肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长^[1]。

近几十年来，单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAbs)在医学研究、临床诊断和治疗方面发挥了越来越大的作用，占据了生物药物总产量的30%以上^[2]。目前已上市或者正在临床试验的单克隆抗体主要是由哺乳动物细胞产生^[3]，转基因动物乳腺反应器是外源基因的理想表达场所，转基因动物乳腺表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。

PD-L1 (programmed death-ligand 1)是一种表达于细胞表面的蛋白，又称B7-H1蛋白，由CD274基因编辑表达^[4]。它可以与效应T细胞上的PD-1及B7.1结合，传导免疫抑制信号，抑制免疫效应T细胞的活性^[5]。这一过程也会导致通过PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK途径的信号转导减少^[6]，对效应T细胞功能重要的转录因子表达减少(Tbet、Gata3和Eomes)以及促生存因子Bcl-xL表达减少^[7]。PD-L1在许多类型的细胞中表达，比如胎盘、血管内皮细胞、胰岛细胞、肌肉及肝细胞等。在生理条件下，PD-1/PD-L1信号通路在胎盘、眼、脑等部位通过最大限度降低这些组织周围的免疫反应，从而避免自身免疫性疾病的发生^[8]。在病理条件下，肿瘤细胞PD-L1分子的异常高表达及其信号通路激活会抑制肿瘤特异性免疫T细胞的增殖及活性，并促进其凋亡，从而帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸^[9]。

本实验室在已经构建好的转基因小鼠^[10]乳腺中成功表达抗PD-1抗体，因为小鼠PD-1和人PD-1具有60%的同源性，因此在转基因鼠乳腺中表达抗人PD-1抗体可能会对转基因鼠的免疫系统产生一定的影响。因此本研究将从细胞水平研究小鼠乳腺表达抗PD-1抗体对转基因鼠脾脏T细胞表面抗原蛋白、细胞因子表达、脾脏CD4⁺ T细胞增殖以及增殖相关通路的影响。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

青链霉素双抗(100×)，购自Hyclone公司；动物总蛋白提取试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；4%–20% SDS聚丙烯酰胺预制胶，购自天地人和生物科技有限公司；Western blotting试剂盒、免疫荧光染色试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；动物总蛋白提取试剂盒，购自上海凌仪生物科技有限公司；True-Nuclear^TM Mouse Treg Flow^TM Kit (FOXP3 Alexa Fluor^® 488/CD4 APC/CD25 PE)、PE anti-mouse CD274 (B7-H1, PD-L1)、PE anti-mouse CD279 (PD-1)、PE anti-mouse CD80、APC anti-mouse CD28、PE anti-mouse CD152 (CTLA-4)、APC anti-mouse CD62L、PerCP/ Cy5.5 anti-mouse/human CD44、PerCP/Cy5.5 anti-mouse IL-4、APC anti-mouse IL-2、PE anti-mouse LAP (TGF-β1)、PerCP/Cy5.5 anti- mouse IFN-γ、APC anti-mouse IL-17A、PE anti-mouse IL-10、FITC anti-mouse CD4、PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD11b、FITC anti-mouse CD11c、APC anti-mouse CD19、Cell Staining Buffer、TruStain fcX^TM (anti-mouse CD16/32) Antibody、RBC Lysis Buffer (10×)、Fixation Buffer、Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)、Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A)，Biolegend公司；MagCellect^TM Mouse CD4⁺ T Cell Isolation Kit，R & D公司；CellTrace^TM CFSE Cell Proliferation Kit，Invitrogen公司；Active Ras Detection Kit、Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) (E3U1H) Rabbit mAb、Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb、Phospho-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP^® Rabbit mAb、Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/ Tyr204) (197G2) Rabbit mAb、Phospho-MEK1/2 (Ser217/221) (41G9) Rabbit mAb、Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb、PI3 Kinase p85 (19H8) Rabbit mAb、Ras (27H5) Rabbit mAb、p44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) Rabbit mAb、mTOR (7C10) Rabbit mAb、β-Actin (D6A8) Rabbit mAb、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody、MEK1/2 (47E6) Rabbit mAb，购自CST公司。

