一个很重要的问题。
目前，关于大白菜基因家族功能的研究报道已经相对成熟，有研究指出大白菜中GID1基因家族[13]和YUCCA基因家族[14]与大白菜的生长发育有关；BrROP基因家族[15]对花粉管的萌发较敏感；ENT基因家族[16]具有控制核苷转运的功能；BrLAC基因家族[17]可以代替多酚氧化酶参与酶促褐变。但是对于大白菜NHX基因家族的研究报道相对较少。因此，本研究利用生物信息学方法鉴定大白菜NHX基因家族成员，分析其理化性质、染色体定位、基因结构、蛋白结构及系统发育等信息，并且用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法初步探究了BrNHXs基因响应非生物胁迫的表达模式，筛选出候选基因进一步研究其功能，为下一步利用该基因进行遗传改良提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料及处理本研究以娃娃菜为供试材料，品种为“秋玉黄”。选择籽粒饱满、大小一致的娃娃菜种子，温汤浸种后排列有序地播到滤纸上，然后用30 cm×50 cm瓷盘子铺上2层湿润的滤纸，滤纸下面垫一层湿润的毛巾，再给其盖上一层喷过水的滤纸，随后再覆盖一层湿润的毛巾，这样保证种子在湿润的环境下发芽，且发芽速度较快。放入培养箱黑暗催芽48 h [培养温度：(25±1) ℃]。待其长出4–5 cm的芽之后，将其播到种植棉上进行水培[培养温度：白天(25±1) ℃/夜晚18 ℃，光周期14 h/10 h昼/夜，光照强度：200 µmol/(m2·s)]。播种23 d (三叶一心时)将娃娃菜置于高温气候箱(32 ℃/20 ℃)、低温气候箱(10 ℃/5 ℃)内进行高温低温处理，不浇水进行干旱处理、用2% NaCl溶液浇灌进行盐胁迫处理，在处理0、6、12、24、48和72 h时分别取幼苗的叶片，立即用液氮冷冻并放在−80 ℃下保存。
利用植物RNA提取试剂盒(TaKaRa)从叶片组织中提取总RNA。利用Prime ScriptRT试剂盒(TaKaRa)从总RNA合成第一链cDNA片段。利用实时荧光定量PCR测定BrNHXs基因的相对表达水平。
1.2 大白菜NHX基因家族成员鉴定从拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)中得到拟南芥(Arabidopsis thaliala)的NHX基因登录号，获取其氨基酸序列并保存下来。然后用拟南芥的氨基酸序列比对大白菜数据库(http://brassicadb.cn/#/)，获得相应的大白菜基因或蛋白，从而获取大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)中NHX基因登录号，并保存大白菜NHX基因的氨基酸序列。从已知文献中找到NHX基因的蛋白结构域为Na+/H+交换(PF00999)[18]，将大白菜基因的氨基酸序列输入到筛选结构域网站HMMER (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)进行筛选，筛选出含有此结构域的基因成员，将大白菜NHX基因的登录号输入到Ensembl Plant (http://plants.ensembl.org/index.html)在线网站中，下载并保存基因的全长、编码序列(coding sequence, CDS)以及cDNA序列，以供后续使用。
1.3 大白菜NHX基因家族理化性质在大白菜数据库(http://brassicadb.cn/)中找到特有的Search工具选项，检索到大白菜NHX基因家族的染色体位置、正反链和染色体具体起始位置，再利用ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)在线软件分析大白菜基因家族的理论等电点(isoelectric point)、相对分子量、亲水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)和氨基酸数目。
1.4 大白菜NHX基因家族染色体定位和基因结构在软件TBtools[19]中输入基因全长和染色体全长，得到染色体定位图，由基因在染色体上的位置顺序对大白菜NHX基因家族的基因成员进行命名。利用在线软件GSDS2.0 (http://gsds.gao-lab.org/)进行基因结构分析。
1.5 大白菜NHX基因家族成员启动子顺式作用元件分析采用TBtools分析软件，从CDS中抽取2 000 bp的序列，通过联机工具PlantCARE对其进行预测启动子顺式作用元件。在TBtools软件上将结果描绘出来，得到基因家族成员启动子顺式作用元件分布图。
1.6 大白菜NHX基因家族二级结构和亚细胞定位预测运用蛋白质结构预测软件SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在线预测蛋白质二级结构功能；利用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)在线进行大白菜NHX基因家族亚细胞定位。
