2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 章瑶, 穆德添, 周宇, 陆英, 柳亦松, 左梦婷, 董壮, 刘兆颖, 唐其
- ZHANG Yao, MU Detian, ZHOU Yu, LU Ying, LIU Yisong, ZUO Mengting, DONG Zhuang, LIU Zhaoying, TANG Qi
- 钩吻看家基因筛选及生物碱合成相关酶基因的表达分析
- Screening of housekeeping genes in Gelsemium elegans and expression patterns of genes involved in its alkaloid biosynthesis
- 生物工程学报, 2023, 39(1): 286-303
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(1): 286-303
- 10.13345/j.cjb.220345
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文章历史
- Received: April 29, 2022
- Accepted: July 6, 2022
- Published: July 8, 2022
引用本文
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2. 湖南农业大学动物医学院, 湖南 长沙 410128;
3. 湖南农业大学国家中药材生产(湖南)技术中心, 湖南 长沙 410128
2. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China;
3. National Technology Center of TCM Production (Hunan), Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China
钩吻(Gelsemium elegans Benth.)为马钱科(Loganiaceae)钩吻属(Gelsemium)的一种常绿木质藤本植物，在我国主要分布于湖南、广东、广西等南方地区[1]，是我国的一种传统药用植物。其始载于《神农本草经》，又名为断肠草、胡蔓藤和大茶药等，全株剧毒，主祛风攻毒、散结消肿之效，其活性成分为生物碱、环烯醚萜类和黄酮类等成分[2-3]，可外敷治疗皮炎、湿疹，在临床上能抑制多种癌细胞的生长增殖，还具有免疫调节、抗肿瘤、镇痛镇静和抗焦虑等作用[4-5]。钩吻作为一种剧毒植物，被猪、羊等畜类适量食用可以驱虫、增加食欲[6]，人若口服则极易引起中毒，但据研究表明，其治疗剂量与中毒剂量相近[5]，因此也受到国内外的广泛关注，具有重要的研究价值。目前，对钩吻的研究主要集中于化学成分的提取与鉴定[7-8]、药理及毒理机制[9-10]等方向，而对于钩吻生物碱的生物合成途径相关研究甚少，因此，阐明钩吻生物碱生物合成分子机制的研究，解析合成途径中关键酶基因的调控机制，将为钩吻的开发与利用奠定基础。
实时荧光定量PCR技术(quantitative real- time PCR, qRT-PCR)能通过荧光信号的累积实时监测到DNA扩增反应的产物总量并进行定量分析[11-12]，是研究和分析基因相对表达水平的重要技术之一，因其具有灵敏度高、可重复性强、特异性好且易于操作等特点，在内参基因筛选的研究中，具有重要作用[13]。但由于该技术的结果准确性和稳定性还受引物特异性等诸多因素影响，需引入内参基因对qRT-PCR所得数据进行均一化处理[14]。通常看家基因表达稳定，不易受环境影响，常被用作qRT-PCR分析的内参基因。植物中常见的看家基因有18S核糖RNA (18S)、肌动蛋白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、α微管蛋白基因(TUA)、延伸因子基因(EF1-α)、SAND家族蛋白基因(SAND)和细胞分裂控制蛋白基因(cdc25)等。在诸多研究中发现，不同植物间看家基因的表达稳定性也不同。如Wang等[15]研究发现PPA2是何首乌不同组织中最佳的看家基因；Teng等[16]研究发现CYP和GAPDH是大花红景天用于qRT-PCR的最适看家基因；Yang等[17]通过实验发现ACT7和PP2A是铁十字秋海棠斑叶在不同时期表达稳定性最优的看家基因。目前，仍没有对于钩吻内参基因的筛选研究。因此，筛选出钩吻qRT-PCR分析中最佳的内参基因对后续的基因表达及分析具有重要意义。