1.2 试验动物

能够在乳腺中分泌产生的抗人PD-1抗体的8周龄及18周龄转基因C57BL/6雌性小鼠，由本实验室构建^[10]。C57BL/6小鼠购自赛业(苏州)生物科技有限公司，小鼠均饲养在无病原体(specific pathogen free, SPF)环境中。所有动物实验均经上海医药工业研究院药理评价研究中心实验动物伦理委员会批准(批准号：FZYL2021F041)。

1.3 细胞表面免疫荧光染色

雌性C57BL/6小鼠在生物安全柜中取脾脏，研磨后用70 μm一次性细胞过滤器过滤细胞，细胞重悬于磷酸缓冲盐(phosphate-buffered saline, PBS)溶液中。每管加入PBS至终体积为15 mL。台式离心机350×g离心5 min，去上清。将红细胞裂解液(10×)用蒸馏水稀释成1×的工作浓度后，每管加入3 mL，冰上孵育7 min。向试管中加入10 mL Cell Staining Buffer，停止红细胞裂解。350×g离心5 min后去上清。用10 mL Cell Staining Buffer重复清洗一次。计数活细胞，并以5×10⁶–10×10⁶个细胞/mL的浓度在Cell Staining Buffer中重新悬浮并取100 μL放入12 mm×75 mm的流式管中。每100 μL细胞中加入1.0 μg TruStain fcX^TM (anti-mouse CD16/32) Antibody，冰上孵育10 min用于封闭Fc受体。每100 μL细胞中加入相应的细胞表面抗体，终浓度为0.2 mg/L，常温暗处孵育15 min。每管加入2 mL Cell Staining Buffer，350×g离心5 min，去上清，洗涤2次。每管加入0.5 mL Cell Staining Buffer重悬细胞，用流式细胞仪分析检测。

1.4 细胞内免疫荧光染色

将获得的脾脏淋巴细胞用37 ℃预热的脾脏细胞培养基重悬，浓度为1×10⁶个细胞/mL，每mL细胞中加入2 μL细胞激活混合物[Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A)]，5% CO₂、37 ℃培养箱中孵育6 h，以刺激胞内细胞因子的表达。350×g离心5 min收集细胞，去上清。用Cell Staining Buffer洗涤两次。依照1.3的方法进行细胞表面染色。每1×10⁶个细胞中加入0.5 mL Fixation Buffer，暗处室温固定20 min。350×g离心5 min，去上清。用蒸馏水将Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)稀释成1×，每1×10⁶个细胞中加入1 mL，350×g离心5 min，去上清，重复两次。每1×10⁶个细胞中加入相应浓度的细胞因子抗体，终浓度为0.2 mg/L，常温暗处孵育15 min。加入2 mL Cell Staining Buffer，350×g离心5 min，去上清。洗涤两次。每1×10⁶个细胞中加入0.5 mL Cell Staining Buffer重悬细胞，用流式细胞仪分析检测。

1.5 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ Treg细胞的检测

使用True-Nuclear^TM Mouse Treg Flow^TM Kit (FOXP3 Alexa Fluor^® 488/CD4 APC/CD25 PE)试剂盒进行Treg细胞的检测。依照1.3的方法进行细胞表面染色。每1×10⁶个细胞中加入20 μL CD4 APC/CD25 PE的混合物，暗处室温孵育15 min。加入2 mL Cell Staining Buffer，350×g离心5 min，去上清，洗涤2次。每1×10⁶个细胞中加入1 mL固定液(试剂盒内提供)，旋涡混匀后暗处室温孵育45–60 min。每管细胞直接加入2 mL Perm buffer (试剂盒内提供)，350×g离心5 min，去上清。将细胞重悬于100 μL Perm buffer中，每管加入5 μL Alexa Fluor^® 488 anti-mouse FOXP3 (试剂盒内提供)，暗处室温孵育30 min。每管细胞加入2 mL Perm buffer，350×g离心5 min，去上清。每管加入2 mL Cell Staining Buffer，350×g离心5 min，去上清，洗涤2次。每管加入0.5 mL Cell Staining Buffer重悬细胞，用流式细胞仪分析检测。

