2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 孙雯君, 黄行许, 王鑫杰
- SUN Wenjun, HUANG Xingxu, WANG Xinjie
- 基于CRISPR的快速灵敏便捷分子检测
- CRISPR-based molecular diagnostics: a review
- 生物工程学报, 2023, 39(1): 60-73
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(1): 60-73
- 10.13345/j.cjb.220317
-
文章历史
- Received: April 18, 2022
- Accepted: August 2, 2022
引用本文
|
2. 中国农业科学院(深圳)农业基因组研究所 岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心 农业农村部农业基因数据分析重点实验室, 广东 深圳 518120;
3. 广州生物岛实验室, 广东 广州 510030
2. Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Genome Analysis Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, Guangdong, China;
3. Guangzhou Laboratory, Bio-Island, Guangzhou 510030, Guangdong, China
基于CRISPR蛋白特异性识别目标核酸或识别后激活旁路切割活性的特性，科学家成功开发了包括SHERLOCK、DETECTR和HOLMES等一系列CRISPR核酸检测体系。CRISPR检测具有快速、准确、灵敏、简便、经济等特点，已被成功应用于病原微生物、遗传病、肿瘤基因突变、小分子等检测，是理想的下一代快速灵敏核酸临场检测平台技术。快速便捷和智能化是临场核酸检测的痛点。开发基于CRISPR和AI的快速灵敏便捷核酸检测体系，创制具有自主知识产权的基于CRISPR的智能核酸检测产品，是领域未来发展的方向。快速灵敏诊断有着巨大社会需求，特别是新冠疫情对人类社会造成巨大威胁，使人们更加深刻认识到建立快速灵敏检测技术的重要性及必要性。而由于基因组学、转录组学、测序技术等的高速发展，核酸诊断成为了快速灵敏诊断发展的主角。
近年来，以CRISPR/Cas为代表的基因编辑带来了生物技术革命性的进步，被认为是等同于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的革命性平台技术，同PCR技术一样影响着生命医药的诸多方面，并分别在2015和2017年两次被Science评为年度突破性科学进展之首，获评Nature近10年最具影响力的五大科学事件之首和2020年诺贝尔化学奖。同时，研究者开发出基于CRISPR的核酸检测技术，其具备快速、准确、灵敏、经济等特点，是理想的下一代快速灵敏核酸临场检测技术。该技术2018年被Science评为年度十大突破性科技进展之一，被Nature列为2022年值得关注的7项技术之一。
1 基于CRISPR的核酸检测体系目前，基于CRISPR的核酸检测从原理上分为2种：(1) 利用Cas9等Cas蛋白高特异性识别并结合双链DNA (double-strand DNA, dsDNA)的特性；(2) 利用Cas13、Cas12等Cas蛋白特异性识别核酸后，旁路切割活性激活，非特异性切割单链DNA (single-strand DNA, ssDNA)或单链RNA (single-strand RNA, ssRNA)的特性(图 1)。在Cas12或Cas13核酸检测体系中，crRNA和Cas蛋白复合体与靶标结合后(Cas12a结合dsDNA，Cas13a结合RNA)，Cas蛋白旁路切割活性被激活，进而非特异性切割报告探针(Cas12a切割ssDNA，Cas13a切割ssRNA)。通过FAM、生物素等报告探针标记荧光基团和BHQ1等淬灭基团，检测结果被转化为可视化的荧光信号或试纸条条带。目前，基于不同检测原理而开发的CRISPR核酸检测技术主要分为以下2类。
|
| 图 1 基于不同CRISPR蛋白开发的核酸检测技术 Fig. 1 Four nucleic acid detection techniques based on different CRISPR proteins. A: In reverse transcription, a trigger (purplish red) attaches to sequence-specific primers. If the template contains a specific PAM sequence (blue), targeted cleavage induced by Cas9 will result in T7-transcribed truncated RNA which is unable to activate the toehold sensor. If the template does not have a specific PAM sequence, the full-length template with