微生物病原体诱导黏液异常分泌是诱导气道疾病加重的机制之一^[1-2]，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)感染是社区获得性肺炎最常见的病因。长期以来肺炎支原体是儿童和成人最常见的呼吸道感染病原体^[3]，也一直被认为是一些呼吸道慢性感染和急性加重的触发器^[3-4]。其中肺炎支原体黏附蛋白P1是肺炎支原体黏附上皮细胞的主要介质，P1蛋白的C末端具有免疫原性^[5]。已有研究表明肺炎支原体感染会造成肺上皮细胞黏蛋白5AC (mucin 5AC, MUC5AC)的大量分泌^[6]，但是肺炎支原体粘附蛋白P1是否参与肺上皮细胞黏液异常分泌尚不清楚。

气道上皮细胞分泌的黏液形成一层保护膜，可以捕获外来颗粒和微生物，通过黏液和纤毛转运促进其清除^[7]。黏蛋白是黏液的主要组成成分，具有气道粘弹性和清除特性，其中MUC5AC是气道的一类主要大分子黏蛋白^[8-9]。通常缺乏黏液屏障使肺部容易受到损伤，但异常的黏蛋白分泌和积累在气道疾病的发病过程中却起着负面作用，黏液堵塞在哮喘和慢性阻塞性肺疾病中是气道狭窄和死亡的主要原因^[10-11]。因此，MUC5AC的过度分泌在急性肺损伤中是有害的^[12]。叉头框蛋白A2 (fork-head box A2, FOXA2)是抑制黏蛋白合成的转录因子^[13-14]，其中FOXA2在支气管扩张和哮喘患者的气道中表达减少^[15]。已有研究表明肺炎支原体感染能够引起MUC5AC的过表达，维持气道中FOXA2的功能，可改善患者的肺功能^[6]。我们推测肺炎支原体P1-C参与了肺炎支原体感染引起的黏蛋白MUC5AC异常表达。

Wnt/β-catenin信号通路拮抗剂Dickkopf (DKK)家族最近引起了越来越多的关注^[16]，其中包括4个蛋白质成员，DKK1、DKK2、DKK3和DKK4。它们被合成为由蛋白水解切割激活的前体蛋白^[17]。DKK1是该家族中研究最多的成员，它可以通过结合LRP-5/6，然后降解共受体来抑制Wnt信号，因此被认为是Wnt信号活性异常疾病的潜在靶点^[18-19]。此外，DKK1是研究最多的Wnt信号抑制剂候选药物之一，用于多种疾病的治疗，包括肺癌^[20]、纤维化疾病^[21]和自身免疫性疾病^[22]。这表明DKK1可能是一种鉴定传染性疾病的新型生物标志物。

之前的研究表明DKK1参与了肺炎支原体P1-C感染小鼠肺的炎症调控，能够有效地缓解肺炎支原体P1-C引起的过度炎性反应造成的肺损伤，因此，推测DKK1对肺炎支原体P1-C诱导的黏蛋白MUC5AC的分泌也有调控作用。肺炎支原体P1-C是否是肺炎支原体感染引起黏液异常分泌的主要因素，以及DKK1是否参与肺炎支原体P1-C蛋白诱导的黏液分泌尚不清楚。本研究旨在探讨DKK1调控肺炎支原体P1-C蛋白诱导肺上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC的分子机制，以对肺炎支原体感染引起的肺炎治疗具有积极的作用。

C57/BL6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠原代气道上皮细胞从C57/BL6小鼠气道中分离得到；Colivelin TFA购自MedChemExpress公司(使用浓度50 μg/mL)；抗体信息见表 1。

实验中所用的主要仪器有扫描电镜(型号：S-3700N, 日立公司)，凝胶成像仪(型号：CHEMI DOC MP, Bio-Rad公司)，倒置荧光显微镜(型号：Ⅸ53, Olympus公司)；主要试剂有Recombinant Mycoplasma pneumoniae P1-C (M. pneumoniae P1-C, 0.86 mg/mL) (PROSPEC公司)，PneumaCult ALI培养基(Glbco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，Accutase solution细胞消化酶(Sigma公司)等。