1.6 T细胞增殖实验

雌性C57BL/6小鼠在生物安全柜中取脾脏，研磨后用70 μm一次性细胞过滤器过滤细胞，细胞重悬于PBS中。每管加入PBS至终体积为15 mL。350×g离心5 min，去上清。将红细胞裂解液RBC Lysis Buffer (10×)用蒸馏水稀释成1×的工作浓度后每管加入3 mL，冰上孵育7 min。向试管中加入10 mL PBS，停止红细胞裂解。350×g离心5 min后去上清。用10 mL PBS重复清洗1次，计数活细胞。

从MagCellect^TM Mouse CD4⁺ T Cell Isolation Kit取出10×MagCellect Buffer用蒸馏水稀释成1×。1×MagCellect Buffer需置于冰上或冰箱中且在24 h内用完。将细胞重悬于1×MagCellect Buffer至浓度为2×10⁸个细胞/mL。每1×10⁷个细胞中加入10 μL Mouse CD4⁺ T Cell Biotinylated Antibody Cocktail，轻柔混匀，防止出现气泡，置于2–8 ℃冰箱中孵育15 min。随后细胞悬液中加入等体积的链霉亲和素磁流体，轻柔混匀，防止出现气泡，置于2–8 ℃冰箱中孵育15 min。

孵育后细胞中加入一定体积的1× MagCellect Buffer，每1×10⁸个细胞的终体积为2 mL。将含有细胞悬液的离心管垂直放置于细胞分离磁力架，室温静置6 min，小心吸取细胞上清液至另一干净的离心管中，重复吸附1次。接着将细胞于350×g离心5 min后去上清，用PBS重悬至浓度为1×10⁷个细胞/mL。加入相同体积的2 μmol/L CFSE染液，37 ℃水浴20 min。反应液中加入4倍体积的T细胞增殖培养基吸附未结合的染料，孵育5 min。350×g离心5 min后去上清，用T细胞增殖培养液重悬至浓度为1×10⁶个细胞/mL。加入刀豆蛋白A (concanavalin A, ConA)使其终浓度为2 μg/mL，将其铺入96孔板，每孔100 μL，5% CO₂，37 ℃培养箱中培养4 d后收集细胞，流式细胞仪检测细胞增殖情况。

1.7 CD4⁺ T细胞总蛋白提取

根据动物总蛋白提取试剂盒的说明书，向每1 mL预冷的裂解液中依次加入5 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和10 μL PMSF并混匀。冰上预冷待用。将1.6中提取的脾脏CD4⁺ T细胞以每5×10⁶个细胞加入Lysis Buffer 0.5 mL。4 ℃、150 r/min摇床振荡1 h。4 ℃、12 000×g离心15 min，收集上清，即为全蛋白提取物，二辛可宁酸(bicinchonininc acid, BCA)法测定蛋白浓度，蛋白分装至离心管–70 ℃保存。

1.8 Western blotting检测

将1.7中获得的蛋白进行Western blotting检测^[11]，放入化学发光成像仪中显色拍照，保存图像文件。

1.9 Ras活性测定

根据Ras活性测定试剂盒的说明书，先将试剂盒中带有的旋杯插入收集管，加入100 μL谷胱甘肽树脂，6 000×g离心30 s，弃去收集管中的液体。旋杯中加入400 μL 1×裂解/结合/洗涤缓冲液，6 000×g离心30 s，弃去收集管中的液体。加入80 μg GST-Raf1-RBD后，立即加入500 μg总蛋白，关闭盖子并封上封口膜。4 ℃、60 r/min摇床温和振荡1 h。将带有收集管的旋杯6 000×g离心30 s，将旋杯放入新的收集管中。用400 μL 1×裂解/结合/洗涤缓冲液清洗旋杯中的树脂，6 000×g离心30 s，弃去离心后的液体，重复2次。将旋杯放入新的收集管中，加入50 μL还原缓冲液(含200 mmol/L DTT的2×SDS样品缓冲液)进行解吸附，旋涡样品，室温孵育2 min。6 000×g离心30 s，收集洗脱液，95–100 ℃加热5 min。样品进行SDS凝胶电泳后用Ras Rabbit mAb进行Western blotting检测。