a trigger is transcribed to activate the toehold sensor and produces a visible color change[1]. B: The dCas9-sgRNA complex is combined with a graphene chip with ultra-high electrical conductivity. A target sequence can be recognized and stably combined with the dCas9-sgRNA complex, resulting in a significant difference in electrical signals[3]. C: Targeted DNA or RNA is amplified by RT-RPA or RPA, then binds to the Cas12-crRNA complex followed by cleavage, thereby activating the robust non-specific ssDNA cleavage activity of Cas12. Non-specific ssDNA is labeled with a fluorophore and quench agent at both ends, which produces fluorescence signal when cleaved[4]. D: Targeted sequence is amplified by RT-RPA or RPA, then is transcribed to ssRNA. Targeted ssRNA specifically binds to the Cas13-crRNA complex followed by cleavage, activating the non-specific ssRNA cleavage activity of Cas13. The cleaved non-specific ssRNA produces fluorescence signals[8]. |
| |
CRISPR系统中的Ⅱ型Cas9蛋白可以在gRNA的引导下特异性结合靶标DNA，研究者据此原理开发了一系列核酸检测方案。其中，NASBA-CRISPR利用核酸序列等温扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)和Cas9特异性切割，从而产生可被小型传感器监测或在试纸上显示出颜色变化的判读信号(图 1A)[1]。该系统可以在单碱基水平区分美洲型和非洲型的寨卡病毒(zika virus, ZIKV)。CRISDA检测利用CRISPR-Cas9特异性靶点切割介导的链位移扩增方法，结合多肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)入侵介导的结果测量方法，能够在复杂样本背景下检测amol/L级别灵敏度和单核苷酸特异性的DNA样品[2]。
另外，研究人员利用失活型变体蛋白dCas9能特异性识别但不切割靶核酸的特性也开发出一系列检测方案。其中，CRISPR- Chip是一种利用dCas9和石墨烯的核酸检测芯片(图 1B)[3]。将dCas9-gRNA复合物结合到具有超高导电特性的石墨烯芯片上，利用CRISPR特异性结合靶标核酸的能力，产生电信号差异。该体系可以实现15 min内检测到低至1.7 fmol/L的靶标DNA，并成功用于杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy, DMD)患者DNA突变的检测。
1.2 利用Cas蛋白家族特异识别核酸后激活旁路切割活性的检测技术CRISPR系统中的Ⅴ型Cas12蛋白，在crRNA指导下能特异性识别切割dsDNA，并激活非特异性ssDNA反式切割活性。基于Cas12a的上述特性，研究人员开发了多种快速准确的检测方法，包括DETECTR[4]、HOLMES[5]和CDetection[6]等，适用于核酸样品检测，并成功应用于临床标本中与癌症相关的16型和18型HPV的鉴定、新冠病毒、流感病毒及非洲猪瘟病毒等的检测(图 1C)。其中，Cas12f (又称Cas14)蛋白具有类似的靶向切割ssDNA后激发反式切割的特性，有研究者基于该原理开发出无前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)限制的可识别单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)的高特异性核酸检测方法，称为Cas14-DETECTR[7]。
CRISPR系统中的Ⅵ型Cas13蛋白在与crRNA结合后，能特异性识别切割RNA序列，激活非靶向RNA切割活性。基于CRISPR- Cas13上述特性，研究者开发了一种快速准确的核酸检测方法SHERLOCK[8]，成为一种灵敏且特异的诊断平台(图 1D)。该平台可直接从尿液、唾液、血清、血浆和全血等体液中检测ZIKV以及登革热病毒(dengue virus, DENV)，还可以区分4种密切相关的DENV血清型及ZIKV分离株中的SNPs。研究人员基于Cas13该特性还开发了针对新冠病毒、流感病毒等检测方案。
