2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 姚夏, 胡潇予, 王晓祺, 葛璟燕
- YAO Xia, HU Xiaoyu, WANG Xiaoqi, GE Jingyan
- 无细胞系统在CRISPR技术和生物传感器中的应用研究进展
- Application of cell-free transcription and translation system in CRISPR technologies and the associated biosensors
- 生物工程学报, 2023, 39(1): 86-102
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(1): 86-102
- 10.13345/j.cjb.220347
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文章历史
- Received: April 30, 2022
- Accepted: October 18, 2022
引用本文
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无细胞转录翻译系统(cell-free transcription and translation, TXTL)主要利用活细胞提取物成分，通过加入转录翻译机制所需要的原料及DNA模板，使蛋白质在体外快速合成[1-3]。该系统主要由3个部分组成：细胞提取物(核糖体、RNA聚合酶及其他转录和翻译辅助蛋白)、用于蛋白质合成的补充辅因子反应混合物(氨基酸、多肽、能源、代谢辅因子等)和从质粒DNA或聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)获得的线性模板(图 1)。目前，已经开发出多种基于真核生物和原核生物细胞提取物的TXTL，如实验室中最常用的微生物模式菌株大肠杆菌[4]、酿酒酵母[5]等系统，植物中的小麦胚芽系统，动物中的兔网织红细胞，中国仓鼠卵巢细胞以及昆虫系统[6-7]。其中，基于大肠杆菌提取物的TXTL因其易于生产、蛋白表达量高的特点而得到最为广泛的应用，但是在翻译后修饰和其他复杂蛋白质合成方面存在局限性；基于动物细胞的TXTL具有翻译后修饰功能，可以表达膜蛋白等其他复杂蛋白，但是蛋白产量较低且生产成本更高，因此应用较少。尽管各种无细胞系统各有利弊，近年许多公司如Arbor Science、Creative Biolabs、Promega已经在不断改进技术实现蛋白质的高表达和TXTL的商业化。随着技术的发展，TXTL已逐渐成为一种多功能工具，特别是利用大肠杆菌细胞提取物构建的无细胞蛋白合成系统(cell-free protein synthesis, CFPS)[8]，已被广泛用于clusterd regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)系统的表征、基因回路设计[9]、生物传感器的开发[10-11]等合成生物学领域中。
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| 图 1 无细胞系统的组成 Fig. 1 The components of cell-free transcription and translation system. |
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CRISPR/Cas系统，一种来自细菌的适应性免疫防御系统[12]，可以识别并抵御携带遗传信息的入侵核酸序列，如噬菌体和质粒[13-14]。近年来该技术发展迅速，几乎可以用于靶向所有的基因组[15-16]，成为了一种革命性的基因编辑工具[17-19]。目前已经报道了许多基于CRISPR技术的检测方法，相关的生物传感器在病原体等核酸检测方面呈现了高灵敏度、快速反应等优良的性能[20-22]。然而，CRISPR检测技术的灵敏度和准确度受CRISPR系统自身元件的影响，如gRNA和原始间隔邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)位点的特异性。在实验室中，对这些元件的表征需要烦琐的实验步骤(细菌培养转化以及蛋白纯化)，耗时较长。TXTL作为一个快速、精确的体外蛋白表达平台，可以实现1−16 h内从DNA转录翻译为蛋白质，无需活细胞参与和冗长的实验过程，极大提高了CRISPR系统的表征和元件验证的速度，如PAM位点的快速筛选[23-25]、向导RNA (guide RNA, gRNA)的设计表达[26-28]和抗CRISPR蛋白的表征筛选[9, 29-30]。在此基础上，研究人员还开发出TXTL与CRISPR相结合的生物传感器，将CRISPR系统与核酸开关、基因回路、试纸材料等结合，使CRISPR传感器的应用能力极大提高，不再局限于实验室和专业仪器人员，检测对象除了核酸外，也可以检测小分子物质[31]，极大地扩展了CRISPR检测系统的应用范围和传感器的灵活度。
无细胞生物传感器通常由检测对象、检测手段和信号输出组成，需优化系统稳定性和鲁棒性[32-33]。其中，检测手段的选择影响了检测对象的类别和信号输出的范围。目前，基于CRISPR/Cas13的specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing (SHERLOCK)[21]、SHERLOCKv2[34]和heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases (HUDSON)[35]技术已经显示出CRISPR/Cas系统在核酸检测方面的巨大潜力。以TXTL作为反应平台，将CRISPR传感器与生物材料结合，开发出基于纸张[22]和可穿戴式材料[36]的CRISPR生物传感器，便于实际应用；也可以与可编程的gRNA[26-28]和toeholdswitch[37]等工程化基因回路结合，使得传感器呈现布尔逻辑，易于调控。
因此，本综述聚焦TXTL与CRISPR技术的结合，首先整理了近年TXTL对CRISPR系统各部分的表征，然后对在生物传感器方面的应用进行归纳总结。最后，我们将讨论如何突破实验室仪器和专业人员的限制，拓展传感器应用场景，实现便携快速的即时检测(point-of-care testing, POCT)。
1 利用无细胞系统表征CRISPR/Cas系统CRISPR/Cas系统作为细菌和古生菌的适应性防御系统，依赖一种特定RNA引导的核酸酶，靶向并切割特定的DNA或RNA，从而识别来自同一入侵者的再次攻击[38]。该系统根据其结构和功能的差异性分为2大类，包括6种类型和33个亚型[12]。本节将重点总结基于大肠杆菌提取物TXTL对CRISPR系统中各部分的检测表征，包括PAM序列的表征、gRNA的设计和快速筛选、不同Cas蛋白的表达和抗CRISPR蛋白的筛选等。
1.1 PAM序列整个CRISPR系统有超过30种不同的Cas蛋白，除Ⅲ型外，其余的CRISPR/Cas系统都需要一个PAM或PAM相关序列才能有效地切割目标DNA[24, 39]。PAM序列是一段短的DNA序列，通常为2−6个碱基对，一般在Cas蛋白切割位点下游，参与切割前的定位识别过程。因此，解析Cas蛋白特异性识别的PAM序列是揭示其特征的关键步骤之一，且对预测系统的脱靶效应也至关重要[40]。
