2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 岳威, 张炬庆, 吴晓龙, 杨昕淳, 沈巧艳, 于帅, 祝振硕, 王承宝, 张仕强, 华进联
- YUE Wei, ZHANG Juqing, WU Xiaolong, YANG Xinchun, SHEN Qiaoyan, YU Shuai, ZHU Zhenshuo, WANG Chengbao, ZHANG Shiqiang, HUA Jinlian
- 携带CD163报告载体的猪诱导多能干细胞株的建立
- Development of porcine induced pluripotent stem cells with a CD163 reporter system
- 生物工程学报, 2023, 39(1): 192-203
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(1): 192-203
- 10.13345/j.cjb.220288
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文章历史
- Received: April 12, 2022
- Accepted: July 29, 2022
引用本文
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2. 西北农林科技大学动物医学院 预防兽医系, 陕西 杨凌 712100
2. Department of Preventive Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi, China
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)主要感染家猪和野猪，自然靶标为巨噬细胞，从而摧毁整个免疫系统，每年对我国养猪业造成巨大损失。已证明原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage, PAM)是PRRSV的主要靶细胞[1]，但原代细胞存在分离过程繁琐、批次变异性大、费时费力、成本相对较高、不能连续传代、数量有限等问题[2-3]。利用猪诱导多能干细胞(porcine induced pluripotent stem cells, piPSCs)诱导分化为PAM为解决这一问题提供了新的策略。CD163是PRRSV重要的受体，也是PAM细胞的重要标记基因之一[3-4]，但是多能性干细胞本身不表达CD163。而在iPSCs诱导为巨噬细胞的过程中，内源性CD163必须被激活[5]，建立能精确指示CD163的iPSCs对整个诱导过程的建立与效率的优化具有重要意义。
由CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术自诞生以来，就迅速替代锌指核酸内切酶(zinc finger nuclease, ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技术，成为科学界的热门技术和研究领域。CRISPR系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统，可以在特异性RNA的介导下，精确识别并切割外源遗传物质[6]，在提供外源模板的情况下，可以实现基因组的精确改造。利用Cas9技术构建CD163报告载体能够实时指示CD163表达，可以不用终止诱导过程且直观地反映诱导效率，既省时省力，又能节约大量检测试剂，节约诱导成本。
诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是将外源转录因子导入体细胞后，重编程获得的具有胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)生物学特性的多能干细胞。iPSCs拥有自我更新和无限增殖的能力，还具有体内和体外分化成三胚层的能力，并且能够分化成各种组织细胞[7]。iPSCs作为体细胞来源的一类细胞，其不受限于伦理限制，还可以减少免疫排斥和生物安全问题[8]。通过iPSCs衍生的巨噬细胞为诱导巨噬细胞研究提供了一个可行的替代方法。即使并不是所有细胞都能够以相同的诱导效率获得，但是免疫细胞如巨噬细胞和自然杀伤者(natural killer cell, NK)细胞，可以比较容易地从多能干细胞中产生[9]。诱导多能干细胞向巨噬细胞分化的方法有拟胚体生成法[10-11]、分步诱导法[12-13]和共培养诱导法[13-14]等。原代PAM存在分离过程繁琐、批次间重复性差、费时费力、分离成本高、不能连续传代、数量有限等问题[15]，如果能利用piPSCs这一特性将其向巨噬细胞诱导，将为PRRSV与免疫细胞的互作研究提供新希望。本研究通过构建CD163报告载体后，利用载体上带有的抗性标记筛选得到纯化的CD163 reporter-iPSCs，研究该细胞系可否实时指示细胞内源CD163表达的情况，而又不影响猪诱导多能干细胞的多能性，希望为猪诱导多能干细胞诱导为巨噬细胞奠定前期实验基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料T2A-H2B-mCherry序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PX459质粒和猪PAM原代细胞由本实验室保存。