1.10 数据分析

流式细胞仪的检测结果用Flowjo (BD)软件进行分析，数据在GraphPad Prism7.00 (GraphPad公司)软件中用t检验进行统计分析后画图。Western blotting图谱用Image J (National Institutes of Health)扫描后数据在GraphPad Prism 7.00 (GraphPad)软件中用t检验进行统计分析后作图。

2 结果与分析 2.1 转基因小鼠CD4⁺ T细胞表面PD-1表达的变化

在8周龄和18周龄经历乳汁分泌的雌鼠中，转基因阳性鼠CD4⁺ PD-1⁺细胞的比例相较于转基因阴性鼠都有不同程度的降低，在8周龄转基因阳性鼠中CD4⁺ PD-1⁺T细胞占淋巴细胞的18.620%±1.261% (n=10)，转基因阴性鼠的数值为22.670%±1.348% (n=9)。经历乳汁分泌的雌鼠组，CD4⁺ PD-1⁺T细胞的比例在转基因阳性鼠(29.240%±1.119%, n=7)和转基因阴性鼠(36.79%±1.44%, n=8)之间差异要高一些(18周降低20.5% vs. 8周降低17.8%)(图 1)。以上结果说明在转基因小鼠乳腺中表达抗人PD-1抗体后会降低小鼠CD4⁺ PD-1⁺T细胞的比例。同时发现，转基因阳性小鼠在经历乳汁分泌后这种作用比没有交配的转基因阳性小鼠明显一些，因为18周龄转基因阳性鼠CD4⁺ PD-1⁺T细胞比例的变化大于8周龄的转基因阳性鼠。

同时对这两组样本脾脏淋巴细胞中的抗原递呈细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，表面的PD-L1的表达进行了检测。结果发现无论是8周龄的雌鼠还是18周龄经历乳汁分泌的雌鼠，转基因阳性鼠和转基因阴性鼠APC表面的PD-L1的表达变化均没有显著性差异(图 2)。

2.2 转基因小鼠CD4⁺ T细胞中效应T细胞的比例变化

转基因阳性鼠CD4⁺的T细胞群体中，CD62L^lowCD44^high细胞的占比均高于转基因阴性鼠(图 3)。在8周龄鼠中，转基因阳性鼠和转基因阴性鼠CD62L^lowCD44^high所占的比例分别为21.700 0%±0.906 6% (n=10)和17.130 0%± 0.955 2% (n=9)，在18周龄经历过乳汁分泌的小鼠中，CD62L^lowCD44^high所占的比例分别为29.160%±1.799% (n=7)和22.630%±1.383% (n=8)。18周龄鼠中转基因阳性鼠CD62L^lowCD44^high (效应T细胞)百分比变化率(28.9%)略高于8周龄鼠中转基因阳性鼠的百分比变化率(26.8%)。18周龄鼠中转基因阳性鼠CD62L^highCD44^low (幼稚T细胞)百分比的降低(25.2%)比8周龄鼠中转基因阳性鼠的百分比的降低(11.6%)更大。CD62L^lowCD44^high是记忆/效应T细胞的表型，说明抗人PD-1抗体表达后，PD-1/PD-Ls的结合受影响，从而会影响T细胞的激活，使幼稚T细胞部分地向效应T细胞转变。这种影响在分泌乳汁后会更大一些。

2.3 转基因小鼠CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞的比例以及其CD4⁺ T细胞表达的细胞因子TGF-β、IL-10的变化