本研究涉及的动物实验已通过宁夏医科大学总医院医学科研伦理委员会审查(批准号：KYLL-2022-0240)。随机选取2只大小为2−3月龄的C57BL/6小鼠取其气管，把气管剪成小段用预冷的气管清洗液漂洗3−5次，每次5 min，将洗好的气管放入2 mL的EP管中，加入1.5 mL预冷的消化液4 ℃过夜。消化完，用枪头吹吸组织多次，加入含5%胎牛血清培养基终止消化。收集消化液到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清收集细胞，用Ex-plus basal medium (STEMCELL公司)培养基重悬，将分离到的细胞培养至用胶原已包被过夜的60 mm培养皿中，每2 d进行换液，大概培养至第7天细胞长满，用Accutase solution (SLBX5617, SIGMA)细胞消化液进行消化，将细胞传代到P3代时，细胞计数，按1.5×10⁶个细胞/每个小室(孔径0.4 μm, MILICELL-^®PCF)进行接种，继续加Ex-plus basal medium培养基在气液相环境下培养2−3 d，观察细胞长满整个小室不再漏液，换1×Ultroser G代血清动物培养基(BioSepra公司)进行分化培养，每2 d换1次液，液界面维持3周进行生长分化。

建立肺炎支原体P1-C感染小鼠模型，肺炎支原体P1-C蛋白使用前，用1×PBS (pH 7.4)稀释至200 ng/µL。小鼠被随机分为不同实验组(每组6只，6−8周龄C57BL/6雄性和雌性小鼠各3只)。设置PBS对照组(0、7、14、21和28 d，每个时间点6只小鼠，其中雌雄各3只，共30只)和肺炎支原体P1-C感染组(0、7、14、21和28 d，每个时间点6只小鼠，其中雌雄各3只，共30只)。在第0天时对30只PBS对照组小鼠采用气管内灌注PBS各50 µL，以及对肺炎支原体P1-C感染组30只小鼠采用气管内灌注肺炎支原体P1-C蛋白(200 ng/每g小鼠体重)。对两组小鼠灌肺后分别于第0天(PBS组6只，P1-C感染6只)、第7天(PBS组6只，P1-C感染6只)、第14天(PBS组6只，P1-C感染6只)、第21天(PBS组6只，P1-C感染6只)、第28天(PBS组6只，P1-C感染6只)实施安乐死，收集小鼠血液及解剖肺组织进行病理组织学分析。

首先采用1个“空”腺病毒骨架载体作为对照(AdBgLII)以及表达DKK1腺病毒载体(AdDKK1)^[23] (上海吉凯基因有限公司)两组，每组12只小鼠，雌雄各6只，两组共24只。进行小鼠气管灌肺肺部感染(1×10¹¹病毒颗粒/每只小鼠)，病毒感染小鼠48 h后，对照(AdBgLII)组12只小鼠用PBS 50 µL (6只)、肺炎支原体P1-C (6只)再次进行灌肺，AdDKK1组同样用PBS 50 µL (6只)、肺炎支原体P1-C (6只)再次进行灌肺。感染14 d对所有小鼠实施安乐死，取血液及肺组织进行后续实验。

PBS、P1-C蛋白刺激小鼠原代气道上皮细胞气液相培养基后收集细胞培养基保存在干冰中，送至广州RayBiotech生物技术有限公司进行检测。

配制10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，蛋白上样；凝胶电泳，电压100 V，时间2 h；湿转，电流为300 mA，时间2 h；封闭，5%脱脂奶粉封闭，室温2 h；膜上蛋白与一抗结合(抗体见表 1)，4 ℃过夜；第2天取出孵育一抗的膜在室温摇床上平衡30 min，然后回收一抗，加入PBS轻微冲洗，然后加入0.1% Tween-20的PBS中，在水平摇床上摇动洗涤10 min，重复洗3次，弃掉洗涤液，加入已稀释好的二抗，在室温摇床放置2 h，使用0.1% Tween-20的PBS，洗涤3次，每次10 min。采用全自动荧光化学发光仪进行曝光，保存图片。

培养21 d的小鼠原代上皮细胞气液相培养膜泡在2%戊二醛里固定1 h，0.1 mol/L二甲坤磷酸钠缓冲液浸泡，每次1 h，共换3次，最后泡在0.1 mol/L二甲坤磷酸钠缓冲液中4 ℃放置；30%乙醇脱水，10 min，4 ℃；50%乙醇脱水，10 min，4 ℃；70%乙醇脱水，10 min，4 ℃；80%乙醇脱水，10 min，室温；90%乙醇脱水，10 min，室温；100%乙醇脱水，15 min，2次，室温；环氧丙烷渗透，15 min，2次，放置–20 ℃，30 min，转移至真空泵中过夜抽干；将膜切成小块贴到铜片上，进行喷金处理；采用扫描电镜观察采集结果。

