环状RNA (circular RNA, circRNA)是新近发现的一类非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)，由前体mRNA (pre-mRNA)通过反向剪切形成，具有特殊的共价闭合结构，因缺少5′帽子和3′尾巴而耐受核酸外切酶消化。随着高通量测序技术和生物信息学的迅速发展，人们已在果蝇(Drosophila)^[1-2]、家蚕(Bombyx mori)^[3-4]和蚊子(Culicidae)^[5]等昆虫中鉴定出大量circRNA。近年来，国内外学者对蜜蜂circRNA进行了一些研究，发现circRNA可能参与调控蜜蜂的免疫应答^[6]、肠道发育^[7]和卵巢激活^[8]等生物学过程。笔者团队前期利用链特异性建库的RNA-seq技术预测和分析了意大利蜜蜂以及中华蜜蜂工蜂中肠的circRNA^[9]。CircRNA有多种发挥作用的方式，包括调节来源基因转录，作为“分子海绵”吸附miRNA，翻译蛋白或小肽等。目前，竞争性内源RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)机制是circRNA发挥作用的主要机制之一，在人类和小鼠等少数模式生物中被研究得较为深入^[10-13]。昆虫circRNA的功能和作用机制研究较为滞后，相关报道很少。Feng等^[14]利用RNAi探究朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)对丁氟螨酯的抗性，研究结果显示朱砂叶螨circRNA circ1-3p通过竞争结合miR-1-3p，减少该miRNA与其靶基因TcGSTm04的结合，证明了circRNA是通过ceRNA机制促进形成抗性调控通路；Zhang等^[15]发现家蚕BmNPV病毒转录的circRNA-vSP27可以编码为vSP27进而激活家蚕的NF-κB信号通路。然而到目前为止，蜜蜂circRNA的功能和作用机制研究仍然缺失。

意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica, 简称意蜂)是西方蜜蜂(Apis mellifera)亚种之一，具有蜜蜂群势强、蜂蜜产量高、分蜂性弱及区域分布广泛等优良性能，在养蜂生产中广泛使用，具有重要的生态、经济和研究价值^[16]。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)专性侵染蜜蜂幼虫导致白垩病，严重影响蜂群群势和生产力，给养蜂业造成较大损失。研究表明circRNA参与调控果蝇^[17]和家蚕^[15]等昆虫对病原胁迫的免疫应答。但circRNA是否及如何参与调节蜜蜂幼虫对蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答，目前尚不清楚。

前期研究中，笔者团队发现在蜜蜂球囊菌胁迫后期意蜂6日龄幼虫肠道内ame_circ_ 000115 (简称ac115)差异表达[log₂ (FC)=0.99, P < 0.001]且表达量较高(AmCK3_RPM=28 897.17, AmT3_RPM=57 266.71) (未发表数据)。在此基础上，本研究通过PCR和Sanger测序验证了ac115及其靶向miRNA的真实表达和存在，利用双荧光素酶报告基因系统验证ac115与靶miRNA之间的结合关系，进而通过饲喂跨反向剪切(back splicing, BS)位点的siRNA对蜜蜂球囊菌胁迫的意蜂幼虫ac115进行RNAi，并检测干扰ac115后宿主的免疫基因应答，以期揭示ac115通过miRNA调节宿主免疫应答的作用机制，并为意蜂幼虫-蜜蜂球囊菌的互作机制提供新见解。

意大利蜜蜂工蜂幼虫取自福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)蜜蜂保护课题组实验蜂群。蜜蜂球囊菌菌株由福建农林大学蜂学学院蜜蜂保护学实验室分离和保存^[18]。

根据ac115的序列设计跨BS位点的背靠背扩增引物(表 1)。使用RNA抽提试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]提取4日龄幼虫肠道样品(n=3)的总RNA，通过RNase R消化线性RNA后利用随机引物进行反转录，得到的cDNA作为模板进行PCR扩增，反应体系(20 μL)包括：PCR mix (擎科生物技术有限公司) 10 μL，背靠背扩增引物各1 μL，cDNA 1 μL，无菌水7 μL。产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后用核酸电泳检测仪进行观察，然后切胶回收目的片段，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。