目前，体外检测方式一般需要克隆和纯化系统中的Cas蛋白和对gRNA进行体外转录(in vitro transcription, IVT)，纯化过程可能引起Cas蛋白的失活、IVT的多步骤等问题，亟需开放高通量、大规模并精准性的快速筛查方法[23, 25]。2018年，美国明尼苏达大学的Noireaux课题组构建了PAM文库，利用TXTL原位表达Cas蛋白、gRNA和文库，对带有特异的PAM序列的核酸进行切割后，采用PCR扩增和下一代测序技术进行测序，从而确定Cas蛋白对PAM序列的识别程度(图 2A)[9]。同时期，德国亥姆霍兹研究学院的Beisel课题组通过在PAM序列下游引入启动子和报告基因deGFP序列，利用荧光强度分析Cas蛋白的切割效率和速度，极大地加快筛选新型CRISPR-Cas工具的作用模式[23]。近日，该课题组又开发了基于TXTL的多亚基效应物Ⅰ型CRISPR系统的PAM表征工具“PAM-DETECT”[41] (图 2B)，对Ⅰ型CRISPR系统中不同亚类和CRISPR转座子(CRISPR-associated transposons, CASTs)的PAM位点进行表征，发现了I-B型CRISPR转座子的一个新的分支RoCAST，进一步完善了体外的高通量表达PAM序列方式。
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| 图 2 利用TXTL对PAM位点进行表征与筛选[9, 41] Fig. 2 Schematic representation of characterization and screening of PAM sites using a cell-free system[9, 41]. A: Schematic of a TXTL-based cleavage assay to determine the PAM sequences recognized by Cas nucleases. B: DNA components added to a TXTL reaction to perform PAM-DETECT. The cascade genes can be encoded on separate plasmids, as shown here, or as an operon. |
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在CRISPR/Cas系统中，gRNA可以引导Cas蛋白对目标核酸序列进行识别和切割，其序列可分为2个部分：可变的间隔(spacer)序列和保守的scaffold序列[42]。spacer序列与靶向的目标序列互补，且识别序列与Cas蛋白活性相关，因此，设计并筛选出一条高特异性的gRNA是决定CRISPR系统灵敏度和脱靶率的关键[43]。目前，TXTL在筛选gRNA方面已逐渐成为一亮眼的工具。2018年，Noireaux课题组根据不同的PAM序列(NGG、NAG)分别设计了靶向deGFP序列上游的启动子、核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)和deGFP基因序列不同位置的gRNA，以在TXTL系统中反应16 h后deGFP的荧光强度作为指示，进行高通量筛选，快速得到高特异性的gRNA[9] (图 3)。
另外，为了实现对CRISPR系统的时序性调控，研究人员相继报道有关gRNA的设计方案。目前较为常见的是在gRNA/crRNA前的5′端或3′端添加序列后，将其改造成RNA/DNA响应的核酸开关。2018年，我国清华大学的Li课题组通过在单向导RNA (single guide RNA, sgRNA)的scaffold序列的第一个颈环和3′末端分别添加额外的序列，设计了一种与目标RNA杂交后才能与Cas9结合的sgRNA (mRNA-sensing gRNA, msgRNA)[28] (图 4A)，可用作RNA传感器，实现了利用CRISPR/Cas9响应输出正交检测多个mRNA输入。2020年，英国华威大学的Jaramillo课题组提出了一种简单且长度更短的sgRNA设计(RNA-interacting guide RNA, igRNA)[26]。他们通过在sgRNA的5′末端添加额外序列，使spacer序列在无目标RNA的情况下呈双链状态，无法与靶标DNA结合，从而使需要特异性RNA序列激活的基因的靶向成为可能，并可应用于体外传感器和诊断工具的开发(图 4B)。2021年，Beisel课题组改造了crRNA，使其成为可以响应不同核酸序列的gRNA开关(图 4C)，并用来检测在阿拉伯糖或铁离子存在的生长条件表达的内源性RNA，使Cas12的靶向活性依赖于细胞代谢和应激，从而使传感器与细胞状态绑定[27]。该设计具有普适性，也可以应用于分子检测、抗耐药基因等领域。得益于碱基互补配对原则，这些设计对目标序列具有高度特异性，但它们的灵敏度和最低检测限度仍有待探索。
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| 图 4 gRNA被设计为核酸开关的不同方法[26-28] Fig. 4 The different approaches of gRNA designed as riboswitches[26-28]. A: Schematic representation of gRNA in its inactive state, RNA trigger and activated gRNA after hybridization with the RNA trigger. B: Schematic representation of the structure of msgRNA with RNA trigger sensing region embedded and expected structural change of msgRNA in the presence of trigger. Trigger RNA interacted with the region of msgRNA and anti-mRNA sensing region was displaced by mRNA. msgRNA structure refolds with mRNA tagging along at the 3′ end. C: Architecture and intended conformational states of the gRNA switch. In the absence of an RNA trigger (Off state), the clamp base pairs with the Cas12a handle, disrupting its formation and subsequent recognition by Cas12a. In the presence of an RNA trigger (On state), the base pair with the RNA trigger, leading to an energetically favorable conformation wherein the Cas12a handle re-folds and can be recognized by Cas12a. |
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在TXTL中最先得到表达的是研究较为广泛和完善的Cas9/dCas9蛋白[9]，随后V-A型的Cas12a蛋白也在TXTL中得到表达和检测[27]。Cas12a与Cas9不同，Cas12a识别目标序列5′端的PAM序列TTN，而Cas9识别3′端的NGG[43]。先前的研究表明Cas12a的催化失活变体dCas12a能够在细胞中进行可编程的基因抑制[44]，但抑制效果比Cas9更弱。