石蜡切片脱蜡处理，二甲苯处理两次；梯度复水，乙醇的浓度依次为100% (2次)、95%、80%、70%和蒸馏水，每次3 min；加入苏木素染色3 min，自来水洗，直至水为无色为止；酸性洗涤液中反应2−3 s，当切片从蓝变为红时立即终止反应，用自来水洗切片，待组织上的燃料洗掉为止，大约需2−3遍；将切片放入到盛有返蓝液的染缸中返蓝约30 s；将切片放入到盛有0.5%伊红的染缸中染色2 min，自来水洗，直至水为无色为止；放入80%乙醇1−2 s；95%乙醇脱水2次，每次2 min；100%乙醇脱水2次，每次2 min；将切片放入到盛有二甲苯溶液的染缸中，使组织透明3−5 min后，取出放到通风橱中，待二甲苯全部挥发完为止；向片子中滴加1滴中性树脂封片胶，并盖上盖玻片，待封片胶将整个组织都覆盖，用指甲油封住片子边缘，Leica正置显微镜下观察并采集结果。

石蜡切片脱蜡处理，将内源性过氧化物酶阻断剂滴加在组织上，室温孵育10 min，双蒸水清洗，微波热修复抗原，滴加5%牛血清白蛋白闭液，37 ℃孵育30 min封闭，甩去多余液体，不洗；一抗孵育4 ℃过夜；取出后37 ℃，30 min，PBS (pH 7.2−7.6)洗5 min，3次；二抗孵育；滴加聚合辣根过氧化物酶抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min；PBS (pH 7.2−7.6)洗5 min，3次；滴加二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色液工作液显色，显微镜下观察，控制反应时间；滴加苏木素复染，室温孵育1 min；PBS (pH 7.2−7.6)清洗，碱性溶液返蓝，中性树胶封片，显微镜观察结果，并采用ImageJ软件对结果进行量化分析。

石蜡切片脱蜡处理，30%双氧水室温灭活10 min，水洗；标本片上滴加新鲜稀释的蛋白酶K，室温消化10 min，0.01 mol/L Tris缓冲盐溶液(tris buffered saline, TBS)洗5 min，3次；标本片加标记缓冲液20 μL/片，以保持切片湿润；按每张切片取末端脱氧核糖核酸转移酶和地高辛标记的d-UTP各1 μL，加入18 μL标记缓冲液中，混匀；置样品于湿盒中，37 ℃标记2 h；0.01 mol/L TBS洗5 min，3次；滴加封闭液，37 ℃孵育30 min；甩掉封闭液，不洗；用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀后加至标本片上；置样品于湿盒中，37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L TBS洗5 min，3次；用抗体稀释液1:100稀释链霉亲和素-生物素复合物，混匀后50 μL/片加至切片，37 ℃反应30 min；0.01 mol/L TBS洗5 min，4次；DAB显色，取1 mL蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中，A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片上，镜下控制反应时间；水洗，滴加Mayer’s苏木素复染；室温孵育1 min，PBS (pH 7.2−7.6)清洗，碱性溶液返蓝；中性树胶封片，显微镜观察并采集结果。

石蜡切片脱蜡处理，蒸馏水冲洗，70%乙醇洗；浸入高碘酸乙醇溶液10 min；70%乙醇洗后，入还原液中1 min，70%乙醇后，入无色盐基性品红溶液1 h，流水冲洗10 min；用Mayer’s苏木素染液复染细胞核5 min，再用1%盐酸乙醇分化，流水冲洗后，脱水，透明，封片，用显微镜观察采集图片。

石蜡切片脱蜡处理，二甲苯3缸，每缸7 min，80%、90%和100%梯度乙醇各浸泡7 min；先自来水后蒸馏水洗3次；切片烘干；配制好的苏木素浸染5 min，水洗后分化液分化7 s；饱和磷酸氢二钠溶液蓝化5 min，先自来水后蒸馏水洗3次后烘干；丽春红酸性品红染液浸染20 s，弱酸溶液冲洗3次磷钼酸浸泡5 min，弱酸溶液冲洗3次，水洗吹干；苯胺蓝染30 min，1%弱酸溶液洗1 min；95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封片；显微镜观察结果并采集图片。

所有数据均以3次独立实验的平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 7.0软件进行分析。在统计上，差异通过单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)进行分析，P值小于0.05为显著性差异，用*/#表示，P值小于0.01为极显著差异，用**/##表示。