2 基于CRISPR的核酸检测技术的优势与改进理想的分子检测应当具备以下特点：灵敏、特异、快速、使用便捷、经济、无需大型设备和专业技术人员等。目前PCR是最常用的诊断方法，具有高灵敏度和特异性，但需要专业实验室、昂贵仪器和专业人员，这限制了其部分应用。测序技术在核酸检测中变得越来越重要，然而，高复杂度、长时间和高成本等阻碍了其在快速临场感染诊断中的应用。基于等温扩增的核酸检测具备快速和便携式检测能力，但其灵敏度和特异性仍存在不足[9]。而基于CRISPR的核酸检测在灵敏度、特异性、检测时间、无需专业仪器设备和人员方面展示出部分优势(表 1)。
| Characteristics | CRISPR/Cas | PCR/qPCR | Isothermal amplification | Sequencing |
| Specificity | High | High | Medium | Medium-high |
| Sensitivity | High | Medium | Low-medium | High |
| Detection time | 15–50 min | 1–3 h | 15–50 min | 1–15 d |
| Cost | Low | Low-medium | Low | High |
| Professional equipment | No | PCR/qPCR amplifier | No | Sequencer |
| Convenience | High | Low-medium | High | Low |
| Usability | Easy | Medium | Easy | Complex |
CRISPR系统的RNA引导Cas蛋白识别切割特定核酸序列的机制保证了其检测的特异性。Cas12蛋白需要至少17 bp的匹配才能实现稳定地结合与切割，相较于Cas9蛋白具有更高的特异性，可实现单核苷酸检测精度[10]。在灵敏检测方面，Cas12、Cas13在特异识别目标核酸后激活旁路切割的特性，实现了对检测信号的放大。这种旁路切割使大量的单链核酸被切割，迅速转化为可视化的荧光信号或试纸条条带。为进一步增加CRISPR核酸检测技术的灵敏度，有研究者将Cas13检测体系与CRISPR Ⅲ型RNA核酸酶Csm6结合，Cas13的旁路切割激活Csm6，进一步切割报告探针释放荧光，从而级联增加信号[11]。对靶核酸的预扩增进一步增加了灵敏度，目前常使用的核酸等温扩增方式为重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification, RPA)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)等。反应缓冲液以及crRNA对CRISPR蛋白的靶向切割和旁路切割能力有着很大的影响。研究者通过对反应缓冲液的Mg2+离子浓度[4]、Mn2+离子浓度[12]、pH值[13-14]、添加剂(PEG、glycerin和Triton X-100；BSA和l-脯氨酸)[15]等条件进行了优化，进一步提升了检测灵敏度。另有研究者通过工程化改造crRNA，如在5′端或3′端延伸UA丰富的RNA[16-17]、在3′端增加TA丰富的DNA[17]或对crRNA进行多项化学修饰[16]，使检测灵敏度增加。将生物传感器与CRISPR检测相结合[18-20]，也为大幅提升灵敏度提供了可能。近期有研究者开发出一种基于Cas13a的电化学传感器，可实现无需核酸扩增的快速超敏SARS-CoV-2 RNA检测[21]。他们将ssRNA的氧化还原探针固定在纳米复合材料(nanocomposite, NC)和金纳米颗粒(gold nanoflower, AuNF)修饰的电极表面，在Cas13a的旁路切割激活后，ssRNA被切割释放氧化还原分子，从而产生电流变化。该检测方法能够在无预扩增情况下实现SARS-CoV-2开放阅读框(open reading frame, ORF)和S基因fg/mL水平的定量检测。
临场检测(point of care testing, POCT)需要快速简便的样品预处理方式和可视化的读取方法。有研究者通过加热和化学还原使核酸酶和病毒失活，实现对血液、唾液和尿液等临床样品的预处理[22]。可视化的读取方法主要有荧光信号、颜色变化、免疫层析试纸条以及电化学信号等。荧光信号一般来自于CRISPR蛋白旁路切割释放荧光团，可在蓝光照射下通过肉眼或便携式荧光阅读器来读取。有研究者将金纳米颗粒比色法与CRISPR检测法相结合，当存在靶标时旁路切割使金纳米颗粒脱离，溶液变为鲜艳的红色[23-24]。免疫层析试纸条的原理主要为链霉亲和素与生物素的高亲和力。标记有荧光团FAM与生物素的报告探针与偶联金纳米颗粒的抗荧光素异硫氰酸(fluorescein isothiocyanate, FITC)特异性抗体结合。当报告探针未被切割时，生物素与链霉亲和素结合，形成第一条色带；当存在靶标DNA或RNA时，旁路切割的激活使报告探针被切割，FAM和偶联金纳米颗粒的FITC特异性抗体在条带上走得更远，与物种特异性的二级抗体结合，形成第二条色带[11]。有研究者将电化学传感器与CRISPR检测法结合，通过测定带有电化学标签的报告分子被切割后引起的电流变化达到检测核酸的目的[18-21]。
