2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 朱兆成, 夏爱鸿, 曹兆立, 李昕, 陈祥, 徐正中, 焦新安
- ZHU Zhaocheng, XIA Aihong, CAO Zhaoli, LI Xin, CHEN Xiang, XU Zhengzhong, JIAO Xin՚an
- 一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法
- Development of a flow cytometry method for detection of bovine multi-cytokines
- 生物工程学报, 2023, 39(1): 347-358
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(1): 347-358
- 10.13345/j.cjb.220263
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文章历史
- Received: April 6, 2022
- Accepted: June 22, 2022
- Published: June 24, 2022
引用本文
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2. 扬州大学 农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室, 江苏 扬州 225009
2. Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China
我国为奶牛养殖大国，据统计，2020年全国奶牛存栏数达到615万头。但是，近年来人兽共患胞内菌(如牛分枝杆菌、牛布鲁菌等)严重危害我国奶牛养殖业的健康发展和食品安全，其感染具有病程长、临床表现复杂和全身系统受累等特点[1-2]。目前，在牛疫病防控中，主要通过抗体水平测定来评价疫苗注射后的免疫水平以及疫病的检疫诊断。长期以来，牛细胞免疫检测试剂和技术的匮乏，以及基于牛细胞免疫防控技术及产品的短缺，严重制约了我国牛养殖业中人兽共患胞内细菌病的防控成效。
胞内菌感染后主要诱导机体产生Th1型细胞免疫应答，而细胞因子作为细胞免疫状态的重要指标，其免疫学检测显得尤为重要。目前细胞因子的免疫学检测方法被广泛地应用于基础研究和临床医学、疫苗免疫效果评估、疾病诊断和过敏反应研究等，针对牛细胞因子的检测方法主要是酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、酶联免疫斑点实验(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT)法等，其中ELISA方法是群体水平的检测，只能检测单种细胞因子，对多细胞因子进行同时检测需要大量液体样本[3]；ELISPOT方法是单细胞水平检测，但是不能区分不同T淋巴细胞亚群应答水平[4]；而流式细胞术(flow cytometry, FCM)可以对牛细胞因子进行多因子、高通量及不同细胞亚群的精准分析。目前一些报道通过建立基于牛IL-2[5]、IFN-γ[6]的单细胞因子FCM检测技术，并结合特异性诊断抗原ESAT-6、CFP-10等进行牛结核等疫病的诊断。但是与人和小鼠相比，商品化牛细胞因子抗体种类较少，而且进行多因子分析时需要不同荧光染料搭配，因此基于流式细胞术的牛多色细胞因子检测技术的发展受到了极大地限制。
针对以上现状，本研究基于前期实验室制备的牛IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10和MCP-1共5种细胞因子单抗[7-11]，基于胞内染色技术建立了牛多色细胞因子FCM检测方法，与传统ELISA、ELISPOT等牛细胞因子检测技术相比，该方法能够从单细胞水平，多因子、高通量检测胞内细胞因子表达情况，并且对特定T细胞类群的应答水平进行精准分析，为牛疫苗免疫效果评价和疫病诊断提供了一种有效手段。
1 材料与方法 1.1 试验材料鼠抗牛IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10、MCP-1单抗由本实验室制备保存；鼠抗牛CD4、CD8分子单抗，Bio-Rad公司；BCG疫苗株和S19疫苗株均由本实验室保存；ESAT-6/CFP-10蛋白由本实验室制备；Concanavalin A from canavalia ensiformis (ConA)，Sigma公司；Fixation Buffer、Intracellular staining Permeabilization Wash Buffer (10×)和Brefeldin A，Biolegend公司；BOVIGAM® Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for Cattle，Invitrogen公司；rProtein A Sepharose亲和层析柱，GE公司；Alexa Fluor® 568、Alexa Fluor® 647、Alexa Fluor® 680、FITC、PE荧光抗体标记试剂盒，Invitrogen公司；牛IFN-γ ELISPOT试剂盒，Mabtech公司。