1.2 实验试剂蛋白示踪上样缓冲液，购自西安晶彩生物科技有限公司；RNAiso，购自TaKaRa；SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) (FP205)，购自天根生化科技(北京)有限公司；DMEM High Glucose，购自HyClone；DMEM、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶、Opti-MEM、胎牛血清(FBS) (10270)，购自Gibco；NaHCO3，购自Sigma；Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit (100T)，购自锐博生物科技有限公司；PEI，购自Thermo Scientific；Tryp LE，购自Thermo Scientific；Mitomycin C，购自上海热默尔生物有限公司；CHIR99021 (S2924)，购自Selleck；SB431542 (S1067)，购自Selleck；rh-Lif (Lif1050)、rh-bFGF (GF003)，购自Millipore。
1.3 实验方法 1.3.1 CD163报告载体的构建在CRISPOR DESIGN网站(http://crispor.tefor.net/)设计sgRNA，将其通过酶切连接到pX459载体上，命名为psgCD163-PX459。将T2A-H2B-mCherry序列和CD163终止密码子两侧的同源臂序列连接到pUC19载体上，命名为Donor-pCD163-mCherry-WPRE。将制备好的质粒进行Sanger测序。
1.3.2 电转染猪原代肺泡巨噬细胞或猪诱导多能干细胞在转染前2 d解冻，在6 cm培养皿中培养，当细胞密度达到约2×106个/mL时，通过胰蛋白酶消化(1 000 r/min, 4 min)收集细胞，并用Opti-MEM (Invitrogen公司)洗涤细胞2次，向离心管中加入电转染溶液和质粒(20 μg)的混合物，吹打混匀。将上述细胞悬液转移到BTX电击杯中，并静置10 min。用180 V、10 ms脉冲时间电击细胞。让细胞静置10 min，并将细胞悬浮液加入到6 cm的培养皿中。加入预热为37 ℃的4 mL 10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基。培养基置于37 ℃ CO2培养箱中，体积分数为5%。2 h后，将细胞贴壁，弃去培养基，代之以37 ℃温育的RPMI1640完全培养基。24 h后，观察荧光情况。所用的统计方法是算术平均法，取3个随机视野的平均值。
1.3.3 免疫荧光染色在48孔板中的饲养层细胞铺展后，丢弃原始培养基，加入400 µL piPSCs培养基和1.6 µL DOX，并将piPSCs接种在Feeder上以继续培养。每24 h用新的piPSCs培养基更换培养基，并加入1.6 µL DOX。当piPSCs生长到60%时，弃去培养基，用PBS洗涤3次；加入200 µL 4%多聚甲醛固定12 min，弃去上清液，用PBS洗涤3次；加入0.1% Triton-100打孔10 min，弃去上清液，用PBS洗涤3次。在室温下加入10%胎牛血清1 h，然后在4℃孵育抗体过夜。弃去一抗，用PBS洗涤3次；室温避光孵育二抗1 h，用磷酸缓冲盐(phosphate-buffered saline, PBS)洗涤3次；室温避光10 min，用Hoechst 33342染色细胞核，弃去染色液，用PBS洗涤3次；在荧光显微镜下观察并拍照。
1.3.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)按照每个样品加入10 µL 2×SuperReal PreMix Plus，0.8 µL cDNA模板(1 µg/µL)，0.6 µL正反向引物(10 µmol/L)，8 µL ddH2O的反应体系配制混匀后，参照ChamQ SYBR qPCR Master Mix (南京诺唯赞，Q321-02) PCR程序进行实时荧光定量PCR。
1.3.5 饲养层细胞(feeder)的制备和培养将新分离或冷冻的MEF细胞接种在100 mm培养皿中，每天换液，直到细胞密度超过90%。7.5 µg/mL丝裂霉素C，处理3 h。PBS洗涤2–3次，0.25%胰蛋白酶消化至单细胞，中和，1 200 r/min离心。DMEM培养基重悬，计数以每个12孔接种1×105个细胞，接种在新培养板上。
1.3.6 Dox-piPSCs培养每个12孔接种2×104个piPSCs接种在铺好饲养层细胞的12孔板中。当piPSCs生长到60%时，Triple消化成单细胞，用DMEM培养基进行中和。1 200 r/min离心5 min，弃上清，重悬以每个12孔接种2×104个细胞接种到铺满饲养层细胞的12孔板中，继续培养。