1.7 大白菜NHX基因进化分析和motif利用MEGA-X软件将拟南芥中NHX基因与大白菜NHX基因的氨基酸序列进行多序列比对[20]，构建拟南芥和大白菜NHX基因家族系统发育树，用NJ检索法进行自检(bootstrap)，以1 000作为重复设定默认值。利用MEME (http://meme-suite.org/)在线程序检索大白菜NHX基因家族保守基序，预测基序的数量设置为10个。
1.8 实时荧光定量PCR将BrNHXs基因的CDS序列输入生工生物工程(上海)股份有限公司(https://www.sangon.com/)主页，进行在线引物设计(表 1)，合成引物序列。以BrActin基因作为内参。扩增体系含2 μL cDNA，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，Rox 0.4 μL，SYBR GREEN 10 μL，反应混合液6.4 μL，ddH2O 20 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环，每个处理进行3次生物学重复。BrNHXs基因的相对表达水平采用2−∆∆Ct法计算[21]。
| Gene | Forward primer (5′→3′) | Reverse primer (5′→3′) |
| BrNHX01 | GCTTTGACCTCACCCACCTTAACC | ATCAGACCAGTCGCAACACCAAG |
| BrNHX02 | CTGATGCGTGGTGCCGTGTC | ACAACAGTGATGGTGCTGGTGATC |
| BrNHX03 | CTTGTATTCGGAGAGGGCGTTGTG | GGTTAAGGTGGGTGAGGTCAAAGC |
| BrNHX04 | AGAGCGGTTCGAGACCTGTAGATG | GATCCGAGAACGATGCCGATGAC |
| BrNHX05 | CGGCGACGGCGTTTCCTTAC | GCTTGCCACCGCTCCATCTTC |
| BrNHX06 | TCGGGTTGATCGTTGGTGGTTTAG | ATGATGGGCGGAAGCAGAAACAG |
| BrNHX07 | AGTGGAGATCCGTGAGTGACAGTC | ACAAGGGAAAGACGAATGCTGCTC |
| BrNHX08 | TGGAGGAGGCGACAGGTTCTTC | ACGAGGAGAGCGACGGTGTAC |
| BrNHX09 | CCAGGAATCGCTGACCGTAT | GTAGCGGTGGATGGTGTAAACAGG |
| Actin | CTTTGCCGCTTGCTCTGATG | CTGTTGGAAAGTGCTGAGGGA |
实时荧光定量测得的BrNHXs基因的相对表达量数据采用SPSS软件(spss17.0, IBM)进行方差分析，并运用Duncan’s检验法进行显著性检验(P < 0.05)，采用Microsoft Excel 2010软件进行处理和用Origin9.0绘图。
2 结果与分析 2.1 大白菜NHX基因家族理化性质分析用拟南芥NHX基因的蛋白序列在大白菜数据库中进行BLASTp搜索，一共得到9个大白菜基因成员，将鉴定出的NHX家族基因分别命名为NHX01–NHX09。由表 2分析可知，在大白菜NHX基因家族中，BrNHX05和BrNHX08编码的氨基酸数目较多，分别为1 154 aa和1 139 aa；相对分子量主要集中在56 804.22–127 856.66 kDa，BrNHX01相对分子量最小为56 804.22 kDa；NHX基因的亲水性均为正值，为疏水性蛋白，其中BrNHX09基因最不溶于水分子。等电点位于5.35–7.68之间，其中BrNHX03和BrNHX07为碱性蛋白，其余为酸性蛋白。
| Gene | Gene Accession number |
Strand (+; −) | Chromosome location | Number of amino acid | Isoelectric point |
Formula | Molecular weight |
GRAVY |
| BrNHX01 | Bra020599 | + | 23 747 985–23 751 127 | 513 | 6.60 | C2614H4054N646O721S23 | 56 804.22 | 0.469 |
| BrNHX02 | Bra020755 | + | 23 983 891–23 986 949 | 540 | 6.15 | C2754H4292N682O764S21 | 59 853.74 | 0.438 |
| BrNHX03 | Bra039469 | + | 24 456 485–24 459 528 | 546 | 7.07 | C2784H4324N700O757S28 | 60 610.87 | 0.471 |
| BrNHX04 | Bra026197 | − | 5 341 891–5 346 226 | 743 | 6.42 | C3777H5893N961O1054S25 | 82 430.64 | 0.294 |
| BrNHX05 | Bra003601 | + | 17 279 543–17 286 364 | 1 154 | 6.31 | C5821H9142N1526O1650S30 | 127 865.66 | 0.132 |