在简便性方面，研究者开发了多种一管闭管式CRISPR检测方案。STOPCovid是一种基于SHERLOCK的检测方法(SHERLOCK testing in one pot, STOP)，将病毒RNA的提取、等温扩增和CRISPR介导的检测整合到同一个体系中，首次实现了对SARS-COV-2的快速、闭管式灵敏检测[25]。但是该方法无法避免因检测反应中切割底物造成扩增不足，导致灵敏度降低的问题。不少研究者针对该问题，通过优化反应条件[26]、筛选高效引物和荧光探针[27-29]、选择次优PAMs[30]等方法使反应前期更倾向于扩增而非切割。这种一管闭管式CRISPR检测方案简化操作步骤，且全程仅需恒温操作，具有极高的简便性，有利于其在临场检测的应用。另一种改进策略是将扩增体系与检测体系时空分离，如在管底进行扩增，反应后通过离心将管壁或管盖的检测体系与扩增产物混合[31-33]；还有通过动态多相水反应(dynamic aqueous multiphase reaction, DAMR)体系使底层的扩增产物向上逐级扩散从而激活检测反应[34]。
发展至目前，基于CRISPR的核酸检测技术具有以下优点：(1) 高特异性，可实现单核苷酸点突变检测；(2) 高灵敏性，可实现单拷贝核酸检测；(3) 快速性，整个检测在0.5–1.0 h内完成；(4) 简便性，不需专业设备及人员，可现场完成；(5) 经济性，单个检测成本低；(6) 易开发性，可快速开发出新核酸检测试剂盒等[35](表 2)。我们相信，随着进一步的改进和优化，其更具通用性，CRISPR核酸检测技术将成为POCT的最优选。
| Platform | Effector | Amplification | Readout | LOD | Time | Reference |
| NASBA-CRISPR | Cas9 | NASBA | Colometry | fmol/L | ~3 h | [1] |
| CRISDA | Cas9 | SDA | Fluorescence | amol/L | ~2 h | [2] |
| CRISPR-Chip | dCas9 | Electrochemical | fmol/L | 15 min | [3] | |
| DETECTR | Cas12a | RPA | Fluorescence | amol/L | 2 h | [4] |
| Cas14-DETECTR | Cas14 | PCR | Fluorescence | amol/L | 2 h | [7] |
| HOLMES | Cas12a | PCR | Fluorescence | amol/L | ~1 h | [5] |
| HOLMES v2 | Cas12b | LAMP | Fluorescence | amol/L | ~1 h | [13] |
| CDetection | Cas12b | RPA | Fluorescence | amol/L | ~3 h | [6] |
| E-CRISPR | Cas12a | Electrochemical | pmol/L | ~3 h | [18] | |
| MeCas12a | Cas12a | RAA | Fluorescence | zmol/L | 45 min | [12] |
| SCAN | Cas12a | PCR | Electrochemical | amol/L | ~1 h | [20] |
| SHERLOCK | Cas13a | RPA | Fluorescence | amol/L | ~2 h | [8] |
| SHERLOCK v2 | Cas13b | RPA | Fluorescence | zmol/L | 1–3 h | [11] |
| HUDSON+SHERLOCK | Cas13a | RPA | Fluorescence | amol/L | ˂2 h | [22] |
| STOPCovid v2 | Cas12b | LAMP | Fluorescence | amol/L | ~1 h | [25] |
| CARMEN | Cas13 | RPA | Fluorescence | amol/L | ~2 h | [36] |
CRISPR核酸检测展现出来的巨大前景，引得业界高度关注。两家基于CRISPR的核酸检测公司——Mammoth Biosciences和SHERLOCK Biosciences分别由业界的两位领袖科学家DOUDNA Jennifer和ZHANG Feng领衔成立。美国政府高度重视，国防部威胁降低局(U.S. Defense Threat Reduction Agency, DTRA)聚焦CRISPR核酸检测技术创新开发，于2019年9月与SHERLOCK Biosciences签约开发超快超敏诊断；美国国防高级研究计划局(Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA)聚焦技术能力储备，于2019年12月与Mammoth Biosciences签约启动基因编辑检测计划，拟投入3 670万美元开发已知的50 000种病毒、细菌和寄生虫的快速监测平台。CRISPR核酸检测的技术特点使得其被快速开发和推广。
3.1 病原微生物检测应用CRISPR核酸检测技术进行病原微生物的检测对于传染病的临检具有重要意义。基于Cas9、Cas12a和Cas13a的病原微生物检测发展非常快。