选取外观健康且群势较强的3群意蜂蜂群，按照笔者所在团队已建立的技术流程进行幼虫的接种、饲养及肠道样品制备：(1) 用干净的移虫针将2日龄幼虫(n=96)小心移至已预置50 μL饲料(蜂王浆63%，蜂蜜6%，酵母粉1%，无菌水30%)的48孔细胞培养板，每孔1头幼虫，置于恒温恒湿箱，在(35±0.5) ℃和相对湿度(relative humidity, RH) 95%的条件下饲养1 d；(2) 配制终浓度为1×10⁷个/mL的蜜蜂球囊菌孢子饲料；接种组每头3日龄幼虫饲喂50 μL含孢子的饲料，24 h后饲喂不含孢子的饲料；未接种组3日龄幼虫始终饲喂50 μL不含孢子的饲料；(3) 在超净台中用干净的眼科镊和眼科剪分别剖取接种组和未接种组4、5和6日龄幼虫肠道，每个日龄均剖取3只肠道，置于1个RNA-free EP管，经液氮速冻后至–80 ℃超低温冰箱保存备用。上述实验进行3次生物学重复。

使用RNA抽提试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]分别提取接种组和未接种组4、5和6日龄幼虫肠道的总RNA，RNase R消化线性RNA后用随机引物进行反转录，得到的cDNA作为模板进行ac115的qPCR检测。同时利用Oligo dT和随机引物对未消化的总RNA进行反转录，得到的cDNA作为模板进行内参基因actin (Gene ID：406122)的qPCR检测。通过ABI QuantStudio 3荧光定量PCR系统[Applied Biosystems (ABI)公司]检测ac115的相对表达量。反应体系和程序参照郭睿等^[19]的报道进行设置。每个反应均进行3次技术重复和3次平行重复。采用2^–ΔΔCt法计算ac115的相对表达量。通过GraphPad Prism 7软件进行数据分析并绘图。采用Student’s t检验分析实验数据。

根据ac115序列设计背靠背位点的siRNA (siRNA-circ_000115)及与意蜂任何基因不存在靶向结合关系的阴性对照siRNA (siRNA- scramble)。委托上海吉玛制药技术公司合成上述siRNA。按照1.3节的方法将2日龄幼虫移至预置饲料的48孔培养板孔内，在恒温恒湿箱中饲养；利用50 μL含siRNA (1 μg)的饲料饲喂3日龄幼虫，每隔24 h重新饲喂50 μL含siRNA (1 μg)的饲料，即每头4日龄幼虫摄入的siRNA共计1 μg，每头5日龄幼虫摄入的siRNA共计2 μg，每头6日龄幼虫摄入的siRNA共计3 μg。

同时采用PCR和RT-qPCR检测ac115的RNAi效果，参照1.2节的方法剖取siRNA- circ_000115饲喂组和siRNA-scramble饲喂组4、5和6日龄幼虫肠道，提取总RNA并消化线性RNA，反转录及PCR扩增，产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后在核酸电泳检测仪下进行观察和拍照。按照1.3节的方法进行siRNA-circ_000115饲喂组和siRNA-scramble饲喂组4、5和6日龄幼虫肠道内ac115的RT-qPCR检测，每个反应均进行3次技术重复和3次平行重复，采用2^–ΔΔCt法计算ac115的相对表达量，通过GraphPad Prism 7软件进行数据分析并绘图，采用Student’s t检验分析实验数据。

本团队前期已利用small RNA-seq (sRNA- seq)技术对意蜂工蜂4、5和6日龄幼虫肠道样品进行测序，分别得到13 186 921、14 255 967和10 921 897条有效读段，经质控得到10 841 644、12 037 678和9 230 496条高质量测序读段，占比分别为82.22%、84.44%和84.51%，各组内生物学重复间的Pearson相关系数均在0.973 4以上^[20]。高质量的sRNA-seq数据可用于本研究中ac115的靶miRNA预测和分析。