除了对CRISPR系统中单核酸酶进行表达之外，TXTL还实现了对多核酸酶的表达。比如，来自大肠杆菌K12品系的I-E型CRISPR/Cas系统(EcCascade)主要由8个cas基因(cas3、casA、casB、casC、casD、casE、cas1和cas2)和CRISPR阵列构成[45] (图 5)。CasA-E蛋白会组合成一个复合体cascade，结合crRNA沉默目标序列，并引导Cas3行使切割功能。相较于Ⅱ型系统，I-E型系统需要表达的蛋白更多，在胞内会更难表征[46]。但在TXTL中，Noireaux课题组将cascade序列基因克隆在T7启动子后即可实现表达。为了验证其功能，他们在体系中加入crRNA序列和靶向基因序列(P70a-deGFP)的质粒，实现了对目标基因的有效抑制，且抑制效果比Cas9更强[9]。
1.4 抗CRISPR蛋白的表达
抗CRISPR蛋白是噬菌体用以对抗细菌和古生菌CRISPR系统的蛋白。越来越多的CRISPR系统被发现意味着有更多的抗CRISPR蛋白，而不同的抗CRISPR蛋白抑制CRISPR系统的不同部分[30]。例如，一些抗CRISPR蛋白与Cas蛋白结合，阻断其靶向和结合DNA的能力，一些抑制Cas蛋白聚集潜在的新的间隔序列，还有一些与Cas蛋白结合，抑制其切割结合的目标DNA[29]，进一步影响CRISPR系统调控基因和水平转移的能力[47-49]。但是目前发现的抗CRISPR蛋白缺乏明显的共性特征，这使得研究抗CRISPR蛋白变得更加困难。
胞内验证一抗CRISPR蛋白需要将其基因克隆到一个表达载体上，并转化到细胞中再进行检测。因此，当面对一个蛋白库的验证时，这个过程无疑是费力和复杂的。而在TXTL中，只需要放入含抗CRISPR蛋白基因的质粒或线性DNA片段，同时CRISPR系统靶向荧光报告基因，通过检测荧光强度便可对抗CRISPR蛋白进行功能表征和验证，因此，TXTL为潜在的抗CRISPR新蛋白的快速的表征和挖掘提供了平台。2018年，Noireaux课题组率先实现了在TXTL中CRISPR蛋白的表达和功能性验证，将当时胞内验证的活性最高的抗CRISPR蛋白AcrIIA2和AcrIIA4[50]在TXTL中成功进行表征，发现这2种蛋白可以阻遏Cas蛋白靶向deGFP基因序列，使得绿色荧光蛋白正常表达[9]。整个表达过程仅需18 h，极大地减少了抗CRISPR蛋白表达的时间，且证实了TXTL是快速表征抗CRISPR蛋白的平台。在此基础上，该课题组又对抗CRISPR蛋白库进行测试，将不同的Cas蛋白与抗CRISPR蛋白库组合，根据荧光强度的变化识别出抗CRISPR蛋白的不同活性和特异性。根据这个方法，2019年加拿大多伦多大学的Maxwell课题组使用TXTL测试了预测的基因片段中是否有抗CRISPR蛋白基因的存在，最后在67个基因片段中得到了3个针对Cas12a的抗CRISPR蛋白基因(AcrVA1、AcrVA4和AcrVA5)[29]。
2 以无细胞系统为基础的CRISPR生物传感器生物传感器是以生物成分为主要功能元件，用于快速检测各种痕量分析物的分析工具[32]。CRISPR/Cas系统基于其特异性识别核酸序列的特性，与生物传感器的理念相结合已被广泛用于核酸检测中。但是，检测过程一般需要依靠实验室器材和专业人员操作，在实际诊断和检测环境中缺少将样品处理、核酸扩增、Cas反应、信号检测等功能模块集成的仪器，且难以保持Cas蛋白和gRNA的稳定活性[51]。TXTL作为体外表达蛋白的反应环境，为CRISPR生物传感器实现实地体外诊断(in vitro diagnosis, IVD)提供了一个良好的平台，且通过冻干等技术使传感器附于生物材料上，便于运输和携带，常温下从质粒或DNA片段转录翻译为蛋白质使得检测系统可以最大限度保持活性，突破实验室专业设备和场地的限制。虽然在检测灵敏度方面仍不及传统的实验室CRISPR检测技术，但是这些方法实现了对原始样本如唾液[22]和血液[52]直接进行检测并呈现可视化结果，说明TXTL的引入为CRISPR生物传感器的实地应用提供了极大的可行性(表 1)。本节将重点讨论传统的CRISPR生物传感器及引入TXTL后拓展CRISPR检测工具箱的进展。
| Classification | System | Key components | Sensitivity | Reaction time (h) | Sample | Amplification strategy | Signal output | References |
| Classic CRISPR biosensors | SHERLOCK | Cas13, DNA/RNA | aM | 2.0–5.0 | Pretreated | RPA/RT-RPA | Fluorescence lateral-flow device | [53] |
| SHERLOCK v2 | Cas13, mutli DNA/RNA | zM | 0.5–43.0 | Pretreated | RPA/RT-RPA | Fluorescence lateral-flow device | [34] | |
| SHERLOCK v2+HUDSON | Cas13, mutli DNA/RNA | aM | < 2.0 | Raw with heating | RPA/RT-RPA | Fluorescence | [35] | |
| TXTL-based CRISPR biosensors | Gene circuits: Toehold switch | Cas9, toehold switch | pM | 3.0 | Pretreated | None | Naked-eyed | [22] |
| Paper-based biosensors | Toehold switch-based RNA sensor and cell-free system embedded into the paper | pM | 3.0 | Pretreated | NASBA | Naked-eyed | [22] | |
| Wearable devices | Wearable material with freeze-dried, cell-free synthetic circuits | fM | 1.5 | Raw | RT-RPA | Colorimetric, fluorescence or luminescence | [36] | |
| Gene circuits: gRNA design | Cas12a-gRNA switch | – | – | – | – | – | [27] | |
| –: Not available. | ||||||||
在核酸诊断中，CRISPR/Cas12和Cas13系统目前发展与应用较为成熟。Cas12a属于二类CRISPR/Cas Ⅴ型[54]，其最大的特点是靶向目标双链DNA时，激活单链DNase活性，能够非特异、无差别地反式切割附近的单链DNA分子[55]。基于这种特性，在运用Cas12的生物传感器中大多引入了荧光报告基团和淬灭基团的报告单链DNA，当靶标激活Cas12a后，切割报告单链DNA，释放荧光信号，从而达到快速灵敏的核酸分子检测。Cas13与Cas12在切割原理上类似，但Cas13的靶标为RNA，因此，在检测RNA病毒方面有更多的应用。
SHERLOCK技术是一种基于CRISPR/Cas13的核酸检测技术[35, 53]，具有灵敏度高、反应快速的特点，能够检测寨卡[20]、登革热[35]、COVID-19[18]等病毒(图 6A)。来自美国麻省理工学院的张锋课题组对该技术进行了优化并引入了4种不同的Cas酶(PsmCas13b、LwaCas13a、CcaCas13b、AsCas12a)，根据其不同切割活性选择适配的荧光报告分子，从而实现了对多种类型病毒的同时检测，推出SHERLOCKv2技术[34] (图 6B)。麻省理工学院Sabeti课题组在开发SHERLOCK检测时引入HUDSON技术[35] (图 6C)，仅通过简单的化学或预热处理，在裂解病毒的同时灭活被释放的核酸酶，减少了RNA提取的需要，不仅使样品处理更简洁，同时也提高了检测的便携度。