研究发现，从钩吻植株中分离出来的毒性成分为钩吻生物碱，属于萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids, TIAs)[18]，其中含量最高的成分是钩吻素子(koumine)[19]，毒性最强的为钩吻素己(gelsenicine)[20]。钩吻碱作为钩吻的主要活性成分，应用前景非常广泛，阐明其生物合成途径，了解途径上的相关酶基因，有利于通过合成生物学等手段，提高钩吻碱的产量，拓宽钩吻的应用市场。吲哚类生物碱的合成主要涉及环烯醚萜途径和色胺途径。来自甲基-d-赤藓醇-4-磷酸途径(MEP pathway)的前体异戊烯二磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)和二甲烯丙基二磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)[21-22]，在香叶基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase, GPPS)、香叶醇合酶(geraniol synthase, GES)的催化下分别生成香叶基二磷酸酯(geranyl diphosphate)[23]和香叶醇(geraniol)[24]，接着通过环烯醚萜途径(iridoid pathway)参与氧化、还原等反应，生成马钱子酸(loganic acid)[25-26]，再经由番木鳖酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase, LAMT)及裂环马钱子苷合成酶(secologanin synthase, SLS)的共同催化得到断马钱子苷(secologanin)[27-28]；分支酸(chorismate)在色胺途径(tryptamine pathway)中多种酶的催化下，能得到色胺(tryptamine)[29]。至此，通过异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase, STR)催化，断马钱子苷和色胺缩合形成胡豆苷(strictosidine)[30]。最后，异胡豆苷通过异胡豆苷β-d-葡萄糖苷酶(strictosidine-β-d-glucosidase, SGD)脱糖[31]，再经过细胞色素P450酶(cytochromeP450, CYP450)和N-甲基转移酶(N-methyltransferase, NMT)催化，最终生成钩吻中剧毒成分——钩吻素己，其生物合成途径及涉及的相关基因见图 1。
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| 图 1 钩吻素己生物合成途径 Fig. 1 The biosynthesis pathway of gelsenicine in Gelsemium elegans. |
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基于本课题组前期已完成的基因组测序[32]，发现了大量钩吻TIAs生物合成途径上的相关酶基因，并基于基因组和转录组数据筛选出了钩吻10个候选看家基因，通过使用GeNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT (ΔCT)和RefFinder分析候选看家基因在钩吻不同部位的表达稳定性。然后利用筛选出的最佳看家基因对参与钩吻素己生物合成上游途径相关酶基因的表达模式进行分析，以进一步验证该看家基因的准确性，并为后续研究钩吻生物碱合成关键酶基因的功能验证奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料本研究所用钩吻G. elegans采自广西壮族自治区柳州市柳城县龙头镇新村，剪取钩吻4个不同部位(根皮、茎段、叶片、花序)植物材料。剪取后，经简单清理后迅速切片，置于液氮中速冻，−80 ℃以下冰箱保存备用。
研究中所用仪器主要有Agilent 6530 LC-MS系统(Agilent Technologies, Palo Alto)、qTower3G实时荧光定量PCR仪，Analytik Jena公司。
1.2 方法 1.2.1 钩吻生物碱基于LC-MS技术的相对含量分析将新鲜钩吻样品用液氮充分研磨后，置于LGJ-10C冷冻干燥机(四环福瑞科仪科技发展有限公司)内干燥，备用。称取钩吻粉末1 g，加入80%乙醇(体积分数) 25 mL，于60 ℃超声机中超声30 min，得滤液，滤渣再加入80%乙醇25 mL，再次超声30 min，合并2次滤液。待滤液散至无乙醇味后，取1 mL滤液，氮气吹干，加入200 μL洗脱液(A)和800 μL洗脱液(B)复溶，过0.22 μm滤膜，待分析。
使用Agilent 1290高效液相色谱串联时间飞行(6530)质谱仪(Agilent公司, LC-QqTOF/MS)检测样品，样品在Waters C18柱(3.5 μm, 4.6 mm× 150 mm)上分离。流动相为0.1%甲酸-乙腈，分析时间50 min，使用梯度洗脱程序：0−2 min，10%−10% (B)；2−7 min，10%-15% (B)；7− 30 min，15%−45% (B)；30−40 min；45%−90% (B)；40−43 min，90%−90% (B)；43.01−50 min，10%−10% (B)。流速为0.3 mL/min，柱温保持30 ℃，进样体积为5 μL。采用自动二级模式进行样品分析，(+) ESI；碎裂电压，30 V；毛细管电压，3 500 V；干气温度，300 ℃；鞘气温度，350 ℃；使用干燥气体(N2)作为雾化气体流量，9 L/min；鞘气流量，11 L/min；雾化器，35 psi；扫描范围：50−1 000 m/z。碰撞能量(CE)设置为30 V。
通过测定，得到不同部位的质谱响应峰高，对不同部位中钩吻素己的相对含量进行成分分析。