参照郭睿等^[21]的方法，联用miRanda (v3.3a)、RNAhybrid (v2.1.2)+svm_light (v6.01)与TargetFind软件预测ac115靶向的miRNA，3种软件均采用默认参数。根据靶向结合关系构建ac115-miRNA调控网络，进而通过Cytoscape软件^[22]对调控网络进行可视化。

根据ame-miR-13b序列设计合成特异性stem-loop引物和上游引物及通用下游引物(表 1)。利用RNA抽提试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]提取3头意蜂4日龄幼虫肠道的总RNA，使用ame-miR-13b的stem-loop引物进行反转录得到相应的cDNA模板。再利用上下游引物进行PCR扩增。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶后回收目标片段。按祝智威等^[23]的方法进行目的片段的TA克隆与Sanger测序。

根据ame-miR-13b序列设计相应的模拟物(Mimic-miR-13b)，同时设计阴性对照Mimic (Mimic-negative control，Mimic-NC)委托上海吉玛制药技术公司合成。根据软件预测出ac115与ame-miR-13b的潜在结合位点序列，并克隆进pmirGLO载体，命名为pmirGLO-cir115-wt。同时设计合成上述结合位点的突变序列，并克隆进pmirGLO载体，命名为pmirGLO-cir115- mut。将菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序，测序正确的菌液转接新鲜LB液体培养基。使用去内毒素质粒提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)提取质粒。

将HEK-293T细胞铺至48孔细胞培养板，然后放入37 ℃培养箱继续培养24 h，使细胞密度达到90%−95%。按照Hieff Trans^TM Liposomal Transfection Reagent脂质体核酸转染试剂(上海翊圣生物科技有限公司)的说明书进行细胞转染实验，同时设置4个转染组：a组：Mimic- miR-13b与pmirGLO-cir115-wt共转染组；b组：Mimic-NC与pmirGLO-cir115-wt共转染组；c组：Mimic-miR-13b与pmirGLO-cir115-mut共转染组；d组Mimic-NC与pmirGLO-cir115-mut共转染组。每组转染200 ng质粒和20 pmol Mimic-miR-13b (或Mimic-NC)。转染完成后培养24 h，然后使用双荧光素酶检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)在GloMax化学发光检测仪上分别检测萤火虫萤光素酶及海肾萤光素酶的活力，计算萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶的比值得到相对表达倍数。该实验进行3次重复。

联用miRanda (v3.3a)、RNAhybrid (v2.1.2)+ svm_light (v6.01)与TargetFind软件预测ame-miR-13b靶向的意蜂mRNA (结合自由能 < –21 kcal/mol)，3种软件均采用默认参数。根据ac115和ame-miR-13b、ame-miR-13b和靶mRNA的结合关系构建ac115-ame-miR-13b- mRNA调控网络，再通过Cytoscape软件进行调控网络可视化。

筛选出宿主免疫应答相关的6个基因进行RT-qPCR检测，包括膜翅目抗菌肽基因hymenoptaecin、蜂蛾抗菌肽基因abaecin、防御素1基因defensin-1、转录因子相关基因dorsal、Toll通路相关基因cactus及蜕皮激素受体基因Ecr。根据上述基因序列设计合成相应的qPCR检测引物(表 1)。分别提取1.4节siRNA-circ_ 000115饲喂组和siRNA-scramble饲喂组6日龄幼虫肠道的总RNA，使用Oligo dT引物和随机引物进行反转录，将得到的cDNA作为模板，利用上述6个基因的特异性上下游引物进行qPCR检测。反应体系和条件参照吴鹰等^[24]的报道进行设置。每个反应均进行3次技术重复和3次平行重复。采用2^–ΔΔCt法计算免疫基因的相对表达量。通过GraphPad Prism 7软件进行数据分析并绘图。实验数据进行Student’s t检验。

背靠背引物扩增原理如图 1A所示。利用背靠背引物对ac115进行PCR扩增，产物琼脂糖电泳结果显示能够扩增出符合预期大小(约100 bp)的目的片段(图 1B)。进一步的Sanger测序结果显示，目的片段序列与二代测序结果完全一致且包含BS位点(图 1C)。上述结果证实了ac115表达和BS位点的真实性。

图 1 ac115的BS位点验证 Fig. 1 Validation of the BS site of ac115. A: Diagram of amplification with divergent primers. B: Agarose gel electrophoresis of PCR product. C: Sanger sequencing of target fragment; the black arrow indicates the BS site within ac115.