但是，目前基于SHERLOCK开发出的相关技术反应组分中需要蛋白质纯化和RNA的合成，这些实验操作增加了制备传感器的成本。此外，将传感器的反应混合物冻干，并在运输过程中维持其活性较难，目前尚未取得广泛的商业化[56]。因此，尽管CRISPR传感器核酸检测灵敏度高，在实际应用中仍缺乏合适的平台进行集成化的表达，TXTL作为体外合成蛋白质的平台，能够为CRISPR传感器的便携实地应用提供极大的便利。
2.2 与材料相结合的CRISPR无细胞传感器随着CRISPR系统的生物传感器逐步发展，科学家们尝试将其运用到实际检测中，将TXTL试剂与表达CRISPR元件的核酸混合，冻干附于各种生物医学工程材料上，如纸质、可穿戴柔性材料，通过加入水激活传感器，更好地实现运输过程中的稳定和实地快捷方便的检测。早在2016年，美国麻省理工学院的Collins课题组将无细胞试剂附于纸面并冻干，提出了一种基于纸质传感器的核酸检测法[22] (图 7A)。利用响应寨卡病毒RNA的toehold switch[37]核糖开关，一旦目标RNA出现，toehold switch与其结合，释放RBS区域序列，触发lacZ基因的表达，水解试纸上的氯酚红-β-d-吡喃半乳糖苷(chlorophenol red mono-β-d-galactopyranoside, CPRG)底物，使试纸颜色由黄色变成紫色。由于toehold switch可以特异性检测RNA序列，因此试纸上的颜色变化能够辨别出寨卡病毒，甚至2种不同的寨卡病毒毒株，且灵敏度可达皮摩尔(picomolar, pM)级别。2021年，美国杨百翰大学的Bundy课题组开发出基于纸质的人类唾液SARS-CoV-2 RNA的核酸诊断平台，在无细胞反应体系中加入了小鼠RNA酶抑制剂(murine RNase inhibitor, mRI)，使得在唾液状态下稳定反应，进一步提高了试纸即时检测的能力。并且他们利用NanoLuc生物发光报告基因使结果可视化，可用于快速和低成本的核酸检测[20]。
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| 图 7 材料在无细胞传感器中的应用[22, 36] Fig. 7 The application of materials in cell-free biosensors[22, 36]. A: Schematic representation of a positive zika diagnosis. A synthetic trigger sequence is appended to an RNA fragment through reverse transcription. The presence of a strain-specific PAM leads to the production of either truncated or full-length trigger RNA, which differentially activates a toehold switch and makes the paper show purple color. B: Schematic representation of the layer-by-layer assembly of the wearable devices. Each layer is fabricated from skin-safe silicone elastomer. The FDCF reactions are embedded in a cellulose matrix placed within each chamber. An array of assembled reaction chambers showing the elasticity (center) and flexibility (right) of the devices. C: Fiber optic-embedded textiles allow excitation and emission detection of rehydrated lyophilized biosensors. D: Schematic representation of the sensor components in the interior mask. Puncture of the water blister reservoir results in flow through wicking material, moving viral particles collected from the wearers respiration from the sample collection zone to downstream freeze-dried reactions. The final output is visualized by an LFA strip that is passed externally through the mask. |
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除此之外，将传感器整合到可穿戴设备中，可以扩大无创监测生理疾病状态、接触病原体和毒素的机会。2021年，Collins课题组开发了3种使用冷冻干燥后可穿戴的、基于无细胞系统的设备(wearable freeze-dried cell-free, wFDCF)[36]。第一种是将比色基因回路嵌入到由柔性弹性体制成的流体排芯和密封组件包围的纤维素基质中，通过毛细作用迅速吸进液体。使用lacZ作为基因回路的输出，其表达促进水解CPRG，使材料由黄色变成紫色(图 7B)。第二种是将第一种传感器固定在可穿戴织物中，将电路的输出改为绿色荧光蛋白的荧光信号，通过嵌入的光纤对荧光蛋白进行激发和发射检测(图 7C)。第三种是基于CRISPR/Cas12a SHERLOCK的可穿戴口罩传感器，由于咳嗽、说话或呼吸时病毒会在口罩内部聚集，因此该口罩携带有4个模块化组件：一个储存水的容器、一个大面积样品收集垫、一个用于微流控的分析装置(内含冻干的无细胞试剂)和一个横向检测试纸条。毛细作用可将液体和病毒颗粒洗到样品收集垫上，然后经过等温扩增，Cas12a SHERLOCK传感器检测和切割探针，最后在试纸条上显色(图 7D)。使用时只需按下按钮，便可在穿戴条件下检测SARS-CoV-2，该口罩的检测灵敏度达到了飞摩尔(femtomolar, fM)数量级。这些设计展现出无细胞生物传感器在可穿戴材料和实际应用中的巨大潜力。
2.3 基因电路在CRISPR无细胞传感器中的应用为了更好地扩展传感器的功能，许多研究引入了基因电路来更好地实现对信号的调控和不同条件下的响应，如非相干1型前馈回路(incoherenttype-1 feedforward loop, IFFL)、核酸开关(toehold switch)以及CRISPR系统中经编程改造后的gRNA。