首先分离C57/BL6小鼠原代气道上皮细胞，得到的细胞生长状态良好，并能够迅速生长，到第7天的时候，细胞密度可达90%以上(图 1A)。采用实验流程建立体外小鼠原代气道上皮细胞气液相培养模型(图 1B)。将培养分化21 d的气液相小鼠原代气道上皮细胞进行HE染色，结果清晰地显示有多层细胞的生长及分化，其中HE染色使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，使细胞质和细胞外基质中的成分着红色(图 1C)。成功建立小鼠原代气道上皮细胞气液相培养模型，模拟自然生长状态的呼吸道上皮细胞生长环境。

图 1 小鼠原代气道上皮细胞气液相培养模型的建立 Fig. 1 Development of a culture model using mice primary airway epithelial cells (MAECs) of air-liquid interface (ALI). A: Growth charts of primary airway epithelial cells isolated from C57/BL6 mice at different time (a, 0 d; b, 3 d; c, 5 d; d, 7 d). B: Model diagram of MAECs ALI culture. C: HE staining of MAECs ALI culture after 21 days. D: The secretion of mucus was observed by scanning electron microscope after the MAECs were stimulated by PBS and M. pneumoniae P1-C for 48 h. Scale bars in (A) 100 µm and (D) 2 000 nm.

图选项

为了更清楚直观地观察P1-C蛋白刺激对小鼠气道上皮细胞黏液分泌影响情况，采用扫描电镜观察气液相小鼠气道上皮细胞表面黏液分泌变化。扫描电镜结果显示21 d后小鼠气道上皮细胞分化出纤毛细胞，其纤毛成簇状分布，周围有黏液分布。P1-C蛋白刺激组与对照组PBS相比，其表面有大量黏液分泌，覆盖了分化出的纤毛(图 1D)。根据以上结果，我们推测P1-C蛋白刺激能够引起气液相小鼠原代气道上皮细胞分泌大量的黏液。

肺炎支原体感染能够引起机体分泌大量的炎性因子^[24]，本研究采用蛋白芯片技术对细胞培养基进行了炎症因子的检测以及相关信号通路的预测。结果发现，与PBS处理组相比，P1-C蛋白刺激组能够上调炎症因子IL-1b、IL-2、IL-5、IL-6、IL-12p70、IL-17、IL-17F、IL-22、IL-23、IL-28、IFNg和TNFa的分泌(图 2A)。已有研究表明JAK激酶-信号传导与转录激活因子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT)信号通路在肺炎支原体感染中具有重要的调控作用^[6]，信号通路富集结果显示JAK-STAT信号通路也参与了P1-C蛋白刺激的小鼠原代上皮细胞的调控(图 2B)。为了更进一步地在体内发现这一调控机制，我们接着在小鼠体内展开研究。

图 2 蛋白芯片检测P1-C蛋白刺激小鼠原代上皮细胞诱导炎症因子的分泌及信号通路相关性 Fig. 2 Protein microarray was used to detect the secretion of inflammatory factors and the correlation of signaling pathways in primary epithelial cells of mice infected by M. pneumoniae P1-C. A: Detection of inflammatory factors in the culture medium of MAECs stimulated by PBS and M. pneumoniae P1-C for 48 h. B: Enrichment results of signal pathways in MAECs stimulated by PBS and M. pneumoniae P1-C. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001.

图选项

肺炎支原体P1-C感染小鼠C57/BL6后发现其感染能够引起肺水肿(图 3A)，对感染肺炎支原体P1-C的小鼠选取0、7、14、21和28 d 5个不同时间点进行解剖，免疫组化染色结果显示，肺炎支原体P1-C感染能够引起小鼠肺组织中MUC5AC的过量分泌，在第14天黏液蛋白MUC5AC分泌呈极显著增加趋势(图 3B、3C)。为了更进一步地观察肺炎支原体P1-C感染引起过度黏液分泌对小鼠肺组织的损伤，对肺炎支原体P1-C感染第14天的小鼠肺组织进行HE染色、PAS染色、Tunel染色和Masson染色，HE染色结果显示，肺炎支原体P1-C感染组与对照PBS组相比，肺炎支原体P1-C感染能够引起小鼠肺泡增大，肺泡壁断裂，肺中炎性细胞浸润，可见肺炎支原体P1-C感染能够引起小鼠肺部炎症反应，造成肺组织损伤(HE图中黑色箭头指示)；PAS染色结果显示，肺炎支原体P1-C感染组与PBS组相比，其糖原积累更多，说明肺炎支原体P1-C感染引起的免疫反应使得肺泡细胞分泌大量的黏液(PAS图中黑色箭头指示)；Tunel染色结果显示，肺炎支原体P1-C感染组与PBS组相比，肺炎支原体P1-C感染引起肺部凋亡细胞增多，可见肺炎支原体P1-C感染能够引起肺组织破坏(Tunel图中黑色箭头指示)；Masson染色结果显示，肺炎支原体P1-C感染组较PBS组产生更多的胶原蛋白和胶原纤维，说明肺炎支原体P1-C感染能够引起小鼠肺纤维化(Masson图中黑色箭头指示) (图 3D)。可见，肺炎支原体P1-C刺激能够引起小鼠肺组织中MUC5AC的过量分泌从而对小鼠肺组织造成多方面的损伤。