1.3.7 293T细胞培养用DMEM培养基(含10% FBS)进行培养至细胞长满到90%左右。用PBS洗涤后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶成单细胞(37 ℃、5 min)消化，加入等体积的DMEM培养基进行中和，并以1 200 r/min离心5 min。弃上清，用1 mL DMEM培养基重悬细胞，在新的60 mm培养皿中接入适量的细胞，并在进行随后的慢病毒包装分析之前，回收复苏后培养3代的HEK293T细胞用于下一步试验。
1.3.8 慢病毒包装和攻毒转染首先，将HEK293T细胞接种于6孔板上，培养至细胞长满至80%–90%。将1 µg病毒包装载体(pVSV-G和psPAX2)和2 µg慢病毒骨架载体(donor-pCD163-mCherry-polyA-EF1α-PURO- WPRE)在12 µL PEI (1 mg/mL)中稀释混匀后，将质粒混合物加入200 µL optiMEM中，旋涡混匀后室温孵育15 min，将其加入细胞培养基。12 h后更换DMEM培养基，培养细胞48–72 h后4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液(慢病毒颗粒)，0.45 µm滤器过滤清除细胞碎屑，得到慢病毒颗粒。然后接种2× 104 piPSCs在铺满feeder的12孔板中培养12 h后，将慢病毒颗粒与piPSCs培养基按1:1 (体积比)混匀，并加入4 µg/mL的聚凝胺。在混合培养基转染piPSCs 8–12 h后，弃去培养基，加入新的piPSCs培养基继续培养。待piPSCs生长至60%后，消化传代并在piPSCs培养基中加入10 µg/mL的嘌呤霉素(puro)，筛选出puro阳性的细胞克隆命名为CD163-REP-piPSCs。
2 结果与分析 2.1 CD163报告载体的构建及验证CD163报告载体的作用模式如图 1所示，利用特异性靶向猪CD163终止密码子附近的sgRNA造成双链断裂，T2A-RFP-PURO的表达框在两侧同源臂的指导下，整合入piPSCs的基因组。供体质粒如图 1所示，载体上带有嘌呤霉素抗性标记，以便于后期细胞筛选。我们首先检测CD163报告载体能否正常工作。结合之前的研究和我们的qRT-PCR检测结果，与piPSCs相比，PAM中CD163高表达(图 2B)。对成年猪肺切片进行免疫荧光染色(图 2C)，结果表明，在猪的肺泡中存在高度表达CD163的细胞。对体外分离的原代PAM细胞的免疫荧光染色实验进一步验证，CD163在PAM中是高表达的(图 2D)。
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| 图 1 CD163报告载体的作用模式图 Fig. 1 Action pattern diagram of CD163 report carrier. |
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| 图 2 CD163报告载体的构建及验证 Fig. 2 Construction and verification of the CD163 reporter vector. A：CD163报告载体的图谱. B：从mRNA水平定量检测PAM细胞和piPSCs的CD163表达效率. ***: P < 0.001. C：免疫荧光染色检测成猪肺切片中CD163表达情况. Scale bar=400 μm. D：免疫荧光染色检测PAM中CD163和CD203的表达. Scale bar=400 μm A: The map of CD163 reporter vector. B: The expression level of CD163 in PAM cells and piPSCs detected by qRT-PCR. ***: P < 0.001. C: The expression of CD163 in pig lung detected by immunofluorescence staining. D: The expression of CD163 and CD203 in PAM detected by immunofluorescence staining. Scale bar=400 μm. |
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虽然原代PAM能够表达CD163，但是外源载体很难通过转染进入PAM。因此，我们通过电转染的方式将CD163报告载体转染进PAM原代细胞。为了探索最佳的电转染体系，使用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)载体来进行体系摸索，结果表明PAM的最佳电转染参数为180 V、10 ms。随后，将CD163报告载体电转染入原代PAM中，观察到有部分表达红色荧光的细胞，对表达红荧光的细胞进行CD163的免疫荧光复染(图 3)，结果表明，CD163报告载体能够正常工作。