近年来，登革热病毒(dengue virus, DENV)和寨卡病毒(zika virus, ZIKV)等传染性病毒在部分国家流行传播并导致人员死亡，引起社会恐慌和经济损失。为开发能在非洲等部分欠发达地区快速进行的传染性病毒检测方案，科学家们利用基于CRISPR的核酸检测进行了一系列尝试。利用Cas9核酸酶，研究者通过NASBA扩增ZIKV的RNA后应用CRISPR/Cas9对扩增的病毒核酸进行切割，通过触点开关传感器进行检测，最终结果以显色的方式在试纸上读取，该系统能够在单碱基水平分辨ZIKV的美洲及非洲毒株[1]。有研究团队开发了基于Cas13a的SHERLOCK核酸检测技术，能够实现在没有专业仪器设备的条件下直接从病人样本中对DENV与ZIKV进行快速检测。基于SHERLOCK的HUDSON方案可以在2 h内直接从患者血清、尿液和唾液等样本中检测出DENV和ZIKV，且可在胶体金试纸条上实现结果判定[22]。SHERLOCKv2[11]可以实现对DENV或ZIKV以及患者液体活检样本的突变检测。发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV)作为一种症状严重的新型布尼亚病毒，也可以被基于RPA扩增与Cas12a反式切割的检测系统灵敏诊断[37]。
针对人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)的快速检测及亚型区分这一问题，有研究团队利用Cas9对靶标DNA的特异切割作用和PCR技术，开发CARP和ctPCR检测策略。这些方法能够方便、特异、高效地检测人乳头瘤病毒不同亚型(HPV16和HPV18)[38-40]。另有研究者基于Cas12a开发了DETECTR、HOLMES和CDetection核酸检测技术，分别用于检测人乳头瘤病毒并进行基因分型[4-6]。
针对病毒的高通量检测问题，研究人员开发了基于SHERLOCK的CRISPR分子诊断微流控芯片检测方案[36]。该技术方案可以一次针对一种病毒检测1 000多个样本，或一次针对一个样本中多达169种病毒进行检测，提供高通量检测或多重感染分析。首先从样品中提取核酸并进行扩增，再将独特的荧光染料添加至样品中，并将混合物分成仅有纳升的微小液滴。同时，将含有CRISPR-Cas13、crRNA和报告RNA的混合物，用荧光标定、编码，并分成微小液滴，与标定好的样本在芯片上的小孔中混合。CRISPR-Cas13在crRNA的引导下识别并与其靶标(如特定的核酸序列)结合，其旁路切割活性被激活，切割报告RNA，进而释放特异荧光信号。这一体系能够提供高通量检测或多重感染分析。
新型冠状肺炎疫情给世界公共健康带来了巨大威胁，研究者利用CRISPR核酸检测的优势，开发了一系列针对新型冠状病毒SARS-COV-2的快速检测方案。基于DETECTR和免疫层析试纸的快速检测方法，可从鼻咽拭子RNA提取液中快速(< 40 min)、准确地检测SARS-CoV-2[41]。本研究团队利用Cas12a灵敏核酸检测平台，快速开发了SARS-CoV-2的荧光可视检测方案CRISPR/Cas12a-NER，能实现简易、灵敏且特异性强的检测[42]。在CRISPR/Cas12a-NER基础上，本实验室进一步开发出灵敏度提升至单拷贝水平的锰离子增强型检测方案-MeCas12a[12]及针对SARS-CoV-2突变毒株的精准检测方案symRNA-Cas12a[43]。基于SARS-CoV-2毒株变异迅速的情况，近期不少研究团队运用基于Cas12a或Cas13a的荧光检测方法对SARS- CoV-2阳性临床样本进行检测，可实现灵敏且特异的野生型SARS-CoV-2和多种主要变异型(alpha、beta、delta和omicron)区分[44-46]。STOPCovid实现了对SARS-COV-2的快速、闭管式灵敏检测[25]。通过使用crRNAs靶向次优PAMs底物，在等温扩增与切割同时进行的前期更倾向于扩增累积底物的方法，进一步提升了一管法的灵敏度，并在15 min内检测出SARS-CoV-2[30]。有研究团队开发出一种基于CRISPR-Cas13a的无需核酸预扩增的新冠病毒检测方法[47]。该方法快速、灵敏，能够在30 min内检测到约100拷贝/微升的病毒载量，将结果输出到手机终端。由于结合了个人移动设备，该检测方法有望实现SARS-CoV-2的快速、低成本、医疗点筛查。
3.2 遗传病检测应用核酸检测进行特定基因位点及突变的识别，对于遗传疾病的准确诊断和治疗至关重要。现有的核酸检测方案如基因测序、抗原抗体反应等耗时长、成本高，基于CRISPR的核酸检测技术能够快速灵敏且高效特异地进行核酸检测。CRISPR-Chip能够成功地检测DMD患者DNA样本中的基因突变[3]。有研究者利用Cas12a的旁路切割活性结合PCR扩增，开发了HOLMES核酸检测方案，成功地对人基因组中的SNP以及痛风相关位点进行了检测[5]。