IFFL存在于自然系统中，具有产生基因表达脉冲的能力，是一种被广泛研究的电路设计[57]。简单而言，IFFL电路通过第一条途径激活一个基因(tetR)和另一个基因(deGFP)的表达，而tetR的表达会抑制deGFP的表达。如果deGFP在被激活和被抑制的时间上有一个延迟，那么就可以看到该基因的表达脉冲[58] (图 8A)。2015年，康奈尔大学的Lucks课题组率先实现了IFFL电路在TXTL中的表达调控[59]，通过测试得到了IFFL电路中3个原件的最佳浓度，避免了过量的DNA使TXTL表达量饱和。在deGFP蛋白的C端加入ssrA降解标签，能够被ClpXP蛋白降解，产生小脉冲。2021年，课题组联合浙江工业大学国际基因工程机器大赛(international genetically engineered machine competition, IGEM)竞赛团队ZJUT_China，构建了基于RNA响应的CRISPR/Cas9系统，目标RNA与gRNA碱基互补配对形成RNA-gRNA复合体，结合并引导Cas9蛋白切割IFFL线路中的tetR基因，导致下游deGFP基因的表达，通过荧光强度反正目标RNA的含量，获得了CRISPR/Cas系统的RNA生物传感器[60]。
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| 图 8 工程化基因电路在TXTL中的应用[22, 58, 60] Fig. 8 Application of engineered genetic circuits in cell-free system[22, 58, 60]. A: Incoherent feed forward loop circuit. The transcriptional factor sigma 28 activates the expression of tet repressor that represses deGFP, and activates the expression of deGFP through another. B: The detection of zika virus using toehold switch. C: Schematic design of gene circuits from team ZJUT-China in 2021 iGEM competition. |
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Toehold switch是一种可编程的核酸开关，由2条RNA组成，其中一条RNA能通过形成茎环结构结合基因序列从而阻止其翻译过程，而另一条可以与形成茎环结构的RNA互补，从而解除对基因表达的阻遏效果[37]。2016年，Collins团队运用toehold switch来识别经CRISPR/Cas9系统切割后的序列，对不同的寨卡菌株进行区分，最后通过lacZ基因表达水解CPRG在附有TXTL的试纸中将黄色变为紫色[22] (图 8B)。2021年，Bundy团队设计出能特异性结合SARS-CoV-2 RNA的toehold switch，利用添加mRI的TXTL冻干试纸能快速检测到唾液样本中的核酸并产生生物发光信号[20]。
如前文提到的，gRNA的编程化设计极大地拓展了对CRISPR/Cas系统的时序性调控，在gRNA/crRNA前的3′或5′端添加序列后，可将其变成RNA/DNA响应的核酸开关，如对CRISPR/Cas9系统中gRNA的设计改造而提出的msgRNA[28]，igRNA[26]序列可用于构建更为复杂的基因电路；对CRISPR/Cas12a系统中的crRNA设计改造而用以检测细胞内源性RNA的传感器[27]。
3 存在的问题与展望TXTL是推动基于CRISPR/Cas系统传感器开发的有利平台。传统的CRISPR生物传感器在构建过程中需要进行大量实验，来获得合适的PAM位点和高特异性的gRNA，而利用TXTL作为反应平台，能在短时间内实现蛋白表达，这一特性使对CRISPR系统中不同元件的表征与优化时间大大缩短，提高了实验效率。TXTL在CRISPR传感器方面的应用相比于传统的核酸扩增与诊断技术有较多优势，可将样品处理到信号检测等过程模块集成，冻干附于生物材料中，仅加入水即可激活，便于运输和携带，无需离心机、酶标仪等仪器，无需专业操作；灵敏度较高，可以实现微量病毒检测；结果读取方便，荧光信号可视化；能与更多的学科结合，发展潜力较大。
尤其，TXTL最大的优势在于能够在资源有限的国家和农村地区提供快速便捷的检测。传统的核酸检测技术需要解决的一个重要问题是温度——许多诊断试剂需要全程冷链运输及冷藏以维持蛋白或其余成分的活性，这对实际的现场应用造成了很大的障碍。而Collins课题组报道的冻干无细胞生物传感器实现了常温的运输和保存，并且可以稳定3个月及以上[22]。
但是，基于TXTL的CRISPR传感器也有一些问题需要解决。在试剂制备成本方面，目前尚未建立无细胞表达系统的制备标准[4]，就商业化最完善的大肠杆菌无细胞试剂而言，不同批次及菌株的试剂在表达蛋白活性方面有较大差异，且成本较高。以Arbor Science公司的myTXTL Sigma 70 Master Mix Kit产品为例，一次反应的成本在60元以上[61]，因此实验成本投入也相应较大。在传感器储存方面，冻干试剂虽能提高便携度，但是在一年之后活性会大大降低，若要长时间保存还需要其他的保护措施；在检测对象方面，尽管有一些策略如添加aTF (allosteric transcription factor)元件拓展实现CRISPR传感器对小分子的检测[31]，但是仍缺少有效的方案在抗生素、金属离子等领域进行检测；在分子诊断方面，尽管最近发现的Cas14a蛋白不受PAM位点序列的限制，在单核苷酸多样性(single nucleotide polymorphisms, SNP)检测方面有更灵活的应用[51]，但目前应用较多的CRISPR系统由于gRNA需要识别PAM位点或原间隔物侧翼位点(protospacer flanking sequence, PFS)，因此对待检测物的核酸序列有所限制；在样品处理方面，该系统只适用于简单样品的检测，如血液和尿液可以通过加热(HUDSON)的办法去除样品中的蛋白等物质，而复杂的样品中某些成分可能会影响整个系统的表达。虽然目前已经有一些方案去解决这个问题，如Bundy课题组的工作表明RNase抑制剂的加入可以大大减少样本的干扰，尤其是血液样本[52]，但更加复杂的样本在POCT中依然有较大难度。另外，尽管基因线路和逻辑门的引入能对检测过程中复杂的信号转换、放大和输出实现整合，但是其中相关信号的正交性和系统的鲁棒性仍然有待探索和提高。相信随着TXTL的不断发展，未来这些问题都能够得到改善和解决，生物传感器也将变得更加便捷和商业化。
| [1] |
GREGORIO NE, LEVINE MZ, OZA JP. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols, 2019, 2(1): 24. DOI:10.3390/mps2010024
|
| [2] |
PANDI A, GRIGORAS I, BORKOWSKI O, FAULON JL. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology, 2019, 8(8): 1952-1957. DOI:10.1021/acssynbio.9b00160
|
| [3] |
SILVERMAN AD, KARIM AS, JEWETT MC. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics, 2020, 21(3): 151-170. DOI:10.1038/s41576-019-0186-3
|
| [4] |
ZHANG J, FU L, TANG T, ZHANG S, ZHU J, LI L, WANG Z, SI T. Scalable mining of proteins for biocatalysis via synthetic biology. Synthetic Biology Journal, 2020, 1(3): 319-336.