流式结果显示两组样本中CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞在转基因阳性鼠(8周：4.575 0%± 0.276 4%, n=10，18周：5.507 0%±0.459 8%, n=7)中的比例要低于同鼠龄的转基因阴性鼠(8周：5.881 0%±0.229 5%, n=9，18周：7.544 0%± 0.364 3%, n=8)，而且在经历过乳汁分泌的样本鼠中，这种变化更为显著(8周降低22.2% vs. 18周降低27.0%)(图 4A–4B)。说明抗人PD-1抗体在乳腺中的表达抑制了PD-1/PD-L通路，进而抑制了Treg细胞在CD4⁺ T细胞中的比例。同时检测了CD4⁺ T细胞表达的细胞因子TGF-β在两组样本中的表达情况。流式结果显示在8周龄和18周龄的转基因阳性鼠和阴性鼠中TGF-β的表达均没有显著性变化(P > 0.05) (图 4C)。IL-10的表达在8周龄的阳性鼠中要高于阴性鼠，而在18周龄的样本中，转基因阳性鼠和转基因阴性鼠之间没有显著性变化(图 4E)。

2.4 转基因小鼠CD4⁺ T细胞胞内细胞因子表达的变化

流式荧光检测CD4⁺ T细胞胞内因子所占百分比结果见表 1。结果发现，不管是8周龄还是经历乳汁分泌的18周龄转基因阳性鼠，其CD4⁺ T细胞分泌的IFN-γ (图 5A−5B)和IL-17 (图 5C−5D)与同鼠龄的转基因阴性鼠相比都有增加，以上结果说明抗人PD-1抗体在乳腺中表达的初期和乳汁分泌期都影响了T细胞细胞因子的表达。CD4⁺ T细胞表达的IL-2在8周龄的转基因阳性鼠和阴性鼠中没有显著性差异，在18周龄的转基因阳性鼠中的含量要高于同鼠龄的转基因阴性鼠，呈现出了与IFN-γ相同的增长趋势(图 5E–5F)。IL-4在两个样本的转基因阳性鼠和阴性鼠中都没有检测到有显著性变化(图 5G–5H)。

2.5 转基因鼠中APC上的CD80和CD4⁺ T细胞上的CD28、CTLA-4的表达变化

流式结果显示两组样本中，转基因阳性鼠与转基因阴性鼠APC上的CD80 (图 6A)和CD4⁺ T细胞上的CD28 (图 6B)、CTLA-4 (图 6C)的表达均没有显著变化。这一结果说明本实验中对PD-1/PD-L结合的影响不会导致CD80- CD28以及CD80-CTLA-4结合的变化。

2.6 小鼠乳腺表达抗PD-1抗体对转基因鼠CD4⁺ T细胞增殖的影响

流式和数据分析的结果(图 7)显示，8周龄的雌鼠和18周龄经历乳汁分泌的雌鼠中，转基因阳性鼠和转基因阴性鼠T细胞增殖没有显著性差异。

2.7 小鼠乳腺表达抗PD-1抗体对转基因小鼠CD4⁺ T细胞中PI3K-Akt-mTOR通路信号分子的影响

结果显示，在8周龄未怀孕的转基因雌鼠中，转基因阳性鼠和阴性鼠的p-PI3K、p-Akt以及p-mTOR的表达水平没有明显的变化(图 8)。在18周龄经历乳汁分泌的转基因雌鼠中，转基因阳性鼠的p-PI3K的表达水平比转基因阴性鼠高18.4%，转基因阳性鼠p-Akt的表达水平比转基因阴性鼠高16.4%，而p-mTOR的表达水平在转基因阳性鼠和转基因阴性鼠之间没有明显变化。