3.3 肿瘤基因突变检测肿瘤突变的早期检测能够确保及时诊断和治疗，降低死亡率。现有的癌症检测技术如抗原抗体反应、基因测序、成像等在检测的特异性、灵敏度、检测成本和检测速度等方面存在缺陷。CRISPR核酸检测技术因其高效、快速、灵敏、特异等优点在肿瘤突变检测中得到应用[48]。SHERLOCK可以在低等位基因情况下检测到EGFR基因的L858R和BRAF基因的V600E两种癌症突变游离DNA (cell-free DNA, cfDNA)，并达到单碱基水平的灵敏性[8]。增强版的SHERLOCK v2[11]可以检测到非小细胞肺癌患者的EGFR基因的L858R突变或19号外显子缺失。本实验室开发了EasyCatch技术平台，该方案是一种基于Cas12a的超敏突变检测体系[49]，该方案通过整合特异性酶切、等温扩增和CRISPR检测技术，可实现高达0.001%灵敏度的单碱基突变检测，且准确、快速、简单，在突变检测及癌症精准诊断方面有巨大应用前景。
3.4 小分子检测基于CRISPR的生物传感器不仅可以用于核酸检测，而且可以对非核酸靶标进行检测。研究者利用细菌变构转录因子对小分子和dsDNA的竞争性结合活性，与Cas12a的ssDNA反式切割活性，成功开发首个Cas12a检测小分子方法，实现对尿酸和对羟基苯甲酸的纳摩尔浓度的灵敏快速检测[50]。另有研究人员基于竞争性结合机制设计了ATP和ssDNA竞争性结合的ATP适配体，当存在ATP竞争结合适配体时，ssDNA脱落触发Cas12a反式切割活性，该方法可实现在室温环境下15 min内对ATP和Na+离子进行检测[51]。相似策略也被用于三聚氰胺的检测中[52]。有研究团队开发了一种CRISPR-Cas13a的非核酸靶标检测方法[53]。利用核糖开关或蛋白质通过特定的效应分子来调节转录，转录的特定RNA激活CRISPR-Cas13a的非特异性切割活性，通过检测荧光强度量化效应分子浓度，实现包括辅助因子、核苷酸、氨基酸代谢物、四环素和样品中的单原子离子等多种化合物的检测量化。近期有研究者开发出一种结合DNAzyme和CRISPR系统的高灵敏度铅检测方法，通过读取终荧光信号可检测低至0.48 nmol/L的铅离子。铅离子DNAzyme由酶链(e链)和底物链(s链)组成，当识别铅离子时，s底物链可被e酶链切割，释放ssDNA序列。产生的ssDNA被Cas蛋白/gRNA复合物特异性识别，进一步触发Cas蛋白的旁路切割效应，切割ssDNA报告基因产生荧光，进行结果判定[54]。
3.5 食品病原微生物检测病原微生物威胁全球食品安全，对食源性病毒快速、灵敏、准确检测是食品安全的关键。近年来，基于CRISPR的核酸检测也应用到了食品病原微生物检测。针对食品中大肠杆菌检测，有研究人员利用Cas9蛋白识别切割目标毒力基因，随后启动链替代扩增与滚环扩增进行信号放大，并结合金属-有机框架平台进行信号读取[55]，能实现矿泉水、牛奶、橙汁等食品中的大肠杆菌的有效检测。另有研究团队使用基于LAMP的CRISPR/Cas12a检测体系从新鲜莴苣中检测出低至1.22 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7[56]。有研究团队整合RPA与CRISPR-Cas12a检测方法，开发了用于食物病原细菌、基因修饰作物、掺假肉等的RPA-Cas12a-FS检测系统，可在45 min内检测到最低10个拷贝的靶片段[57]。RPA-Cas12a-μPAD是一种在基于微流控纸张的分析装置(microfluidic paper-based analytical devices, μPAD)上实现RPA辅助的表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)信号CRISPR/Cas12a检测，可在牛奶和肉类样品中实现低至3−4 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌检测[58]。该方法依赖于Cas12a在识别靶向DNA后激活旁路切割能力，非特异性切割连接子ssDNA，使连接子ssDNA无法与制备的分别包被DNA1和DNA2的AuNS@4-MBA@Au@DNA探针对杂交，从而在μPAD上产生差异化结果。ICB-LAMP- CRISPR/Cas12a是一种高效检测空肠弯曲杆菌的方法，先用免疫捕获磁珠(ICB)捕获空肠弯曲杆菌，加热释放细菌基因组DNA用于LAMP反应后进行基于Cas12a的检测反应，该方法可以在70 min内检测低至8 CFU/mL的空肠弯曲杆菌[59]。研究者基于CRISPR-Cas13a也开发了多种类似检测方案。有研究团队结合PCR扩增与CRISPR-Cas13a开发了CCB-Detection方法，可在4 h内完成食品中低至100 amol/L的金黄色葡萄球菌污染的检测[60]。APC-Cas是另一种基于CRISPR-Cas13a的检测系统，能够在不提取细菌基因组的条件下对牛奶等样品中低至1 CFU/mL的肠炎沙门氏菌进行核酸检测[61]。还有研究者通过向CRISPR-Cas13a系统中引入发光RNA适配体，开发了一种无需扩增、无需转录、无需标记的细菌检测方案，能够快速检测并定量食物中枯草芽孢杆菌活菌[62]。
综上所述，基于CRISPR的核酸检测技术可以开发为适用于各种场景(如无电源和特殊仪器等)和实时动态(如检测靶标实时监测和疗效追踪评估等)检测的新型技术，是现有PCR核酸检测技术的重要补充，将极大地拓展核酸检测的适用性、应用领域及场景。