图选项

RT-qPCR结果显示相较于未接种组，接种组4日龄幼虫肠道内ac115的表达量极显著上调3.67倍(P < 0.000 1)，5日龄幼虫肠道内ac115的表达量显著上调5.09倍(P < 0.05)，6日龄幼虫肠道内ac115的表达量显著上调2.16倍(P < 0.05) (图 2)。

图 2 蜜蜂球囊菌胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫肠道内AC115的相对表达量检测 Fig. 2 Determination of relative expression of ac115 in 4-, 5-, and 6-day-old larval guts of Apis mellifera ligustica infected by Ascosphaera apis. Data ware subjected to Student's t test, *: P < 0.05, **: P < 0.01 and ****: P < 0.000 1.

图选项

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，siRNA-circ_000115饲喂组4、5和6日龄幼虫肠道内ac115的特异性条带亮度逐渐减弱，而siRNA-scramble饲喂组4、5和6日龄幼虫肠道内ac115的特异性条带亮度均较高且无明显变化(图 3A)。RT-qPCR结果显示相较于siRNA-scramble饲喂组，siRNA-circ_000115饲喂组4日龄幼虫肠道内ac115的表达量显著下调(P < 0.05)，干扰效率为35.17%；5日龄和6日龄幼虫肠道内ac115的表达量均极显著下调(P < 0.001)，干扰效率达到71.50%和73.50% (图 3B)。

图 3 饲喂siRNA后意蜂4、5和6日龄幼虫肠道内ac115的检测 Fig. 3 Detection of ac115 in 4-, 5-, and 6-day-old larval guts of Apis mellifera ligustica after feeding siRNA. A: Agarose gel electrophoresis of PCR products. Lane M: DNA marker; lane 1–3: 4-, 5- and 6-day-old larval guts in siRNA-circ_ 000115-fed group; lane 4–6: 4-, 5- and 6-day-old larval guts in siRNA-scramble-fed group. B: RT-qPCR determination of relative expression of ac115 in larval guts after feeding siRNA, *: P < 0.05, ***: P < 0.001 and ****: P < 0.000 1.

图选项

ac115共靶向17个miRNA，包括ame-miR- 10、ame-miR-1000、ame-miR-11、ame-miR-133、ame-miR-13a、ame-miR-13b、ame-miR-2、ame- miR-2944、ame-miR-3716a、ame-miR-3718a、ame-miR-3718c、ame-miR-3725、ame-miR-3762、ame-miR-6038、ame-miR-6039、ame-miR-9873和ame-miR-9896 (图 4)。鉴于笔者团队前期研究^[25]发现，意蜂幼虫肠道内ame-miR-13b负调控靶基因表达，选择ac115靶向的ame- miR-13b进行后续实验。

图 4 ac115及其靶miRNA之间的调控网络 Fig. 4 Regulatory network between ac115 and its target miRNAs.

图选项

利用Stem-loop RT-PCR对ame-miR-13b进行扩增，琼脂糖电泳结果显示能够扩增出符合预期大小(约60 bp)的目的片段(图 5A)。Sanger测序结果显示目的片段序列与sRNA-seq结果完全一致(图 5B)。上述结果证实了ame-miR-13b表达和序列的真实性。

图 5 ame-miR-13b的PCR扩增产物的琼脂糖电泳(A)和Sanger测序(B) Fig. 5 Agarose gel electrophoresis (A) and Sanger sequencing (B) of PCR product from ame-miR-13b.