1.2 单抗荧光标记和鉴定前期研究通过鉴定筛选出效价高、与天然抗原亲和力好的牛IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10、MCP-1单克隆抗体各1株，将单抗腹水使用rProtein A Sepharose亲和层析柱纯化后，再采用荧光标记试剂盒对上述牛细胞因子单抗进行荧光标记(表 1)，具体方法参照说明书。
| Cytokines | Number | Fluorochrome |
| IFN-γ | 2G5 | PE |
| IL-2 | 6D7 | Alexa Fluor® 647 |
| IP-10 | 2D5 | FITC |
| MCP-1 | 4G9 | Alexa Fluor® 680 |
| TNF-α | 3C1 | Alexa Fluor® 568 |
无菌采集健康牛尾静脉血，使用淋巴细胞分离管制备牛外周血单核细胞，活细胞计数后备用；将牛外周血单核细胞铺入24孔板中，1×106细胞/mL，1 mL/孔；设置实验组和对照组，在实验组的孔中加入非特异性刺激剂ConA，10 µg/mL；置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育，4 h后加入阻断剂BFA，继续孵育培养16−24 h；使用APC-Cy7标记鼠抗牛CD4分子和/或FITC标记鼠抗牛CD8分子单抗避光染色20 min；加入固定剂后，以破膜剂为稀释液，同时加入荧光标记牛IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10、MCP-1单抗进行胞内染色，1 µg/mL；洗涤后使用流式细胞仪(LSRFortessa, BD公司)进行检测。
1.4 牛分枝杆菌BCG体外感染牛外周血单个核细胞诱导细胞因子表达规律测定制备牛外周血单核细胞，将牛外周血单核细胞铺入24孔板中，1×106细胞/mL，1 mL/孔。分别设定实验组和对照组(每个样品设定3个重复孔)，实验组以MOI 10剂量加入牛分枝杆菌BCG感染牛外周血单核细胞，于37 ℃、5% CO2培养箱感染不同时间(0、12、24、36和48 h)，参照上述1.3方法检测BCG体外感染牛细胞因子表达规律。
1.5 牛细胞因子流式检测方法与ELISPOT方法的比较选取10头健康奶牛，采集尾静脉血，制备牛外周血单核细胞，将牛外周血单核细胞铺入24孔板中，1×106细胞/mL，1 mL/孔；参照上述1.3方法，进行刺激培养，使用APC-Cy7标记鼠抗牛CD4分子单抗避光染色20 min；加入固定剂后，以破膜剂为稀释液，并使用荧光标记牛IFN-γ单抗进行胞内染色，对CD4+ T细胞进行圈门分析IFN-γ阳性细胞(设定5 000个细胞)，洗涤后上机进行检测。同时使用牛IFN-γ捕获抗体包被96孔滤膜板，4 ℃无菌过夜包被；使用含10%胎牛血清的完全1640培养基进行孵育封闭2 h；弃封闭液后，96孔滤膜板中加入刺激剂ConA，10 µg/mL，并设立对照组；每孔加入牛外周血单个核细胞悬液，2.5×105细胞/孔，37 ℃孵育48 h；洗板5次，加入稀释的牛IFN-γ检测抗体，37 ℃孵育1 h；洗板3次，加入1:1 000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，37 ℃孵育1 h；每孔加入100 μL底物液BCIP/NBT，放置于室温避光显色，终止反应后使用ELISPOT仪进行扫描计数和分析。
1.6 结核阳性牛外周血CD4+ T细胞的细胞因子表达水平分析从某牛场分别选取6头结核阳性牛和9头结核阴性牛(使用皮试变态反应试验、商品化BOVIGAM®牛结核γ-干扰素ELISA检测试剂盒进行了同步检测)，采集尾静脉血，制备牛外周血单核细胞，将牛外周血单核细胞铺入24孔板中，1×106细胞/mL，1 mL/孔。以结核分枝杆菌特异性重组蛋白ESAT-6/CFP-10为刺激原，20 μg/孔，以未刺激组为对照，参照上述1.3方法检测结核阳性牛细胞因子表达水平。
1.7 统计学分析采用GraphPad Prism 5.0软件处理并绘制线型图。2组间比较采用双侧t检验；2组以上数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，并用Tukey’s多重比较检验进行两两比较。P值小于0.05被认为差异具有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 牛多细胞因子流式检测方法的建立本研究采取了2种检测方案，方案一的检测流程及结果如图 1所示，首先圈定牛外周血单个核细胞中的淋巴细胞群，然后圈取非粘连细胞单细胞，之后圈取CD4+ T细胞，最后对IFN-γ、IL-2、IP-10、MCP-1和TNF-α这5种细胞因子进行检测分析。5种细胞因子的单抗组合后均能够有效区分刺激组和非刺激组，其刺激组检测值-未刺激组检测值分别为4.810%、3.801%、0.153%、0.860%和5.060%，具有良好的检测效果。方案二的检测流程及结果如图 2所示，在本方案中首先圈定牛外周血单个核细胞中淋巴细胞群，再去除粘连细胞，之后再圈出CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，最后对IFN-γ、IL-2和TNF-α分别检测分析，从图中可看出效果良好。其中，CD4+ T细胞中IFN-γ、IL-2和TNF-α刺激组-未刺激组的差值分别为2.94%、4.521%和5.438%，CD8+ T细胞中IFN-γ、IL-2和TNF-α刺激组-未刺激组的差值分别为3.540%、0.300%和4.054%，可明显区分刺激组和未刺激组。