1.2.2 总RNA的提取和cDNA合成采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)对钩吻4个部位分别进行总RNA提取。利用超微量分光光度计(K5600，北京凯奥科技有限公司)检测总RNA样品的浓度、OD260/OD280值及OD260/OD230值，然后取RNA各2.5 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳仪检测，通过观察18S、28S条带亮度判断总RNA的完整性。4个部位均采用200 ng RNA进行cDNA第一链合成，按照PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒(TaKaRa, 大连)说明书的操作步骤进行，置于−20 ℃保存备用。
1.2.3 看家基因的筛选与引物合成基于课题组已有的钩吻转录组数据，筛选出10个候选的看家基因18S、GAPDH、Actin、TUA、TUB、SAND、EF-1α、UBC、UBQ和cdc25，另外，基于“基因组+转录组+代谢组”共表达分析，筛选出钩吻生物碱生物合成已知上游途径中的共18个相关基因，分别通过Primer Premier 5.0软件进行qRT-PCR引物的设计(表 1和表 2)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
| Gene name | Genes full name | Primer sequence (5′→3′) |
| GES | Geraniol synthase | F: GGCTGCGTTTCAGGTTGCT R: CTTTAGGTGGGCTTGGGTG |
| G8H/CYP76B6 | Geraniol 8-hydroxylase | F: AAGCCGAACAATCCCCACC R: TTTCCATCACGCCCCACA |
| 8-HGO/CYP76B10 | 8-hydroxygeraniol dehydrogenase | F: CTGTCTTCCCGCTGCTTGC R: CGTTCCATTGCCGTGTTGA |
| IS | (S)-8-oxocitronellyl enol synthase | F: CACGATTCGCCCTTCACC R: GCGTCCACAGCATCAGCA |
| 7-DLS/ CYP76A26 | 7-deoxyloganetic acid synthase | F: TGAGACAATGGCTGAGGTG R: TCTGAATACCAGGCGAGTT |
| 7-DLGT/UGT85A24 | 7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase | F: GCCTTTGGTCATTCCTCTG R: GATTTGTGGCTCCTCCTTG |
| 7-DLH/CYP72A224 | 7-deoxyloganate 7-hydroxylase | F: CGGTGCTTGTGAAGGTCGT R: CAATCCGCAGCAAATAGGT |
| LAMT | Loganate methyltransferase | F: CTGCTCCACAGGTCCCAATA R: GTGCCATCAACCCTCCGT |
| SLS/CYP72A1 | Secologanin synthase | F: GCCTCACATTGACAAAACC R: TGTAGCAAATAGCGAAAGC |
| AS | Anthranilate synthase | F: GGCGAATCCCGTTGTTGT R: TTGAGGCGTTCCAGGTCC |
| AnPRT | Anthranilate phosphoribosyltransferase | F: ACGGCAATCCTCCTTCCAA R: TTCGCCTGAGCATCCAACA |
| PRAI | Phosphoribosylanthranilate isomerase | F: GCCCCTAAACTCCCCGTCA R: CCCGAAAGAAGCACAAGAAGA |
| IGPS | Indole-3-glycerol phosphate synthase | F: TGGTCCCTTTGAGTTTCGG R: AGGCAACCCAGTTCGTGAG |
| TSA | Tryptophan synthase alpha chain | F: CAAGCGTGGTGTTGAAAAG R: GCTCTGGGAGTTGTGGGTG |
| TSB | Tryptophan synthase beta chain | F: TGGCGTCCAACTCCTCTA R: CGATACGGTTTCTGGTCAT |
| TDC | l-tryptophan decarboxylase | F: TGCGGGGAAATGCTTAGTG R: CATAGCGGGTGGAGGAGTC |
| STR | Strictosidine synthase | F: AAGGAAGAGGGCGTGGAA R: GCAACAGGCAATGCAGAA |
| SGD | Strictosidine-β-d-glucosidase | F: TATGGTTATGCGTCGGGTGT R: AAGGCTCTGTGCCAGGGTT |
| Gene name | Genes full name | Primer sequence | Slope (k) |