|
| [5] |
LI Y, LIN ZQ, LIU ZH. Advances in yeast based adaptive laboratory evolution[J]. 2021, 2(2): 287-301.
|
| [6] |
GEORGI V, GEORGI L, BLECHERT M, BERGMEISTER M, ZWANZIG M, WÜSTENHAGEN DA, BIER FF, JUNG E, KUBICK S. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip, 2016, 16(2): 269-281. DOI:10.1039/C5LC00700C
|
| [7] |
ZHU JW. Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production. Biotechnology Advances, 2012, 30(5): 1158-1170. DOI:10.1016/j.biotechadv.2011.08.022
|
| [8] |
GARENNE D, NOIREAUX V. Cell-free transcription-translation: engineering biology from the nanometer to the millimeter scale. Current Opinion in Biotechnology, 2019, 58: 19-27. DOI:10.1016/j.copbio.2018.10.007
|
| [9] |
MARSHALL R, MAXWELL CS, COLLINS SP, JACOBSEN T, LUO ML, BEGEMANN MB, GRAY BN, JANUARY E, SINGER A, HE YH, BEISEL CL, NOIREAUX V. Rapid and scalable characterization of CRISPR technologies using an E. coli cell-free transcription-translation system. Molecular Cell, 2018, 69(1): 146-157. e3. DOI:10.1016/j.molcel.2017.12.007
|
| [10] |
SILVERMAN AD, AKOVA U, ALAM KK, JEWETT MC, LUCKS JB. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology, 2020, 9(3): 671-677. DOI:10.1021/acssynbio.9b00388
|
| [11] |
JUNG JK, ALAM KK, VEROSLOFF MS, CAPDEVILA DA, DESMAU M, CLAUER PR, LEE JW, NGUYEN PQ, PASTÉN PA, MATIASEK SJ, GAILLARD JF, GIEDROC DP, COLLINS JJ, LUCKS JB. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology, 2020, 38(12): 1451-1459. DOI:10.1038/s41587-020-0571-7
|
| [12] |
MAKAROVA KS, HAFT DH, BARRANGOU R, BROUNS SJJ, CHARPENTIER E, HORVATH P, MOINEAU S, MOJICA FJM, WOLF YI, YAKUNIN AF, van der OOST J, KOONIN EV. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 2011, 9(6): 467-477. DOI:10.1038/nrmicro2577
|
| [13] |
JORE MM, LUNDGREN M, van DUIJN E, BULTEMA JB, WESTRA ER, WAGHMARE SP, WIEDENHEFT B, PUL Ü, WURM R, WAGNER R, BEIJER MR, BARENDREGT A, ZHOU KH, SNIJDERS APL, DICKMAN MJ, DOUDNA JA, BOEKEMA EJ, HECK AJR, van der OOST J, BROUNS SJJ. Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade. Nature Structural & Molecular Biology, 2011, 18(5): 529-536.
|
| [14] |
KOONIN EV. Evolution of RNA- and DNA-guided antivirus defense systems in prokaryotes and eukaryotes: common ancestry vs convergence. Biology Direct, 2017, 12(1): 5. DOI:10.1186/s13062-017-0177-2
|
| [15] |
ZAIDI SSEA, MUKHTAR MS, MANSOOR S. Genome editing: targeting susceptibility genes for plant disease resistance. Trends in Biotechnology, 2018, 36(9): 898-906. DOI:10.1016/j.tibtech.2018.04.005
|
| [16] |
WRIGHT AV, NUÑEZ JK, DOUDNA JA. Biology and applications of CRISPR systems: harnessing nature's toolbox for genome engineering. Cell, 2016, 164(1/2): 29-44.