| BrNHX06 | Bra035130 | − | 25 587 270–25 591 010 | 511 | 5.35 | C2601H3964N654O738S22 | 56 909.35 | 0.297 |
| BrNHX07 | Bra036110 | + | 2 424 337–2 427 401 | 543 | 7.68 | C2776H4317N689O755S24 | 60 193.42 | 0.498 |
| BrNHX08 | Bra017430 | + | 13 876 104–13 881 875 | 1 139 | 6.58 | C5696H9013N1485O1650S33 | 125 756.16 | 0.112 |
| BrNHX09 | Bra002905 | − | 6 915 362–6 918 243 | 533 | 6.87 | C2735H4265N663O749S16 | 58 931.90 | 0.537 |
根据每条基因在对应染色体上的位置，得出染色体定位图，将大白菜NHX基因成员命名。从图 1上看，9个基因成员分别位于大白菜10条染色体中的第2、5、6、7、9、10号染色体上，BrNHX02和BrNHX03在5号染色体上，距离相近；BrNHX04和BrNHX07基因位于染色体末端；BrNHX01、BrNHX04、BrNHX09分别独立位于第2、6、10号染色体上。
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| 图 1 大白菜NHX基因家族染色体定位图 Fig. 1 Chromosome mapping of NHX gene family in Chinese cabbage. |
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对NHX基因家族的9个成员进行基因结构分析，结果如图 2所示，该基因家族中BrNHX01、BrNHX02、BrNHX03、BrNHX07、BrNHX09这几个基因长度差别不太大，主要集中在4 000‒6 000 bp左右；BrNHX05基因最长，超过7 000 bp，且内含子分布不均匀，由此可预测BrNHX05基因与其他基因在结构和功能方面差异较大；BrNHX08基因相对较长，外显子数目最多，为22个；BrNHX03、BrNHX07、BrNHX09基因都具有13个外显子，且结构相似，由此推测BrNHX03、BrNHX07、BrNHX09基因在功能上可能具有相似性。
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| 图 2 大白菜NHX基因家族基因结构分析 Fig. 2 Gene structure analysis of NHX gene family in Chinese cabbage. |
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使用TBtools软件展示大白菜ECA基因启动子序列的相关顺式调控元件发现(图 3)，大白菜NHX启动子序列含有18个可能的顺式作用元件(表 3)。大致分为植物激素应答元件，如脱落酸应答元件(ABRE)、茉莉酸甲酯应答元件(TGACG)、乙烯应答元件(GARE)等。生物和非生物胁迫响应顺式作用元件，如光响应元件(Box 4、GATA、G-Box、MRE、AE-box等)、冷胁迫应答元件(LTR)、干旱应答元件(MBS)、参与防御和应激反应元件(TC-rich repeats)等。在这些因素中，与光反应相关的顺式作用元件占据了全部预计的一半以上，这表明NHX和发育中的光敏反应有关。
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| 图 3 大白菜NHX基因家族启动子元件分析 Fig. 3 Analysis of NHX gene family promoter elements in Chinese cabbage. |
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| cis-element | Number of genes | Sequence of cis-element | Functions of cis-elements |
| G-box | 35 | CACGTG | cis-acting regulatory element involved in light responsiveness |
| ABRE | 31 | ACGTG | cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness |
| ARE | 23 | AAACCA | cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction |
| Box 4 | 20 | ATTAAT | Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness |
| GT1-motif | 15 | GGTTAA | Light responsive element |