Amplification parameters (%) |
Correlation coefficience (R2) |
| 18S | 18S ribosomal RNA | F: GATGGAGTCCCGAAGTTGC R: TCCAGATCGCATGGCATAG |
−3.13 | 1.09 | 0.993 01 |
| GAPDH | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase |
F: AAGGGTGGTGCCAAGAAGG R: CAGTGGGAACACGGAAAGC |
−3.41 | 0.96 | 0.993 99 |
| Actin | Actin | F: GTTGCCCAGAAGTCCTATT R: TTCCTGTGGACGATTGATG |
−3.72 | 0.86 | 0.996 31 |
| TUA | α-tubulin | F: ATGAAGTTAGAACAGGGACA R: CAAGCAGGGAGTGAGTAGA |
−3.35 | 0.99 | 0.997 83 |
| TUB | β-tubulin | F: TGTCCGTAAAGAAGCCGAGAA R: CAGGGAAACGAAGGCAACA |
−3.56 | 0.91 | 0.999 24 |
| SAND | SAND family protein | F: CATCCGACCCACCTACCGT R: ACTCTGCCAACTCCGCTCC |
−3.17 | 1.07 | 0.995 90 |
| EF1-α | Elongation factor 1α | F: AAGCCACTCCGTCTCCCACT R: TCGGCAAACTTGACAGCAATA |
−3.59 | 0.90 | 0.996 35 |
| UBC | Ubiquitin C | F: CAAAGGTGGTGAGGAGGAT R: ACAGAGCAGCGACTGAATG |
−3.48 | 0.94 | 0.990 54 |
| UBQ | Polyubiquitin | F: CCCTGACTGGGAAGACAAT R: AGACGGAGGACGAGGTGAA |
−3.29 | 1.01 | 0.997 95 |
| cdc25 | Cell division cyclin 25 homolog C |
F: CAGGGATGACGAAAGGAGT R: CGCAATGGAAAACAAGAGT |
−3.47 | 0.94 | 0.990 78 |
将不同部位样品的cDNA模板原液等量混合，依次稀释4倍，设置5个浓度梯度，分别为模板原液的1、1/4、1/16、1/64和1/256，由于TUB、GAPDH基因的表达量高，该2个基因采用的浓度梯度，分别为模板原液的1、1/5、1/25、1/125和1/625。
qRT-PCR实验采用SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (AG11701)试剂盒，操作步骤按说明书进行，并使用qTower3G实时荧光定量PCR仪(Analytikjena公司)进行qRT-PCR反应，反应体系为20 μL：2×SYBR Green Pro Taq HS预混型10 μL (Vazyme)，cDNA 2 μL (共添加50 ng)，上、下游引物(浓度为10 μmol/L)各0.4 μL，RNase无菌水7.2 μL，配制过程在冰上完成。扩增反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，每个样品进行3次重复检测，反应结束后由软件生成熔解曲线，根据熔解曲线判断引物的扩增特异性。
通过qRT-PCR反应，获得每个看家基因在不同梯度下的Ct值，生成标准曲线，计算斜率(k)和线性相关系数(R2)，并利用公式E= (10−1/k−1)×100%计算看家基因的扩增效率。同时，整理经过qRT-PCR反应所得数据，收集10个候选看家基因的Ct值，并用2−ΔΔCt分析定量结果。
1.2.5 看家基因表达稳定性评价分别使用GeNorm[33]、Normfinder[34]、BestKeeper[35]和ΔCT[36]这4个程序以及RefFinder网站在线[37]评估10个候选看家基因在钩吻不同部位的表达稳定性。BestKeeper和ΔCT程序可直接采用Ct值进行计算分析，而使用GeNorm和Normfinder程序均需将所得Ct值先转化为Q值[38]再分析，Q值为该基因在不同样品中的Ct值分别与在所有样品中最小的Ct值之差。最后采用RefFinder在线网站(http://blooge.cn/RefFinder/)结合上述4个程序的分析结果进行综合评价，以筛选出最佳看家基因。根据筛选出的最佳看家基因，对钩吻生物碱生物合成已知的上游途径相关基因在钩吻不同部位进行表达模式分析，每个样品进行3次技术重复，并利用IBM SPSS Statistic 22软件进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 钩吻生物碱相对含量分析根据峰高的响应值进行钩吻素己相对含量的分析，可以得出该成分在4个部位的相对趋势(图 2)。结果显示，钩吻素己在钩吻根皮中含量较高，其次是花序和茎段，在叶片中含量最低。