|
| [17] |
SAKUMA T, YAMAMOTO T. Magic wands of CRISPR—lots of choices for gene knock-in. Cell Biology and Toxicology, 2017, 33(6): 501-505. DOI:10.1007/s10565-017-9409-6
|
| [18] |
JINEK M, CHYLINSKI K, FONFARA I, HAUER M, DOUDNA JA, CHARPENTIER E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816-821. DOI:10.1126/science.1225829
|
| [19] |
CONG L, RAN FA, COX D, LIN SL, BARRETTO R, HABIB N, HSU PD, WU XB, JIANG WY, MARRAFFINI LA, ZHANG F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819-823. DOI:10.1126/science.1231143
|
| [20] |
HUNT JP, ZHAO EL, FREE TJ, SOLTANI M, WARR CA, BENEDICT AB, TAKAHASHI MK, GRIFFITTS JS, PITT WG, BUNDY BC. Towards detection of SARS-CoV-2 RNA in human saliva: a paper-based cell-free toehold switch biosensor with a visual bioluminescent output. New Biotechnology, 2022, 66: 53-60. DOI:10.1016/j.nbt.2021.09.002
|
| [21] |
JOUNG J, LADHA A, SAITO M, KIM NG, WOOLLEY AE, SEGEL M, BARRETTO RPJ, RANU A, MACRAE RK, FAURE G, IOANNIDI EI, KRAJESKI RN, BRUNEAU R, HUANG MW, YU XG, LI JZ, WALKER BD, HUNG DT, GRENINGER AL, JEROME KR, et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. The New England Journal of Medicine, 2020, 383(15): 1492-1494. DOI:10.1056/NEJMc2026172
|
| [22] |
PARDEE K, GREEN AA, TAKAHASHI MK, BRAFF D, LAMBERT G, LEE JW, FERRANTE T, MA D, DONGHIA N, FAN M, DARINGER NM, BOSCH I, DUDLEY DM, O'CONNOR DH, GEHRKE L, COLLINS JJ. Rapid, low-cost detection of zika virus using programmable biomolecular components. Cell, 2016, 165(5): 1255-1266. DOI:10.1016/j.cell.2016.04.059
|
| [23] |
MAXWELL CS, JACOBSEN T, MARSHALL R, NOIREAUX V, BEISEL CL. A detailed cell-free transcription-translation-based assay to decipher CRISPR protospacer-adjacent motifs. Methods, 2018, 143: 48-57. DOI:10.1016/j.ymeth.2018.02.016
|
| [24] |
SHMAKOV S, ABUDAYYEH OO, MAKAROVA KS, WOLF YI, GOOTENBERG JS, SEMENOVA E, MINAKHIN L, JOUNG J, KONERMANN S, SEVERINOV K, ZHANG F, KOONIN EV. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell, 2015, 60(3): 385-397. DOI:10.1016/j.molcel.2015.10.008
|
| [25] |
KARVELIS T, GASIUNAS G, YOUNG J, BIGELYTE G, SILANSKAS A, CIGAN M, SIKSNYS V. Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif sequence elements. Genome Biology, 2015, 16: 253. DOI:10.1186/s13059-015-0818-7
|
| [26] |
GALIZI R, DUNCAN JN, ROSTAIN W, QUINN CM, STORCH M, KUSHWAHA M, JARAMILLO A. Engineered RNA-interacting CRISPR guide RNAs for genetic sensing and diagnostics. The CRISPR Journal, 2020, 3(5): 398-408. DOI:10.1089/crispr.2020.0029
|
| [27] |
COLLINS SP, ROSTAIN W, LIAO CY, BEISEL CL. Sequence-independent RNA sensing and DNA targeting by a split domain CRISPR-Cas12a gRNA switch. Nucleic Acids Research, 2021, 49(5): 2985-2999. DOI:10.1093/nar/gkab100
|
| [28] |
LI Y, TENG XC, ZHANG KX, DENG RJ, LI JH. RNA strand displacement responsive CRISPR/Cas9 system for mRNA sensing. Analytical Chemistry, 2019, 91(6): 3989-3996. DOI:10.1021/acs.analchem.8b05238
|
| [29] |
HWANG S, MAXWELL KL. Meet the anti-CRISPRs: widespread protein inhibitors of CRISPR-Cas systems. The CRISPR Journal, 2019, 2(1): 23-30. DOI:10.1089/crispr.2018.0052
|
| [30] |
LI YP, BONDY-DENOMY J. Anti-CRISPRs go viral: the infection biology of CRISPR-Cas inhibitors. Cell Host & Microbe, 2021, 29(5): 704-714.
|
| [31] |
MAHAS A, WANG QC, MARSIC T, MAHFOUZ MM. Development of Cas12a-based cell-free small-molecule biosensors via allosteric regulation of CRISPR array expression. Analytical Chemistry, 2022, 94(11): 4617-4626. DOI:10.1021/acs.analchem.1c04332
|
| [32] |
ZHANG LY, GUO W, LU Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnology Journal, 2020, 15(9): e2000187. DOI:10.1002/biot.202000187
|
| [33] |
VOYVODIC PL, BONNET J. Cell-free biosensors for biomedical applications. Current Opinion in Biomedical Engineering, 2020, 13: 9-15. DOI:10.1016/j.cobme.2019.08.005
|
| [34] |
GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, KELLNER MJ, JOUNG J, COLLINS JJ, ZHANG F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, 2018, 360(6387): 439-444. DOI:10.1126/science.aaq0179
|
| [35] |
MYHRVOLD C, FREIJE CA, GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, METSKY HC, DURBIN AF, KELLNER MJ, TAN AL, PAUL LM, PARHAM LA, GARCIA KF, BARNES KG, CHAK B, MONDINI A, NOGUEIRA ML, ISERN S, MICHAEL SF, LORENZANA I, YOZWIAK NL, MACINNIS BL, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science, 2018, 360(6387): 444-448. DOI:10.1126/science.aas8836
|
| [36] |
NGUYEN PQ, SOENKSEN LR, DONGHIA NM, ANGENENT-MARI NM, de PUIG H, HUANG A, LEE R, SLOMOVIC S, GALBERSANINI T, LANSBERRY G, SALLUM HM, ZHAO EM, NIEMI JB, COLLINS JJ. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology, 2021, 39(11): 1366-1374. DOI:10.1038/s41587-021-00950-3
|
| [37] |
GREEN AA, SILVER PA, COLLINS JJ, YIN P. Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression. Cell, 2014, 159(4): 925-939. DOI:10.1016/j.cell.2014.10.002
|
| [38] |
JANSEN R, EMBDEN JD, GAASTRA W, SCHOULS LM. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575. DOI:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x
|
| [39] |
KLEINSTIVER BP, TSAI SQ, PREW MS, NGUYEN NT, WELCH MM, LOPEZ JM, MCCAW ZR, ARYEE MJ, JOUNG JK. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nature Biotechnology, 2016, 34(8): 869-874. DOI:10.1038/nbt.3620
|
| [40] |
ZHANG XH, TEE LY, WANG XG, HUANG QS, YANG SH. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4(11): e264.