4 展望CRISPR的核酸检测能够在等温条件下完成高效特异检测，可以克服POCT设备在分子检测中复杂温度控制的一些关键限制，其性能可与基于PCR的技术相媲美。随着新型CRISPR- Cas蛋白的发现和原有系统的不断改进，将会为生物分子检测提供更多的可能性。我们相信，基于CRISPR的分子检测与最新的传感器技术相结合，将会革命性地改变POCT分子诊断市场，开发出更灵敏、更特异、更易用、更高通量、更快速、更智能、更高效的分子检测技术。不过目前基于CRISPR的核酸检测尚处于早期研发阶段，目前亟需聚焦解决的重大技术问题包括：(1) 单分子水平核酸灵敏准确检测；(2) 单分子水平核酸修饰准确检测；(3) 核酸检测的常温存储运输及使用；(4) 微量样品多指标的高通量检测；(5) 超短时间内精准检测；(6) 检测结果数字化及与物联网互通等。相信随着各方面技术的不断发展，基于CRISPR的分子检测技术可实现在任何时间与任何地点的高通量快速灵敏检测。
人工智能(artificial intelligence, AI)的快速发展及其在生物医药研发中的广泛应用，使得我们有望把AI和CRISPR技术融合，建立基于AI和CRISPR的核酸便捷检测产品平台，包括：(1) 建立基于AI的CRISPR检测的智慧产品设计体系。高度的检测靶标或病原异质性使得诊断的合理设计及其输出分析变得极其困难。通过AI赋能CRISPR产品设计，实现对检测疾病或病原的全信息分析，筛选预测最佳的检测靶点、高效特异crRNA、高效扩增引物等，将提高CRISPR产品设计精度，并缩短设计时间等，实现对包括血液、尿液、汗液、唾液和呼吸道等样本中的有效检测。ADAPT (activity-informed design with all-inclusive patrolling of targets)是目前已开发的一项基于AI和CRISPR的病毒检测技术，可通过机器深度学习在2 h内实现高通量的CRISPR-Cas13a检测组分最优化设计[63]。(2) 建立基于AI的CRISPR检测分析判读系统，进一步提高检测性能并消除与操作员对结果的解释相关的任何主观性。研发出一种CRISPR智能诊断设备，整合自动图像采集和算法处理，并通过AI处理整理后的数据，以进一步减少分析运行时间和CRISPR检测的主观性，并形成数字化结果。(3) CRISPR检测的智能预警。可实现实时准确的诊断数据更新，通过大数据的AI驱动的机器学习将更准确地警告风险并提供疫病对策建议，从而便于个人的健康管理与大数据化的疾病科学研究。目前基于AI与CRISPR的检测平台发展还处于起步阶段，可以预见，通过AI与CRISPR检测结合使用，将开发出快速、准确和智慧的检测系统。
| [1] |
PARDEE K, GREEN AA, TAKAHASHI MK, BRAFF D, LAMBERT G, LEE JW, FERRANTE T, MA D, DONGHIA N, FAN M, DARINGER NM, BOSCH I, DUDLEY DM, O'CONNOR DH, GEHRKE L, COLLINS JJ. Rapid, low-cost detection of zika virus using programmable biomolecular components. Cell, 2016, 165(5): 1255-1266. DOI:10.1016/j.cell.2016.04.059
|
| [2] |
ZHOU WH, HU L, YING LM, ZHAO Z, CHU PK, YU XF. A CRISPR-Cas9-triggered strand displacement amplification method for ultrasensitive DNA detection. Nature Communications, 2018, 9: 5012. DOI:10.1038/s41467-018-07324-5
|
| [3] |
HAJIAN R, BALDERSTON S, TRAN T, DEBOER T, ETIENNE J, SANDHU M, WAUFORD NA, CHUNG JY, NOKES J, ATHAIYA M, PAREDES J, PEYTAVI R, GOLDSMITH B, MURTHY N, CONBOY IM, ARAN K. Detection of unamplified target genes via CRISPR-Cas9 immobilized on a graphene field-effect transistor. Nature Biomedical Engineering, 2019, 3(6): 427-437. DOI:10.1038/s41551-019-0371-x
|
| [4] |
CHEN JS, MA EB, HARRINGTON LB, da COSTA M, TIAN XR, PALEFSKY JM, DOUDNA JA. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science, 2018, 360(6387): 436-439. DOI:10.1126/science.aar6245
|
| [5] |
LI SY, CHENG QX, WANG JM, LI XY, ZHANG ZL, GAO S, CAO RB, ZHAO GP, WANG J. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discovery, 2018, 4: 20.