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| 图 3 报告载体转染入PAM及检测 Fig. 3 CD163-reporter was electrotransfected into PAM and analyzed by CD163 immunofluorescence. A：CD163抗体免疫荧光染色检测PAM细胞. B：CD163报告载体(RFP)电转染至PAM细胞呈红色荧光. C：Hoechst33342显核染色. D：Merge. Scale bar= 400 μm A: CD163 immunofluorescence staining for PAM (green). B: The CD163-reporter electrotransfected PAM (red); C: Hoechst33342 staining of the CD163-reporter electrotransfected PAM (blue). D: Merge of A, B and C. Scale bar=400 μm. |
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将CD163报告载体通过脂质体转染的方式导入piPSCs中，并利用载体上的嘌呤抗性筛选细胞，收取纯化细胞基因组进行PCR检测，结果表明，我们成功将载体插入序列整合到了piPSCs的基因组中(图 4A)，将正确的条带切胶回收并送公司测序且测序结果正确(图 4B)。至此，我们成功筛选到插入CD163报告载体的piPSCs (CD163 reporter-piPSCs)。
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| 图 4 piPSCs-CD163-Reporter细胞系的构建 Fig. 4 Construction of piPS-CD163-reporter cell lines. A：PCR检测CD163报告载体成功转入piPSCs中. B：测序结果及比对 A: CD163 reporter vector successfully transferred into piPSCs by PCR. B: The cDNA with correct molecular weight were recycled and the sequencing results were compared. |
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我们构建含CD163报告载体的细胞系的目的是能够实时指示piPSCs向PAM细胞的分化情况，因此，该报告载体不能影响piPSCs的多能性，我们需要进一步检测CD163 reporter- piPSCs的多能性和增殖能力是否受到影响。通过碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase) (图 5A)和qRT-PCR检测多能基因(图 5B)以及对多能基因的蛋白进行免疫荧光染色(图 5C)来判断细胞的多能性情况。检测结果表明，CD163 reporter-piPSCs的多能性与对照组相比并无显著变化。然后我们又通过群体倍增时间(图 5D)和EDU染色(图 5E)探究细胞增殖能力，结果证明CD163报告载体对piPSCs的增殖能力并无明显影响。
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| 图 5 CD163报告载体不影响piPSCs的多能性 Fig. 5 CD163 reporting vector does not affect the pluripotency of piPSCs. A：对照组和CD163报告系统组的AP染色情况. Scale bar=400 μm. B：实时荧光定量PCR检测对照组和CD163报告系统组的多能性基因表达量. C：免疫荧光染色检测对照组和CD163报告系统组多能基因表达量. Scale bar=200 μm. D：对照组及CD163报告系统组的piPSCs群体倍增时间. E：对照组和CD163报告系统组的EdU染色结果. Scale bar=400 μm. F：EDU染色结果的量化 A: Control group and CD163 report system group analysed by AP staining. Scale bar=400 μm. B: Real-time fluorescence quantitative PCR detection control group and CD163 report system group of pluripotency gene expression. C: Quantity analysis the pluripotency gene expression in control and CD163 reporter system group by immunofluorescence. Scale bar=200 μm. D: The multiplication time of the control group and the CD163 report system group. E: The EDU dying result of the control group and the CD163 reporter system group. Scale bar=400 μm. F: Quantification of EDU staining results. |