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| 图 1 CD4+ T细胞IFN-γ、IL-2、IP-10、MCP-1和TNF-α的检测结果 Fig. 1 Detection of IFN-γ, IL-2, IP-10, MCP-1 and TNF-α in CD4+ T cells. |
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| 图 2 CD4+和CD8+ T细胞IFN-γ、IL-2和TNF-α的检测结果 Fig. 2 Detection of IFN-γ, IL-2 and TNF-α in CD4+ T cells and CD8+ T cells. |
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如图 3所示，BCG疫苗株、S19疫苗株感染牛外周血单个核淋巴细胞后，细胞因子的表达水平及规律大致相似，与BCG组相比有显著性差异(*：P < 0.05；**：P < 0.01)。BCG疫苗株诱导IP-10水平更高，S19疫苗株诱导MCP-1水平更高。在S19疫苗株感染后，IFN-γ、IL-2和TNF-α的表达规律大致相同，在感染40 h后持续上升；MCP-1值呈现一种平缓上升的趋势；IP-10的变化趋势与对照组相比，在12 h时基本未变，24 h时急剧下降，48 h时又恢复到与对照组相当的水平。由于篇幅限制，图 3中只显示部分结果。
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| 图 3 [A5] BCG和S19体外感染PBMC细胞因子表达规律 Fig. 3 Expression of cytokines in PBMC infected by BCG and S19 in vitro. A: Scatter plots of cytokines in PBMC infected by BCG and S19 in vitro after 12 h. B: Statistically significant differences between the BCG and PBS, S19 and PBS groups are indicated by the asterisks. *: P < 0.05; **: P < 0.01. |
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本研究选择10头健康奶牛制备外周血单核细胞，使用ConA刺激细胞因子分泌，以PBS组为对照，分别采用建立的流式检测方法和ELISPOT方法进行检测，对于两者的检出的阳性细胞占PBMC细胞总数的比例进行比较分析。结果如图 4所示，在10份样品中，流式细胞检测方法阳性细胞占细胞总数的比例(刺激组和对照组的检测比例差值)均在0.5%以上，而ELISPOT方法的检测比例差值均低于0.5%，这表明流式检测方法具有更高的检测灵敏度。由于篇幅限制，图 4中只显示部分实验结果。
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| 图 4 牛细胞因子流式检测方法和ELISPOT方法的结果比较 Fig. 4 Comparison of flow cytometry method and ELISPOT method for detecting bovine cytokines. A: Results of all 10 cattles. B: FCM results of one cattle. C: ELISPOT results of one cattle. |
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使用上述建立的牛多细胞因子流式检测方法，对6头已知结核阳性牛和9头已知结核阴性牛进行检测，以结核分枝杆菌特异性重组蛋白ESAT-6/CFP-10为刺激原，通过测定CD4+ T细胞的IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌表达水平进行检测。结果如图 5所示，结核阳性牛IFN-γ、IL-2和TNF-α细胞因子的检测值普遍高于阴性样品，具有较强的区分度。另外，如表 2、表 3和表 4所示，TNF-α分别与IFN-γ、IL-2之间均呈现出显著性(P < 0.01)，并且相关系数值均高于0.7，说明TNF-α分别与IFN-γ、IL-2之间均有着非常紧密的正向相关关系。IFN-γ与IL-2之间也呈现出显著性(P < 0.05)，相关系数值是0.596，这表明IFN-γ、IL-2和TNF-α的联合流式细胞术检测对于牛结核病具有很高的诊断潜力。由于篇幅限制，图 5中只显示部分实验结果。
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| 图 5 结核阳性/阴性牛CD4+ T细胞的细胞因子表达水平 Fig. 5 Expression level of cytokines in CD4+ T cells in tuberculosis positive/negative cattle. A: Results of all 15 tuberculosis positive/negative cattles. B: Scatter plots of one tuberculosis positive bovine and one tuberculosis negative bovine. |