| LTR | 14 | CCGAAA | cis-acting element involved in low-temperature responsiveness |
| CGTCA-motif | 13 | CGTCA | cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness |
| TCT-motif | 13 | TCTTAC | Part of a light responsive element |
| TGACG-motif | 13 | TGACG | cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness |
| P-box | 7 | CCTTTTG | Gibberellin-responsive element |
| AE-box | 5 | AGAAACTT | Part of a module for light response |
| MBS | 5 | CAACTG | MYB binding site involved in drought-inducibility |
| chs-CMA1a | 5 | TTACTTAA | Part of a light responsive element |
| TGA-element | 4 | AACGAC | Auxin-responsive element |
| GATA-motif | 4 | AAGGATAAGG | Part of a light responsive element |
| MRE | 4 | AACCTAA | MYB binding site involved in light responsiveness |
| TC-rich repeats | 4 | GTTTTCTTAC | cis-acting element involved in defense and stress responsiveness |
| GARE-motif | 3 | TCTGTTG | Gibberellin-responsive element |
NHX基因家族蛋白质二级结构预测和亚细胞定位分析结果表明(表 4)，大白菜NHX基因家族编码的蛋白质二级结构都具有α-螺旋、β-转角和不规则卷曲结构，α-螺旋含量相对比例较高，范围在41.94%‒59.89%之间；β-转角含量比例相对较低为3.38%‒6.33%；不规则卷曲含量比例为25.04%‒36.40%。亚细胞定位预测发现，大白菜NHX基因家族基因主要位于液泡膜上，BrNHX04基因位于液泡膜和细胞膜上，BrNHX08基因位于细胞膜上，除以上2个基因，剩余基因都位于细胞的液泡膜上，参与基因的表达。
| Protein | Gene Accession No. | Alpha helix | Beta turn | Random coil | Subcellular localization |
| BrNHX01 | Bra020599 | 44.25 | 3.7 | 32.94 | Vacuole |
| BrNHX02 | Bra020755 | 43.15 | 4.44 | 34.07 | Vacuole |
| BrNHX03 | Bra039469 | 41.94 | 4.03 | 35.16 | Vacuole |
| BrNHX04 | Bra026197 | 59.89 | 4.04 | 25.71 | Vacuole cell membrane |
| BrNHX05 | Bra003601 | 53.03 | 6.33 | 25.04 | Vacuole |
| BrNHX06 | Bra035130 | 44.23 | 3.91 | 36.40 | Vacuole |
| BrNHX07 | Bra036110 | 44.01 | 4.79 | 32.97 | Vacuole |
| BrNHX08 | Bra017430 | 48.29 | 4.13 | 32.57 | Cell membrane |
| BrNHX09 | Bra002905 | 48.78 | 3.38 | 30.96 | Vacuole |
大白菜NHX基因家族保守域结构特征分析结果(图 4)表明，BrNHX01、BrNHX02、BrNHX03和BrNHX07除了不含有motif 10，其余结构域相似；BrNHX05和BrNHX08结构域相似，都含有motif 1、motif 9和motif 10，BrNHX06和BrNHX09结构域相似，都含有motif 1、motif 2和motif 9，说明这些结构域相似的基因成员在功能上与其他基因一样或协同控制基因表达。
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| 图 4 大白菜NHX基因家族氨基酸保守结构域分析 Fig. 4 Analysis of conserved domain of NHX gene family in Chinese cabbage. |
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| Alt. name | E-value | Motifs | Site count | Width |