图 3 肺炎支原体P1-C刺激引起小鼠C57/BL6肺中MUC5AC的过量分泌 Fig. 3 Mycoplasma pneumoniae P1-C stimulation caused over-secretion of MUC5AC in the lungs of C57/BL6 mice. A: External lung morphology of C57/BL6 mice stimulated with PBS and M. pneumoniae P1-C after 14 days. B: Immunohistochemistry showed the expression of MUC5AC in the lungs of C57/BL6 mice treated with M. pneumoniae P1-C at 0 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d. C: Semi-quantification of MUC5AC protein expression of (B). D: HE, PAS, Tunel and Masson staining were performed after lung stimulation with PBS and M. pneumoniae P1-C for 14 days. Scale bars in (B) and (D) 100 µm. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001.

图选项

为了更进一步地研究DKK1对肺炎支原体P1-C诱导MUC5AC分泌的调控机制，我们首先用腺病毒AdBgLII和AdDKK1对小鼠进行灌肺，感染小鼠肺组织48 h后，用PBS及肺炎支原体P1-C进行感染，14 d后取肺组织进行检测。结果发现，与对照组AdBgLII相比，DKK1蛋白在小鼠肺中大量表达(图 4A)；免疫组化结果表明，AdDKK1过表达能够显著减少肺炎支原体P1-C引起的小鼠肺组织中黏液蛋白MUC5AC的表达(图 4B、4C)，Western blotting结果显示，与AdBgLII对照组相比，肺炎支原体P1-C感染能够引起小鼠肺脏中Wnt/β-catenin信号通路关键调控分子active-β-catenin过表达，使得Wnt/β-catenin信号通路异常激活(图 4D、4E)。之前的研究表明Wnt/β-catenin信号通路抑制分子DKK1能够有效地缓解肺炎支原体P1-C引起的炎症反应，推测DKK1对P1-C诱导的上皮细胞黏蛋白的分泌也有调控作用。研究发现在肺炎支原体P1-C感染中，AdDKK1过表达能够抑制JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白表达，同时能够上调黏蛋白抑制转录因子FOXA2的表达(图 4F、4G)，推测被抑制的JAK-STAT1/STAT3以及过表达的FOXA2对MUC5AC蛋白的分泌具有抑制作用，从而缓解肺炎支原体P1-C引起黏液过多分泌对小鼠肺组织造成的肺损伤。为了证实这一推测，采用STAT3激活剂colivelin TFA刺激小鼠原代气道上皮细胞，结果发现，和肺炎支原体P1-C感染组相比，colivelin显著抑制DKK1和FOXA2蛋白表达(图 4H、4I)，在小鼠体内实验表明colivelin TFA能够逆转DKK1抑制的MUC5AC蛋白分泌(图 4C)。因此，我们推测DKK1通过抑制JAK/STAT1-STAT3信号通路以及上调FOXA2的表达有效地减少肺炎支原体P1-C诱导的小鼠肺上皮细胞MUC5AC的分泌(图 5)。

图 4 DKK1对肺炎支原体P1-C诱导的MUC5AC分泌的调控机制 Fig. 4 DKK1 regulates MUC5AC secretion induced by Mycoplasma pneumoniae P1-C. A: Expression of DKK1 protein in the lungs of C57/BL6 mice after adenovirus AdDKK1 infection, compared with PBS. B: Representative immunohistochemistry images showed a reduction of MUC5AC at 14 d with M. pneumoniae P1-C exposure. C: Image J software was used for quantitative analysis of (B). D: Representative immunoblot validated an upregulation of active-β-catenin in mouse lungs induced by M. pneumoniae P1-C. E: Semi-quantitation of the relative abundance of the indicated proteins in (D) by densometric analysis of blots from three independent experiments (n=6). F: Representative immunoblots showed the expression of DKK1, JAK2, p-STAT1, p-STAT3 and FOXA2 in mouse lungs. G: Semi-quantitation of the relative abundance of the indicated proteins in (F) by densometric analysis of blots from three independent experiments (n=3). H: Representative immunohistochemistry images showed a reduction of STAT3, p-STAT3, DKK1 and FOXA2 in MBECs. I: Semi-quantitation of the relative abundance of the indicated proteins in (H) by densometric analysis of blots from three independent experiments (n=3). Scale bars in (A) and (B) 100 µm. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001. #P < 0.05, ##P < 0.01, and ###P < 0.001 compared to AdBgLII with M. pneumoniae P1-C exposure.