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| 图 2 钩吻不同部位中钩吻素己的相对含量(n=3) Fig. 2 Relative content of gelsenicine in different parts of Gelsemium elegans (n=3). 1: Root bark; 2: Stem segments; 3: Leaves; 4: Inflorescences. |
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凝胶电泳的成像结果显示(图 3)，提取的总RNA均呈现清晰明亮的28S和18S条带，表明该总RNA的提取完整性较好。进一步使用超微量分光光度计检测发现，4个样品(根皮、茎段、叶片、花序)的总RNA浓度分别为32.6、94.4、105.8和188.9 ng/μL，所有样品的OD260/OD280在2.10−2.17之间，OD260/OD230在1.60−1.85范围内。上述结果表明，所有样品总RNA的完整性较好且纯度较高，可在后续实验中使用。
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| 图 3 钩吻不同部位总RNA琼脂糖凝胶电泳 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of total RNA gene from different tissues of Gelsemium elegans. 1: Root bark; 2: Stem segments; 3: Leaves; 4: Inflorescences. |
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以稀释为5个浓度梯度的cDNA为模板，采用qRT-PCR反应检验10个候选看家基因的引物特异性，根据下机数据分别获得各看家基因的标准曲线。结果显示(表 2)，10个看家基因的相关系数R2均大于0.99，引物的扩增效率均介于0.86%−1.09%之间，熔解曲线均为单一熔解峰(图 4)，且曲线平滑，没有引物二聚体的存在。上述结果表明，cDNA模板量与对应的Ct值呈现较好的线性关系，从低浓度至高浓度，对应Ct值均逐渐减小，符合表达规律；且各候选基因的引物特异性强，同一样品重复性好，可展开后续实验。
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| 图 4 10个候选看家基因的qRT-PCR引物的熔解曲线 Fig. 4 Melting curves of qRT-PCR primers for 10 candidate housekeeping genes. |
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对10个候选看家基因以不同部位的cDNA为模板进行qPCR实验，得到的Ct值可直接反映各候选基因在各部位的表达丰度，且Ct值越小，反映出的基因表达丰度越高。结果显示(图 5)，所有样品的Ct值均在16.65−25.18的区间内。其中，EF1-α的平均Ct值最小，所有Ct值处于16.65−18.11的范围内，说明候选基因EF1-α在各部位的表达丰度最高；SAND的平均Ct值最大，所有Ct值介于24.14−25.18之间，说明候选基因SAND在各部位的表达丰度最低。
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| 图 5 10个看家基因的Ct值分布箱线图 Fig. 5 Ct value distribution box-plot of 10 candidate housekeeping genes. |
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GeNorm程序在使用前，先将所得下机数据Ct值转化为Q值，得到相对表达量。该程序是通过候选看家基因的平均稳定指数M值的计算，评价各候选基因的稳定性，M值的默认稳定性界线为M=1.5，且越低于1.5，候选看家基因越稳定[39]，反之则越不稳定，由此可判断各候选基因在钩吻不同部位的表达稳定性。GeNorm软件分析结果显示(图 6)，在钩吻的4个部位中，10个候选看家基因的表达稳定性排序为Actin=UBC > UBQ > EF1-α > SAND > GAPDH > cdc25 > TUA > 18S > TUB。所有候选基因的M值均小于1.5，说明所有候选基因在4个不同部位中均表达稳定，其中Actin和UBC的稳定性最好，TUB的稳定性最差。因此，还需要通过GeNorm程序计算变异值(Vn/n+1)以便确定最佳的看家基因数目。当Vn/n+1 < 0.15时，最适看家基因数达n个，反之则需要n+1个。如图 7所示，V2/3的比值小于0.15，说明对于钩吻的不同部位，看家基因数目最佳为2个。
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| 图 6 10个候选看家基因的GeNorm稳定性分析 Fig. 6 GeNorm stability analysis of 10 candidate housekeeping genes. |