Motif 1  |
1.90E-205 | YMLAELFSLSGILTVFFCGIVMSHYTWHN | 9 | 29 |
Motif 2  |
1.40E-201 | VFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAIGTLISTTVI | 7 | 50 |
Motif 3  |
2.30E-189 | DYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVLFNA | 5 | 50 |
Motif 4  |
8.80E-168 | IDFKMQVVIWWAGLMRGAVSMALAYNKFTRSGHTDLRGNAIMITSTITVC | 5 | 50 |
Motif 5  |
1.40E-149 | NLFVALLCACIVJGHLLEENRWMNESITALLIGLATGVVILLISNGKSSH | 5 | 50 |
Motif 6  |
8.70E-083 | TTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDSPGTS | 5 | 41 |
Motif 7  |
5.90E-084 | NHNVPRPDSJRGFLTRPTRTVHHYWRQFDDAFMRPVFGGRGFVPFVPGSP | 4 | 50 |
Motif 8  |
1.50E-032 | STLLGVATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLS | 5 | 40 |
Motif 9  |
3.60E-026 | GLLLLGRAAFVFPLSFLSNLSKTNPSEK | 9 | 28 |
Motif 10  |
9.40E-017 | QISPAIHDPQGQEKQQQAAGVGILLQIMMLVLSFVLGHVLRRHKFYYLPE | 2 | 50 |
为进一步了解大白菜NHX基因与其他物种的进化关系，本研究利用MEGA-X软件对拟南芥NHX基因和大白菜NHX基因构建系统发育树，如图 4所示，基因家族可以被分为3个大亚族Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ，亚族Class Ⅰ中有BrNHX04和BrNHX08两个大白菜NHX基因，其中BrNHX04和AtNHX04亲缘关系较近，BrNHX08与AtNHX07亲缘关系较近。
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| 图 5 大白菜(●)与拟南芥(○) NHX基因的系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of NHX gene in Chinese cabbage (●) and Arabidopsis (○). |
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亚族Class Ⅱ中有BrNHX01、BrNHX02、BrNHX03、BrNHX07和BrNHX09五个大白菜NHX基因，且BrNHX01和BrNHX07基因相似度较高，大白菜BrNHX02与AtNHX04亲缘关系较近，BrNHX09与AtNHX03亲缘关系较近，BrNHX03与AtNHX02亲缘关系较近。Class Ⅲ亚族中有BrNHX05和BrNHX06两个大白菜NHX基因，其中BrNHX05和BrNHX06的基因进化长度与其他基因存在一定差异。总的来说，各亚族内的基因间同源性较高，各亚族内基因进化方向大致相似，进化过程大致稳定。
2.8 大白菜NHX基因家族表达模式分析大白菜NHX基因家族成员不同胁迫处理下的时间表达模式如图 6所示，从图中可以看出，在高温、低温、干旱以及盐4种胁迫下，BrNHX01、BrNHX02、BrNHX03、BrNHX05、BrNHX06、BrNHX09基因的表达量均显著上调。BrNHX08基因除在高温72 h时显著上调，在其他各逆境胁迫下表达量均下调。其中在盐胁迫处理12 h时，BrNHX02基因表达量显著上调；干旱处理6 h时，BrNHX09基因表达量显著上调；在低温胁迫处理72 h时BrNHX02和BrNHX09基因表达量显著上调。在高温胁迫72 h时，BrNHX01、BrNHX02和BrNHX09表达量均显著上调。说明BrNHXs基因家族成员对高温、低温、干旱、盐等非生物逆境有不同程度地响应，且响应时间有差异。
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| 图 6 大白菜NHX基因成员在不同胁迫下的时间表达模式 Fig. 6 Time expression mode of NHX genes in Chinese cabbage under different abiotic stresses. A: Heat. B: Cold. C: Drought. D: NaCl. |