图选项

图 5 DKK1对肺炎支原体P1-C诱导MUC5AC分泌的调控机制模式图 Fig. 5 Mechanism pattern of DKK1-regulated MUC5AC secretion induced by Mycoplasma pneumoniae P1-C. Wnt: Wingless; JAK: Janus kinase; p-STAT: Phosphorylation signal transducer and activator of transcription; FOXA2: Fork-head box A2; MUC5AC: Mucin 5AC; DKK1: Dickkopf-1.

图选项

肺炎支原体肺炎已成为一种全球性传染病^[25]。当前，COVID-19肺炎全球大流行及肺炎支原体合并感染给临床治疗带来很大困难，需要在临床诊断和治疗上取得突破。

肺炎支原体是社区获得性肺炎的常见病原体之一，了解其发病机制对临床具有重要意义。肺炎支原体的致病机制主要是通过呼吸道上皮细胞的黏附破坏黏膜上皮细胞，引起炎症反应^[26]，肺炎支原体能够编码多种毒力因子，包括黏附素、糖脂、毒性代谢产物、社区获得性呼吸窘迫综合征毒素和荚膜多糖。其中黏附蛋白是肺炎支原体侵入呼吸道并定植于气道上皮细胞的首要因素，其中黏附蛋白P1不仅在肺炎支原体黏附过程中发挥重要作用，还参与了肺炎支原体的滑行运动，使菌体从支气管纤毛尖端向宿主细胞表面转移^[27]。P1黏附蛋白具有高度的免疫原性，常在肺炎支原体感染患者的血清中检测到^[28-30]。其中P1的羧基端具有高度的免疫原性，它可以与各种宿主分子结合^[5]，在黏附蛋白发挥其功能中起至关重要作用^[31-32]。

黏液蛋白MUC5AC与多种肺疾病具有相关性^[33-34]，肺炎支原体感染能够引起人上皮细胞中MUC5AC显著增加，导致气道黏液高分泌，产生黏痰与气道炎症，影响气道通畅性，进而加重疾病，因此找到有效改善黏液过度分泌的靶点显得尤为重要。本研究表明肺炎支原体P1-C蛋白作为肺炎支原体主要致病因子，能够引起小鼠原代气道上皮细胞和小鼠肺组织分泌大量的黏液，推测肺炎支原体P1-C蛋白是肺炎支原体感染上皮细胞导致黏液异常分泌的主要因素，同时会引起炎性因子大量分泌，其中JAK-STAT信号通路参与调控。

之前的研究表明，过表达Wnt/β-catenin信号通路抑制分子DKK1能够有效缓解肺炎支原体P1-C诱导的小鼠肺脏上皮细胞炎症反应，我们推测DKK1可能参与调控肺脏上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC。FOXA2是黏蛋白生物合成的主要转录抑制因子，已有研究表明绿脓素通过翻译后修饰氧化还原失活FOXA2，导致黏蛋白过表达^[13-14]。本研究结果表明，在肺炎支原体P1-C感染中，过表达DKK1能够显著抑制JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白的表达，显著增加转录抑制因子FOXA2的表达，可见DKK1在肺炎支原体P1-C诱导的小鼠上皮细胞黏液过度分泌中具有重要的调控作用。

总之，肺炎支原体P1-C蛋白可能是肺炎支原体引起呼吸道上皮细胞黏液蛋白异常分泌的主要原因，DKK1抑制肺炎支原体P1-C引起的黏液蛋白MUC5AC的异常分泌，其作用机制可能是通过抑制JAK2/STAT1-STAT3信号通路从而促进FOXA2的高表达来实现的，因此DKK1作为一种新的潜在治疗靶点，可能在缓解肺炎支原体P1-C引起的黏液蛋白过度分泌造成肺损伤中会起到积极作用(图 5)。