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| TNF-α | IL-2 | ||
| TNF-α | Pearson correlation | 1 | 0.704** |
| Sig. (2-tailed) | − | 0.003 | |
| N | 15 | 15 | |
| IL-2 | Pearson correlation | 0.704** | 1 |
| Sig. (2-tailed) | 0.003 | − | |
| N | 15 | 15 | |
| **: P < 0.01. | |||
| IFN-γ | IL-2 | ||
| IFN-γ | Pearson correlation | 1 | 0.596* |
| Sig. (2-tailed) | − | 0.019 | |
| N | 15 | 15 | |
| IL-2 | Pearson correlation | 0.596* | 1 |
| Sig. (2-tailed) | 0.019 | − | |
| N | 15 | 15 | |
| *: P < 0.05. | |||
| IFN-γ | TNF-α | ||
| IFN-γ | Pearson correlation | 1 | 0.765** |
| Sig. (2-tailed) | − | 0.001 | |
| N | 15 | 15 | |
| TNF-α | Pearson correlation | 0.765** | 1 |
| Sig. (2-tailed) | 0.001 | − | |
| N | 15 | 15 | |
| **: P < 0.01. | |||
IFN-γ主要是由活化的CD4+ Th1细胞、CD8+ T细胞及NK细胞等产生的细胞因子，具有广泛抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，而牛IFN-γ是牛结核病细胞免疫诊断方法的重要标识[12]；IL-2主要是由T淋巴细胞分泌的一种淋巴因子，在T细胞增殖、NK细胞的活化等方面起重要作用，而牛IL-2与牛白血病病毒感染相关[13]，并被认为具有作为牛结核诊断标识的潜力[14]；TNF-α是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞产生，牛疱疹病毒感染[15]以及牛乳腺炎[16]、牛传染性胸膜肺炎[17]中TNF-α均表达上调；IP-10是单核细胞经细胞因子刺激后分泌的趋化因子，可选择性地募集T淋巴细胞、自然杀伤细胞和单核细胞到损伤部位，发挥宿主免疫防护作用，有研究显示IP-10和IFN-γ释放之间存在很强相关性[18]，在牛分枝杆菌感染29 d后，牛PBMC中的抗原特异性IP-10 mRNA水平与IFN-γ mRNA水平高度相关[19]，两者的平行测量能增强对牛分枝杆菌感染的牛和水牛的检测的潜力；MCP-1主要趋化单核细胞，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集，从而在机体防御、慢性炎症及抗肿瘤等方面起重要作用。
目前一些商品化荧光标记牛细胞因子单抗，但是无法进行荧光染料的搭配，限制了牛多色流式细胞术的发展。本研究通过对牛细胞因子抗体的筛选、染色、组合，建立了一套能够同时检测多种牛细胞因子的检测方法。其中，A方案中主要是检测CD4细胞中IFN-γ、IL-2、IP-10、MCP-1和TNF-α的含量，适用于高通量多种细胞因子检测，有效地节约了时间，提高了效率。此前也有研究人员利用微球偶联带有荧光染料抗体[20]，检测细胞培养上清液中的多种牛细胞因子，与本研究相比，其只可检测分泌到细胞外的细胞因子，具有一定的局限性。B方案中是分别检测CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的IFN-γ、IL-2和TNF-α细胞因子含量，该方案在检测细胞因子的同时还检测出分泌细胞的亚型，有助于牛疫病诊断的研究。Whelan等采用了类似的方法探究了犊牛在感染牛分枝杆菌后，CD4+ T细胞中IL-2的变化与关系[21]。本研究初步探究了BCG疫苗株、S19疫苗株感染牛外周血单个核淋巴细胞后，细胞因子的表达水平及其规律，然而体外检测只能表现出牛淋巴细胞的细胞因子表达状况，无法表现疫苗接种后体内复杂系统的细胞因子表达状况，这对于疾病研究的意义有限，还需要进一步进行实验研究。已有研究发现接种BCG的犊牛在感染牛分枝杆菌后，与未接种牛相比，其细胞内产生了更为强烈的IFN-γ+、TNF-α+、IL-2+反应和较低的IFN-γ+、TNF-α+反应，研究者认为IFN-γ+、TNF-α+细胞是由牛分枝杆菌感染而产生的应答，而IFN-γ+、TNF-α+、IL-2+细胞则是BCG接种后对于机体的保护性反应[22]。此外，还对IFN-γ、IL-2和TNF-α这3种细胞因子的在牛结核病中的相关性进行分析，结果表明这3种细胞因子之间有着紧密的正向相关关系。此外，干扰素蛋白的网络分析表明，免疫相关蛋白(白细胞介素、组织坏死因子)和干扰素受体之间存在很强的关联[23]。在人结核病检测中[24-25]，IFN-γ、IL-2和TNF-α具有作为结核感染生物学标志的潜在价值，结合本研究结果表明IFN-γ、IL-2和TNF-α的联合流式检测在牛结核病的诊断中也具有很高的应用潜力。
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