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| 图 7 GeNorm看家基因标准化因子配对变异值分析(Vn/n+1) Fig. 7 Standardization factor paired variation (Vn/n+1) of housekeeping genes according to GeNorm. |
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NormFinder程序同GeNorm程序分析相似，在使用前需将Ct值转化为Q值，再通过该程序计算得到10个候选看家基因的表达稳定值M，得到候选基因在不同部位的稳定性变化，且M值越小，基因表达稳定性越高。结果表明(图 8)，10个候选看家基因的稳定性依次是：EF1-α > Actin > UBQ > SAND > UBC > GAPDH > TUA > cdc25 > 18S > TUB。其中，EF1-α的M值最小，即稳定性最佳；TUB的M值最大，即稳定性最差。
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| 图 8 10个候选看家基因的NormFinder稳定性分析 Fig. 8 NormFinder stability analysis of 10 candidate housekeeping genes. |
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BestKeeper程序可直接输入候选看家基因的Ct值分析计算，筛选出表达稳定性好的候选基因。通过输入各候选基因在不同部位的CP (crossing point) (3次技术重复所得Ct值的几何平均数)，计算得出各候选基因的标准偏差(SD)和变异系数(CV)[40]，以此分析候选看家基因的表达稳定性。该程序默认SD=1为稳定性界线，SD越小，表明基因的表达越稳定，若SD > 1，则该基因表达稳定性较差；CV反映的是候选看家基因在不同部位中表达水平的变异程度，CV越小，变异程度越小[14]。结果显示(图 9)，SD值的大小排序为：GAPDH < SAND < EF1-α < 18S < cdc25 < Actin < TUA < UBC < UBQ < TUB，说明GAPDH的表达稳定性较好，TUB的表达稳定性差；而CV值最小的是SAND，其次依次是GAPDH、18S、EF1-α、cdc25、Actin、TUA、UBC、UBQ，而TUB的CV值最大，说明SAND在不同部位的表达水平变异程度最小，TUB的变异程度最大。综合BestKeeper程序计算的所有数据显示，在钩吻不同部位中表达最稳定的候选基因为GAPDH，然后依次是SAND和EF1-α。
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| 图 9 BestKeeper分析10个候选看家基因表达的稳定性 Fig. 9 Expression stability of 10 candidate housekeeping genes analyzed by BestKeeper. |
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评估候选看家基因的表达稳定性，可以通过计算各候选基因Ct值的平均标准偏差来分析。平均标准偏差越小，基因在不同部位的表达越稳定。ΔCT分析结果显示(图 10)，在钩吻的4个部位中，10个候选看家基因的稳定性依次为：EF1-α=Actin > UBQ > UBC=SAND > GAPDH > cdc25=TUA > 18S > TUB。表明EF1-α和Actin的平均标准偏差最小，这2个基因在4个部位的表达最稳定，而TUB的表达稳定性最差。
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| 图 10 10个候选看家基因的ΔCT稳定性分析 Fig. 10 ΔCT stability analysis of 10 candidate housekeeping genes. |
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RefFinder在线网站能够综合GeNorm、NormFinder、BestKeeper及ΔCT4个程序的稳定性评价结果进行评估，是基于对这4个程序的稳定性结果采取适当的权重分配，并通过计算几何平均数，得到基因表达稳定性的综合排名和指数[41]的一种方法。使用RefFinder网站，可以避免单个程序分析的片面性，对所有候选的看家基因进行全面地分析，且候选基因排名越靠前、指数越小，表达稳定性越好。RefFinder综合分析结果显示，10个候选看家基因的稳定性排序为EF1-α (1.86) > Actin (2.21) > UBC (3.56) > SAND (3.76) > GAPDH (3.83) > UBQ (3.95) > cdc25 (6.65) > 18S (7.35) > TUA (7.48) > TUB (10.00)。由此表明，EF1-α的表达稳定性最佳，TUB的表达稳定性最差。因此，EF1-α的表达水平及稳定性最佳，可以作为qRT-PCR实验下对于钩吻不同部位的理想看家基因。