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为了寻找大白菜NHX基因家族的成员并探究其对不同非生物胁迫(高温、低温、干旱和盐)的响应模式，本研究采用生物信息学方法对大白菜NHX基因家族进行分析鉴定。在对比筛选其特有结构域后得到9个NHX基因家族成员，它们在染色体上所处的位置不同，可以将9个NHX基因成员分别命名为NHX01–NHX09，在理化性质、基因结构等方面存在有一定的差异。植物的NHX基因家族亚细胞定位主要分为2类，一类位于液泡膜，另一类位于内膜系统上。在拟南芥AtNHX01‒AtNHX04定位在液泡膜上，而AtNHX05和AtNHX06具有功能冗余，它们都定
位在高尔基体(Golgi apparatus, GA)、高尔基反面网状结构(trans Golgi network, TGN)、内质网(endoplasmic reticulum, ER)和液泡前体(prevacuolar compartments, PVCs)，参与调控耐盐胁迫、pH平衡和K+平衡等[22]。本研究对拟南芥、大白菜NHX的系统发育树进化分析表明，大白菜BrNHX02与AtNHX04亲缘关系较近，BrNHX09与AtNHX03亲缘关系较近。拟南芥转基因株系中AtNHX04的过度表达比野生型植物具有更高的耐盐性[23]。并且在之前研究中证明了甜菜(Beta vulgaris L.)中AtNHX03的过度表达能使转基因植物增强对高盐度的抵抗力[24]。故可以推测大白菜BrNHX02和BrNHX09基因通过调解K+/H+交换来负责耐盐性。
在鉴定NHX基因家族成员的过程中，结合蛋白序列多序列比对，发现大白菜NHX基因成员与拟南芥NHX基因成员有很大的同源性，在进化过程中其亲缘关系也保持稳定。前人也对NHX基因家族做了大量研究，在葡萄、杜梨、茄子(Solanum melongena L.)[25]、小麦(Triticum aestivum L.)[26]中都有相关的报道。结合前人研究成果来看，葡萄中NHX家族成员差异较大，不仅在盐胁迫中有所表达，还在调控种子成熟，花卉颜色等方面起到一定作用。另外发现，利用小麦中的NHX基因成员通过农杆菌介导法导入到茄子中，显著提高了茄子的耐盐性，与未经过转化的茄子相比，转基因茄子的相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸、光合速率和蒸腾效率等生理指标也比较稳定。以上结果表明植物钠氢反向转运蛋白不仅能响应盐胁迫，还参与了植物不同的生理途径。王彦芹[27]发现KcNHX01基因具有广谱抗逆性功能。从荒漠植物花花柴[Karelinia caspia (Pall.) Less.]中克隆了液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(KcNHX01)，并对其蛋白质结构进行了分析，结果显示转基因植株对干旱、高盐及高温的耐受性都强于野生型。在高温条件下KcNHX01的超量表达增强了转基因植株过氧化物酶(peroxidase, POD)的酶活、增加了可溶性糖的积累、降低了丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量，能增加花器官中IAA的含量。同时在高温条件下，转基因植株叶片的气孔开度明显增加，而且与K+和Ca2+相关的转运体及离子通道蛋白基因的表达也明显上调，说明KcNHX01基因具有耐高温、耐旱、耐盐的功能。为了研究液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因TaNHX02在棉花(Gossypium spp.)耐盐耐旱中的作用，以晋棉7号为受体，利用农杆菌介导法将克隆自小麦的TaNHX02基因转入棉花愈伤组织，通过组织培养胚状体发生途径获得转基因再生植株，提高转基因棉花的耐盐抗旱能力[28]。周梦岩等[29]以耐盐植物互花米草(Spartina alterniflora Loisel)为材料，采用PCR技术克隆NHX2基因，并将其转入拟南芥鉴定出SaNHX02基因可能在盐胁迫调节机制中发挥调控作用，可作为改良农作物耐盐的重要候选基因。
本研究表明大白菜9个NHX基因的表达在叶片中均受到高温、低温、干旱、盐等非生物胁迫的诱导。高温(32 ℃/20 ℃)胁迫下BrNHX01–BrNHX09基因在12 h时均显著上调，说明高温可以促进基因的表达并且表达较快。在高温(32 ℃/20 ℃)和低温(10 ℃/5 ℃)处理下，BrNHX02和BrNHX09基因在0‒24 h下表达量逐渐升高，在48 h处理下骤然下降后在72 h表达量达到最高值，而干旱胁迫下则无明显变化。出现此类情况可能是因为48 h无光高温(20 ℃)样品的相对表达量比48 h无光低温(5 ℃)样品相对表达量低，所以低温无光照可能抑制基因的表达。在盐胁迫(2% NaCl)处理下，BrNHX02在12 h表达量达到峰值，BrNHX09在6 h时表达量达到峰值，由此推测BrNHX02和BrNHX09对盐胁迫表达最显著，响应较快。
由此可以看出，大白菜NHX基因家族成员可以不同程度地响应植物的高温、低温、干旱和盐等非生物胁迫，且以BrNHX02和BrNHX09对这4种胁迫的响应最为显著，表达量在处理72 h时均显著上调，今后可以通过遗传转化的方法进一步验证大白菜NHX02和NHX09基因的具体功能。
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