图选项

Sanger测序结果显示ac115-wt与ac115-mut序列分别被克隆进pmirGLO载体，获得重组质粒pmirGLO-cir115-wt和pmirGLO-circ115-mut。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示，相比于Mimic-NC与pmirGLO-cir115-wt共转染组，Mimic-miR-13b与pmirGLO-cir115-wt共转染组的细胞荧光活性显著降低(P < 0.01)；相比于Mimic-NC与pmirGLO-cir115-mut质粒共转染组，Mimic-miR-13b与pmirGLO-cir115-mut质粒共转染组的细胞荧光活性无显著变化(P > 0.05) (图 6)。以上结果表明ac115与ame-miR-13b之间可能存在真实的结合关系。

图 6 ac115与ame-miR-13b结合关系的验证 Fig. 6 Verification of the binding relationship between ac115 and ame-miR-13b. The upper panel is result of Sanger sequencing of binding site between ac115 and ame-miR-13b as well as the sequence of the mutated binding site. The lower panel is result of dual-luciferase reporter gene system, a: Co-transfected cells with Mimic-NC and pmirGLO-cir115-wt; b: Co-transfected cells with Mimic-miR-13b and pmirGLO-cir115-wt; c: Co-transfected cells with Mimic-NC and pmirGLO-cir115-mut; d: Co-transfected cells with Mimic-miR-13b and pmirGLO-cir115-mut; **: P < 0.01; ns: P > 0.01.

图选项

靶向预测结果显示，ame-miR-13b共靶向91条mRNA。ac115、ame-miR-13b及靶mRNA之间形成一个较为复杂的调控网络(图 7)。进一步分析发现ac115可通过靶向ame-miR-13b进而结合Toll信号通路上的基因dorsal和Ecr。

图 7 ac115、ame-miR-13b及靶间的调控网络 Fig. 7 Regulatory network among ac115, ame-miR-13b and target mRNAs.

图选项

RT-qPCR结果显示，相较于siRNA- scramble饲喂组，siRNA-circ_000115饲喂组中的基因hymenoptaecin显著上调表达1.60倍(P < 0.05)，基因abaecin显著上调表达1.68倍(P < 0.05)，基因dorsal下调表达但组间差异不显著(P > 0.05)，基因defensin-1上调表达但组间差异不显著(P > 0.05)，siRNA-circ_000115饲喂组中的基因cactus下调表达但组间差异不显著(P > 0.05)，基因Ecr极显著下调表达0.48倍(P < 0.01) (图 8)。

图 8 干扰ac115后意蜂6日龄幼虫响应蜜蜂球囊菌胁迫的相关基因相对表达量检测 Fig. 8 Detection of relative expression of 6-day-old larval relative genes of Apis mellifera ligustica responding to the Ascosphaera apis infection after interference of ac115. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ns: P > 0.01.

图选项

目前，蜜蜂的circRNA研究总体有限，前人利用高通量测序技术和生物信息学预测出西方蜜蜂的大量circRNA，但经分子验证的西方蜜蜂circRNA仅有2条^[26]。笔者团队前期利用分子生物学方法验证了11条意蜂circRNA的BS位点^[27]。本研究中，PCR和Sanger测序结果证实了ame_circ_000115 (简称ac115)的BS位点真实性(图 1)，说明ac115真实存在，这为西方蜜蜂circRNA信息提供了有价值的补充。相比于未接种组，ac115在蜜蜂球囊菌接种组4日龄幼虫肠道内表达量极显著上调，在5和6日龄幼虫肠道内均显著上调(图 2)，暗示ac115参与宿主的胁迫应答。上述结果为持续深入开展ac115的功能和作用机制研究提供了依据。