|
| [41] |
WIMMER F, MOUGIAKOS I, ENGLERT F, BEISEL CL. Rapid cell-free characterization of multi-subunit CRISPR effectors and transposons. Molecular Cell, 2022, 82(6): 1210-1224. e6. DOI:10.1016/j.molcel.2022.01.026
|
| [42] |
JIANG WY, BIKARD D, COX D, ZHANG F, MARRAFFINI LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 2013, 31(3): 233-239. DOI:10.1038/nbt.2508
|
| [43] |
LIN YN, CRADICK TJ, BROWN MT, DESHMUKH H, RANJAN P, SARODE N, WILE BM, VERTINO PM, STEWART FJ, BAO G. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Research, 2014, 42(11): 7473-7485. DOI:10.1093/nar/gku402
|
| [44] |
LEENAY RT, MAKSIMCHUK KR, SLOTKOWSKI RA, AGRAWAL RN, GOMAA AA, BRINER AE, BARRANGOU R, BEISEL CL. Identifying and visualizing functional PAM diversity across CRISPR-cas systems. Molecular Cell, 2016, 62(1): 137-147. DOI:10.1016/j.molcel.2016.02.031
|
| [45] |
BHAYA D, DAVISON M, BARRANGOU R. CRISPR-Cas systems in bacteria and Archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics, 2011, 45: 273-297. DOI:10.1146/annurev-genet-110410-132430
|
| [46] |
MAKAROVA KS, WOLF YI, ALKHNBASHI OS, COSTA F, SHAH SA, SAUNDERS SJ, BARRANGOU R, BROUNS SJJ, CHARPENTIER E, HAFT DH, HORVATH P, MOINEAU S, MOJICA FJM, TERNS RM, TERNS MP, WHITE MF, YAKUNIN AF, GARRETT RA, van der OOST J, BACKOFEN R, KOONIN EV. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 2015, 13(11): 722-736. DOI:10.1038/nrmicro3569
|
| [47] |
BONDY-DENOMY J, GARCIA B, STRUM S, DU MJ, ROLLINS MF, HIDALGO-REYES Y, WIEDENHEFT B, MAXWELL KL, DAVIDSON AR. Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins. Nature, 2015, 526(7571): 136-139. DOI:10.1038/nature15254
|
| [48] |
MAHENDRA C, CHRISTIE KA, OSUNA BA, PINILLA-REDONDO R, KLEINSTIVER BP, BONDY-DENOMY J. Broad-spectrum anti-CRISPR proteins facilitate horizontal gene transfer. Nature Microbiology, 2020, 5(4): 620-629. DOI:10.1038/s41564-020-0692-2
|
| [49] |
WANG XS, LI X, MA YJ, HE JQ, LIU X, YU GM, YIN H, ZHANG H. Inhibition mechanisms of CRISPR-Cas9 by AcrIIA17 and AcrIIA18. Nucleic Acids Research, 2022, 50(1): 512-521. DOI:10.1093/nar/gkab1197
|
| [50] |
RAUCH BJ, SILVIS MR, HULTQUIST JF, WATERS CS, MCGREGOR MJ, KROGAN NJ, BONDY-DENOMY J. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell, 2017, 168(1/2): 150-158. e10.
|
| [51] |
LI Y, LI SY, WANG J, LIU GZ. CRISPR/Cas systems towards next-generation biosensing. Trends in Biotechnology, 2019, 37(7): 730-743. DOI:10.1016/j.tibtech.2018.12.005
|
| [52] |
SALEHI ASM, YANG SO, EARL CC, SHAKALLI TANG MJ, PORTER HUNT J, SMITH MT, WOOD DW, BUNDY BC. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: a RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology, 2018, 345: 19-25. DOI:10.1016/j.taap.2018.02.016
|
| [53] |
GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, LEE JW, ESSLETZBICHLER P, DY AJ, JOUNG J, VERDINE V, DONGHIA N, DARINGER NM, FREIJE CA, MYHRVOLD C, BHATTACHARYYA RP, LIVNY J, REGEV A, KOONIN EV, HUNG DT, SABETI PC, COLLINS JJ, ZHANG F. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017, 356(6336): 438-442. DOI:10.1126/science.aam9321
|
| [54] |
ZETSCHE B, GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, SLAYMAKER IM, MAKAROVA KS, ESSLETZBICHLER P, VOLZ SE, JOUNG J, van der OOST J, REGEV A, KOONIN EV, ZHANG F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015, 163(3): 759-771. DOI:10.1016/j.cell.2015.09.038
|
| [55] |
LI SY, CHENG QX, LIU JK, NIE XQ, ZHAO GP, WANG J. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Research, 2018, 28(4): 491-493. DOI:10.1038/s41422-018-0022-x
|
| [56] |
MUSTAFA MI, MAKHAWI AM. SHERLOCK and DETECTR: CRISPR-cas systems as potential rapid diagnostic tools for emerging infectious diseases. Journal of Clinical Microbiology, 2021, 59(3): e00745-e00720.
|
| [57] |
SHEN-ORR SS, MILO R, MANGAN S, ALON U. Network motifs in the transcriptional regulation network of Escherichia coli. Nature Genetics, 2002, 31(1): 64-68. DOI:10.1038/ng881
|
| [58] |
TAKAHASHI MK, CHAPPELL J, HAYES CA, SUN ZZ, KIM J, SINGHAL V, SPRING KJ, AL-KHABOURI S, FALL CP, NOIREAUX V, MURRAY RM, LUCKS JB. Rapidly characterizing the fast dynamics of RNA genetic circuitry with cell-free transcription-translation (TX-TL) systems. ACS Synthetic Biology, 2015, 4(5): 503-515. DOI:10.1021/sb400206c
|
| [59] |
TAKAHASHI MK, HAYES CA, CHAPPELL J, SUN ZZ, MURRAY RM, NOIREAUX V, LUCKS JB. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods, 2015, 86: 60-72. DOI:10.1016/j.ymeth.2015.05.020
|
| [60] |
CRISPR/Cas9-based cell-free biosensors for RNA biomarkers[EB/OL]. [2022-10-15]. https://2021.igem.org/Team:ZJUT-China.
|
| [61] |
myTXTL-Cell-Free expression[EB/OL]. [2022-10-15]. https://arborbiosci.com/synthetic-biology/cell-free-protein-expression/mytxtl/.
|