2.8 小鼠乳腺表达抗PD-1抗体对转基因小鼠CD4⁺ T细胞中Ras-MEK-ERK通路信号分子的影响

结果显示，在8周龄未怀孕的转基因雌鼠中，转基因阳性鼠和阴性鼠的Ras、p-MEK1/2以及p-Erk1/2的表达水平没有明显的变化(图 9)。在18周龄经历乳汁分泌的转基因雌鼠中，检测到转基因阳性鼠的活性形式Ras (与GTP结合的Ras)的表达水平比转基因阴性鼠高27.44%，p-MEK1/2和p-Erk1/2两者的表达水平在转基因阳性鼠和转基因阴性鼠之间没有显著差异。以上结果说明，小鼠乳腺表达抗PD-1抗体主要影响转基因小鼠CD4⁺ T细胞中2个通路的信号分子中的PI3K、Akt以及Ras的活性，没有影响到2个通路下游的mTOR和MEK/ ERK，从这个结果推测，脾脏来源的CD4⁺ T细胞的增殖没有出现显著变化的原因可能跟信号通路这些分子的变化有关，特别是与信号通路级联反应的终端分子没有发生显著变化有关。说明转基因表达抗PD-1抗体对整个信号通路的影响是局部的，因此没有检测到跟这个通路相关的所有因素的全局变化，而是部分变化，比如效应T细胞比例上升，Treg比例下降，而T细胞增殖能力没有显著变化，IL-10、TGF-β1以及IL-4这些细胞因子的表达没有变化。

3 讨论与结论

单克隆抗体(mAbs)的研发和生产已成为目前生物制药行业发展最快的一部分。哺乳动物细胞培养是目前生产大多数商业化mAbs的首选方法。然而，由于其生产能力有限且扩大规模所需较高的成本，这些系统不能很好地满足临床上对治疗用抗体日益增长的需求。随着显微注射技术的发展，转基因动物乳腺已成为生产重组蛋白的新途径。近年来，大量重组蛋白和单克隆抗体在转基因小鼠、兔子、山羊、绵羊、猪和牛的乳腺中获得成功表达。

自1992年首次发现PD-1以来，越来越多的证据表明PD-1及其配体是T细胞活化和耐受以及诱导和维持外周耐受的关键调节因子^[12]。随后的研究也表明，PD-1通路在自身免疫^[13]、移植免疫^[14]、感染性免疫^[15]和肿瘤免疫^[16]的调节中发挥着重要作用。我们对T细胞中PD-1信号转导的大部分认识来自于对原始T细胞活化后PD-1参与的研究。

通过流式细胞仪检测转基因阳性鼠和阴性鼠中PD-1/PD-Ls通路相关的蛋白和CD4⁺ T细胞表达的细胞因子之间的差异，以转基因小鼠乳腺反应器为模型，从细胞水平发现了表达外源单克隆抗体特别是与免疫系统相关抗体对宿主本身免疫系统的影响。结果表明，乳腺表达免疫抑制剂会对宿主的免疫系统产生一定的影响，这种影响可以通过细胞水平的检测进行评估，但是这种影响是部分的，没有直接导致转基因动物严重的健康问题，因此转基因小鼠作为表达PD-1这类单抗的宿主是可行的，同时对于宿主不仅需要关注健康问题，还需要进行免疫细胞方面的评估检测。

随后检测转基因小鼠脾脏T细胞增殖能力，发现转基因阳性鼠和转基因阴性鼠中T细胞增殖没有显著性差异，且发现转基因阳性鼠中PI3K/Akt/mTOR和Ras/MEK/ERK的磷酸化蛋白只有部分表达上调，整个通路没有完全上调，由此可认为转基因小鼠作为乳腺表达抗PD-1抗体这类免疫系统相关单克隆抗体的宿主具有可行性。转基因鼠体内与PD-1相关的PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK信号通路中PI3K/AKT和Ras的激活发生了变化，这种变化有可能是检测到的脾脏T细胞中的效应T细胞比例上升和Treg比例的下降以及IL-2、IFN-γ和IL-17的水平上升的相关因素，而未受影响的脾脏CD4⁺ T细胞增殖和IL-10、TGF-β1以及IL-4的表达可能与信号通路上其他分子未受影响有关，同时从表观上未观察到动物发生严重的健康问题。因此这种检测可以作为评估表达免疫类单克隆抗体的转基因动物宿主安全性的方法。本文通过对转基因小鼠中相关免疫信号通路分子、免疫细胞比例以及表达的细胞因子的检测得出了转基因小鼠作为表达抗PD-1抗体这类免疫相关抗体的可行性，也可以作为评估表达类似PD-1单克隆抗体的转基因动物安全性的手段，从而使转基因安全性评价体系更完善、更具有系统性。