CircRNA的功能研究主要集中于人类等极少数模式生物，昆虫的相关研究颇为滞后。前人通过饲喂或注射siRNA的方式成功实现对朱砂叶螨和家蚕等昆虫circRNA的干扰，例如Feng等^[14]研究发现饲喂特异性的siRNA- circ1-3p后，相较于siGFP饲喂组，siRNA-circ1- 3p饲喂组的朱砂叶螨体内的circ1-3p基因表达量显著性降低。蜜蜂circRNA的功能研究迄今尚无报道。本研究对蜜蜂球囊菌孢子接种后的意蜂幼虫连续饲喂siRNA，发现siRNA-circ_ 000115饲喂组4、5和6日龄幼虫肠道内ac115的特异性条带亮度逐渐减弱，而siRNA- scramble饲喂组4、5和6日龄幼虫肠道内ac115的特异性条带亮度均较高且无明显变化(图 3A)，表明饲喂siRNA-circ_000115干扰了ac115表达。此外，还发现相较于siRNA- scramble饲喂组，siRNA-circ_000115饲喂组4日龄幼虫肠道内ac115的表达量显著下调，5和6日龄幼虫肠道内ac115的表达量均极显著下调，干扰效率分别达到35.17%、71.50%和73.50% (图 3B)，且与朱砂叶螨circRNA的干扰效率相似^[14]。值得注意是的，本研究中ac115的干扰效率随着日龄增加而上升，表现出一定的累积效应。以上结果共同表明，通过饲喂siRNA的方法干扰意蜂幼虫肠道内的circRNA可行且高效。这是成功干扰蜜蜂circRNA的首例报道，为深入开展西方蜜蜂circRNA的功能研究提供了基础。

双荧光素酶报告基因系统是指以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种技术，常用于验证核酸之间的互作。笔者团队前期研究发现ac115共靶向17个miRNA (未发表数据)。本研究中，双荧光素酶报告基因试验结果证实ac115及其靶向的ame-miR-13b之间存在真实的结合关系(图 6)，说明ac115可能作为ceRNA吸附ame-miR-13b进而发挥作用。

Ecr被认为是调节节肢动物生长和发育的关键因子^[28]。本研究发现相较于siRNA- scramble饲喂组，siRNA-circ_000115饲喂组6日龄幼虫肠道内的Ecr基因极显著下调表达，与ac115的表达趋势一致，说明宿主通过ac115吸附ame-miR-13b进而调节基因Ecr表达。在昆虫中，Toll信号通路参与对革兰氏阳性菌和真菌的免疫应答。dorsal和cactus是Toll信号通路上的2个关键免疫基因。研究表明基因cactus在果蝇幼虫血细胞增殖和血细胞密度调节方面起到重要作用^[29]。在西方蜜蜂中，基因dorsal在细胞核中能够促进特定抗菌肽defensin-1的合成与分泌^[30]。本研究发现，ac115与dorsal存在靶向关系，但与cactus之间无靶向关系；相较于siRNA-scramble饲喂组，siRNA-circ_000115饲喂组6日龄幼虫肠道内的dorsal和cactus下调表达但组间差异均不显著(图 8)，说明在宿主ac115不通过ceRNA机制调节dorsal表达进而响应蜜蜂球囊菌胁迫，ac115也不影响cactus表达。

除了ceRNA机制，circRNA还能通过调控来源基因转录和编码蛋白或翻译产生多肽的方式发挥生物学功能^[31]。本研究发现相较于siRNA-scramble饲喂组，siRNA-circ_000115饲喂组6日龄幼虫肠道内的hymenoptaecin和abaecin基因的表达量均显著上调，defensin-1上调表达但组间差异不显著(图 8)，表明干扰ac115显著影响抗菌肽基因hymenoptaecin和abaecin的表达。鉴于ac115与上述3个抗菌肽基因均无靶向关系，推测宿主通过ac115经ceRNA机制外的其他方式调节hymenoptaecin和abaecin表达进而对蜜蜂球囊菌胁迫进行免疫应答，这需要进一步深入研究。

综上所述，ac115的BS位点真实存在，通过饲喂siRNA的方式能实现意蜂幼虫肠道内ac115的有效干扰，ac115通过吸附ame-miR-13b潜在调控Ecr表达，通过非ceRNA的方式调控hymenoptaecin和abaecin表达进而参与宿主免疫应答。