2.6 钩吻生物碱上游途径相关酶基因表达分析通过“基因组+转录组+代谢组”共表达关联分析方法筛选出钩吻生物碱上游途径相关候选基因，该方法对于多基因或超基因家族候选序列的筛选具有很高的预见性，可以更加精准地对重点序列进行研究。以PRAI基因为例(图 11)，从基因组中共鉴定了9条PRAI候选基因序列，通过转录组、代谢组共表达分析，发现有4条序列与钩吻素己的含量聚为一类，分别为contig5.924、contig29.88、contig22.428以及contig9.18，其中挑选了contig5.924作为重点候选序列进行了qRT-PCR分析。以此类推，采用该模式对途径中其他17类基因进行了筛选，这样能有效缩小基因功能验证的范围、提高了筛选效率，这类筛选方法在本课题组前期研究罗汉果CYP450和糖基转移酶超基因家族中获得了较好的验证[42-44]。在钩吻不同部位中，以EF1-α为看家基因，对钩吻素己生物合成上游途径中的相关酶基因进行了表达模式分析。结果依次为色胺途径上的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase, AS, 图 12A)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(anthranilate phosphoribosyltransferase, AnPRT, 图 12B)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸转移酶(phosphoribosylanthranilate isomerase, PRAI, 图 12C)、吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase, IGPS, 图 12D)、色氨酸合成酶α链(tryptophan synthase alpha chain, TSA, 图 12E)、色氨酸合成酶β链(tryptophan synthase beta chain TSB, 图 12F)、色氨酸脱羧酶(l-tryptophan decarboxylase, TDC, 图 12G)；环烯醚萜途径中的香叶醇合酶(geraniol synthase, GES, 图 12H)、香叶醇8-羟化酶(geraniol 8-hydroxylase, G8H, 图 12I)、8-羟香叶醇脱氢酶(8-hydroxygeraniol dehydrogenase, 8-HGO, 图 12J)、环烯醚萜合酶[(S)-8-oxocitronellyl enol synthase, IS, 图 12K)]、7-去氧番木鳖酸合成酶(7-deoxyloganetic acid synthase, 7-DLS, 图 12L)、7-去氧番木鳖酸葡萄糖转移酶(7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase, 7-DLGT, 图 12M)、7-去氧番木鳖酸羟化酶(7-deoxyloganate 7-hydroxylase, 7-DLH, 图 12N)、番木鳖酸甲基转移酶(loganate methyltransferase, LAMT, 图 12O)、裂环马钱子苷合成酶(secologanin synthase, SLS, 图 12P)；还有吲哚生物碱途径上的异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase, STR, 图 12Q)及异胡豆苷β-d-葡萄糖苷酶(strictosidine-β-d-glucosidase, SGD, 图 12R)。
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| 图 11 磷酸核糖邻氨基苯甲酸转移酶(PRAI)基因筛选热图 Fig. 11 Screening of phosphoribosylanthranilate isomerase synthase (PRAI) gene heatmap. GelR: Root bark of G. elegans; GelS: Stem segments of G. elegans; GelL: Leaves of G. elegans; GelF: Inflorescences of G. elegans. |
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| 图 12 以EF-1α为看家基因时钩吻素己生物合成已知上游途径中相关基因表达模式分析 Fig. 12 Analysis of the expression pattern of related genes in the known upstream pathway of gelsenicine biosynthesis using EF-1α as a housekeeping gene (**: P < 0.01). A: AS. B: AnPRT. C: PRAI. D: IGPS. E: TSA. F: TSB. G: TDC. H: GES. I: G8H. J: 8-HGO. K: IS. L: 7-DLS. M: 7-DLGT. N: 7-DLH. O: LAMT. P: SLS. Q: STR. R: SGD. 1: Root bark; 2: Stem segments; 3: Leaves; 4: Inflorescences. |