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猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒是危害全世界养猪业的重要病原，特别是在高致病性PRRSV出现之后，我国养猪业面临问题更加突出，给我国养猪业带来了严重打击[16-18]。而PRRSV的病理研究与疫苗生产都依赖于PRRSV易感细胞的大量扩增。在病毒的细胞嗜性方面，PRRSV除了EAV具有相对广泛的细胞嗜性之外，其他病毒只有少数细胞能够支持病毒复制。目前，PRRSV在体内已知的靶细胞仅限于PAM细胞、分化的血液单核细胞(blood monocytes, BMo)[19]、树突状细胞(dendritic cells, DC)，以及一些特定的骨髓细胞(bone marrow cells, BM)[20]。虽然体外细胞系MA-104 (来源于非洲绿猴肾细胞)与MARC-145 (MA-104的克隆株)是PRRSV的易感细胞，也被广泛应用于PRRSV的相关研究[21]。但是这些细胞系起源于非洲绿猴细胞，能否真实反映其宿主感染细胞的情况值得商榷。原代PAM是PRRSV感染的主要靶细胞，是作为研究PRRSV的最佳细胞模型。但是原代细胞仍存在明显弊端，包括难于再现性、批次变异、费力且昂贵的细胞提取以及动物福利等问题，在体外无法扩增，只能用于基础研究，无法实现工业化批量生产等。永生化建系的细胞虽然保留了巨噬细胞的部分标记基因的表达，但是其CD163表达丢失，也完全丧失了其成熟巨噬细胞的大多数特性，因此不能被PRRSV感染。通过piPSCs向PAM分化，是研究PAM与PRRSV的一种新方法。然而目前诱导多能干细胞向巨噬细胞分化的效率较低、检测繁琐，而采用报告系统能够实时标记其诱导分化过程具有重要的科学意义。
最近研究显示，来自细菌的Ⅱ型聚类的规则间隔的短回文重复序列和来自细菌的Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)系统被重新用作哺乳动物细胞中基因组编辑的强大工具[22-24]。当与反式激活域融合时，Cas9的一种失活形式即dCas9被设计为可编程合成转录因子，被称为CRISPR激活(CRISPRa)系统[25-28]。因此，我们可以利用这个激活系统对靶基因进行报告和激活。
由于CD163为PAM细胞的标志性基因，在诱导过程中CD163的表达是必不可少的，本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了CD163报告载体，能够实时指示CD163的内源激活，从而反映piPSCs的诱导效率，优化诱导体系可达到省时省力的效果。
piPSCs是将经典转录因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC通过慢病毒转导至猪胎儿成纤维细胞诱导得到的多能干细胞。piPSCs能够自我更新和维持未分化状态，还具有无限增殖的能力[8, 29-30]。近年来，研究表明CD163、CD151、Vimetin、DC-SIGN和CD169是潜在的PRRSV病毒受体，这些受体在PRRSV侵入细胞的过程中发挥重要作用。越来越多的研究显示，CD163为PRRSV最关键的受体，且CD163为肺泡巨噬细胞的重要标记基因[31]。以前有研究表明，将猪CD163受体导入猪肾细胞(PK15)，可使猪肾细胞感染PRRSV[32]。基于多能干细胞拥有这些良好的特性，如果能够通过piPSCs诱导得到猪PAM将为疫苗生产、病毒与宿主互作研究等提供绝佳的研究平台。
我们成功构建了CD163报告系统之后，还可以利用这个体系构建其他基因的报告系统，实现不同基因在piPSCs上的内源性报告，这样可以很大程度上提高诱导过程的准确性和效率。为之后的猪多能干细胞向巨噬细胞的高效诱导奠定基础。在piPSCs向PAM诱导过程中，报告载体不能够影响piPSCs的多能性和其无限增殖的能力，否则诱导过程和piPSCs的生物学特性将会受到影响。因此，我们通过AP染色、多能性标记Oct4、Sox2、Sall4表达水平、群体倍增时间检测和EDU染色等检测手段，分析了成功转入CD163报告系统的piPSCs的多能性和增殖能力，发现其多能性和增殖能力均不受影响。这表明该报告系统既能够起到实时指示CD163的作用，又不会影响piPSCs自身的生物学特性。
4 结论本研究构建了CD163报告载体并确定PAM细胞合适的电转染参数，将CD163报告载体电转染进PAM细胞中后，利用免疫荧光染色对电转染后的原代PAM细胞进行复染，经验证CD163报告系统能够正常工作。此外，我们成功筛选到CD163 reporter-iPSCs；通过AP染色、RT-PCR和免疫荧光染色检测多能基因和检测群体倍增时间及EDU染色，说明CD163报告系统对piPSCs的多能性和增殖无影响。
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