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实验结果表明，这些基因大部分表达模式与全长转录组的表达模式一致，说明了全长转录组测序结果比较准确。其中AS、PRAI、TSB、GES、IS、7-DLGT及SLS基因的表达模式与钩吻素己含量变化趋势基本一致，在根皮和花序2个部位的表达量较高，在茎段和叶片中的表达量较低，尤其是AS、GES和IS在茎段的表达量极低；IGPS、TDC、7-DLS、7-DLH、LAMT、STR及SGD基因的表达模式相类似，均为在茎段和叶片中的表达量高，在根皮和花序中的表达量低，且7-DLH基因在钩吻根皮中不表达；AnPRT和8-HGO基因表达模式一致，均为茎段表达量最高，根皮和叶片次之，花序中表达量最低；TSA基因主要在根皮中表达，其次为叶片，在茎段和花序中表达量相差较小；G8H基因在花序中的表达量很高，在其他3个部位中微量表达甚至不表达。在钩吻次生代谢物的累积过程中，这些酶通过影响途径上各代谢产物的含量与合成，进一步直接影响到终产物的积累。
3 讨论与结论看家基因是一种在不同发育时期和不同环境下能够稳定表达的一种基因，通常都与细胞的基础活动相关，比如Actin基因与细胞结构相关，cdc25基因与细胞周期的调控相关等[45]。近年来，国内外很多学者基于qRT-PCR技术对不同植物的看家基因进行了研究，并发现在不同植物或同一植物不同组织部位、不同发育时期和其他非生物胁迫处理中，其看家基因的种类和表达水平具有差异性[39]，所以通常看家基因并不在所有植物中通用，需要进一步研究确定不同处理情况下的最佳看家基因。qRT-PCR技术作为表达模式分析的一种重要手段，筛选合适的看家基因对qRT-PCR技术实验结果进行校正是非常有必要的，能够提高结果的准确性和可靠性。例如，UBQ2和EF1-α基因不仅是茅苍术在正常条件下表达较稳定的基因，同时EF1-α基因也是茅苍术在干旱胁迫下稳定性最佳的看家基因[46]；Actin1基因是瓜儿豆在干旱胁迫条件下稳定表达的看家基因[47]；18S、ACT和TUA基因均可作为岗梅基因研究的理想看家基因[48]。
本研究共选取了为10个植物中较为普遍的候选看家基因18S、GAPDH、Actin、TUA、TUB、SAND、EF-1α、UBC、UBQ和cdc25，在GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCT 4个程序不同的算法评价下，结合RefFinder网站的综合分析，评估候选看家基因分别在钩吻4个不同部位(根皮、茎段、叶片和花序)中的表达稳定性。根据结果显示，5个软件分析所得结果基本一致，但仍存在差异性：在钩吻的不同部位中，经GeNorm分析得出，Actin和UBC的稳定性最好；经由NormFinder和ΔCT分析下，EF-1α是候选基因中表达水平最稳定的；通过BestKeeper分析，基因GAPDH的稳定性最佳，变异程度较小，仅次其后的SAND变异程度最小；而通过RefFinder网站综合其他4个程序的分析结果得到一个稳定性排名，发现EF-1α是在钩吻不同部位中最适的看家基因。综合5个程序的分析得出，更适合作为钩吻在不同部位qRT-PCR实验中的看家基因是EF-1α。
钩吻作为马钱子科的植物，其主要的活性成分钩吻生物碱作为一种吲哚类生物碱，在生物合成过程中与色胺途径和环烯醚萜途径两个已知途径相关。实验结果中，AS、TSB、TSA、GES、G8H、IS、7-DLGT及SLS基因在钩吻4个部位的表达水平同钩吻素己在不同部位的相对含量趋势基本一致，表明以上8个基因可能参与钩吻素己的生物合成。同时，经研究发现，8-HGO、7-DLS、7-DLGT以及7-DLH均在植物韧皮部表皮细胞内表达[25]，这与实验结果中基因均在茎段有较高的表达量一致；马钱子酸会从植物的韧皮部转移至叶面的表皮细胞[49]，实验结果显示，其中相关的SLS、LAMT、STR基因在茎段和叶片中有较高的表达量，这可能与茎段细胞富含韧皮部、叶面表皮细胞存在于叶片相关联；色胺途径中的酶均被定位于叶绿体中，这与相关的酶基因在钩吻叶片中均有表达的实验结果一致，包括AS、AnPRT、PRAI、TSA、TSB、IGPS和TDC基因，AS基因在不同的植物中具有组织特异性[50]，所以在根皮的表达量偏高可能和代谢终产物的大量积累有关；TDC基因被证实在萝芙木[51]和喜树的所有部位均有表达，且在喜树中的茎段和叶片中表达明显，在根部的表达极其微弱，而这与实验中TDC的表达水平一致[25]；SGD基因被证实在萝芙木的根、茎段、叶中均有表达，且茎段和叶片的表达量较高，这与实验中SGD基因在茎段和叶片中的表达量较高一致；而PRAI基因主要在根皮中表达，依次是花序、茎段，叶片中的表达量最低，这与钩吻素己在根皮中的含量最高，花序和茎段次之，而叶片中含量最低的趋势一致，这说明这条基因很可能是钩吻生物碱生物合成途径上的PRAI候选基因之一。
本研究筛选出EF-1α为钩吻在不同部位qRT-PCR分析时最佳的看家基因，同时，结合“基因组+全长转录组+代谢组”共表达关联分析的方式，对钩吻生物碱已知的上游合成途径相关基因在4个部位的表达水平进行了研究，为钩吻及马钱科植物其他功能基因表达模式分析及功能验证奠定了基础。
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