|
| [6] |
TENG F, GUO L, CUI TT, WANG XG, XU K, GAO QQ, ZHOU Q, LI W. CDetection: CRISPR- Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity. Genome Biology, 2019, 20(1): 132. DOI:10.1186/s13059-019-1742-z
|
| [7] |
HARRINGTON LB, BURSTEIN D, CHEN JS, PAEZ-ESPINO D, MA EB, WITTE IP, COFSKY JC, KYRPIDES NC, BANFIELD JF, DOUDNA JA. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science, 2018, 362(6416): 839-842. DOI:10.1126/science.aav4294
|
| [8] |
GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, LEE JW, ESSLETZBICHLER P, DY AJ, JOUNG J, VERDINE V, DONGHIA N, DARINGER NM, FREIJE CA, MYHRVOLD C, BHATTACHARYYA RP, LIVNY J, REGEV A, KOONIN EV, HUNG DT, SABETI PC, COLLINS JJ, ZHANG F. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017, 356(6336): 438-442. DOI:10.1126/science.aam9321
|
| [9] |
ZHAO YX, CHEN F, LI Q, WANG LH, FAN CH. Isothermal amplification of nucleic acids. Chemical Reviews, 2015, 115(22): 12491-12545. DOI:10.1021/acs.chemrev.5b00428
|
| [10] |
SINGH D, MALLON J, PODDAR A, WANG YB, TIPPANA R, YANG O, BAILEY S, HA T. Real-time observation of DNA target interrogation and product release by the RNA-guided endonuclease CRISPR Cpf1(Cas12a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(21): 5444-5449. DOI:10.1073/pnas.1718686115
|
| [11] |
GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, KELLNER MJ, JOUNG J, COLLINS JJ, ZHANG F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, 2018, 360(6387): 439-444. DOI:10.1126/science.aaq0179
|
| [12] |
MA PX, MENG QZ, SUN BQ, ZHAO B, DANG L, ZHONG MT, LIU SY, XU HT, MEI H, LIU J, CHI T, YANG G, LIU M, HUANG XX, WANG XJ. MeCas12a, a highly sensitive and specific system for COVID-19 detection. Advanced Science: Weinheim, Baden- Wurttemberg, Germany, 2020, 7(20): 2001300.
|
| [13] |
LI LX, LI SY, WU N, WU JC, WANG G, ZHAO GP, WANG J. HOLMESv2:a CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation. ACS Synthetic Biology, 2019, 8(10): 2228-2237. DOI:10.1021/acssynbio.9b00209
|
| [14] |
YUE HH, SHU BW, TIAN T, XIONG EH, HUANG MQ, ZHU DB, SUN J, LIU Q, WANG SC, LI YR, ZHOU XM. Droplet Cas12a assay enables DNA quantification from unamplified samples at the single-molecule level. Nano Letters, 2021, 21(11): 4643-4653. DOI:10.1021/acs.nanolett.1c00715
|
| [15] |
LI ZH, ZHAO WC, MA SX, LI ZX, YAO YJ, FEI T. A chemical-enhanced system for CRISPR-Based nucleic acid detection. Biosensors and Bioelectronics, 2021, 192: 113493. DOI:10.1016/j.bios.2021.113493
|
| [16] |
OOI KH, LIU MM, TAY JWD, TEO SY, KAEWSAPSAK P, JIN SY, LEE CK, HOU JW, MAURER-STROH S, LIN WS, YAN B, YAN G, GAO YG, TAN MH. An engineered CRISPR-Cas12a variant and DNA-RNA hybrid guides enable robust and rapid COVID-19 testing. Nature Communications, 2021, 12: 1739. DOI:10.1038/s41467-021-21996-6
|
| [17] |
NGUYEN LT, SMITH BM, JAIN PK. Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection. Nature Communications, 2020, 11: 4906. DOI:10.1038/s41467-020-18615-1
|
| [18] |
DAI YF, SOMOZA RA, WANG L, WELTER JF, LI Y, CAPLAN AI, LIU CC. Exploring the trans-cleavage activity of CRISPR-Cas12a (cpf1) for the development of a universal electrochemical biosensor. Angewandte Chemie: International Ed in English, 2019, 58(48): 17399-17405. DOI:10.1002/anie.201910772
|
| [19] |
SETHI K, DAILEY GP, ZAHID OK, TAYLOR EW, RUZICKA JA, HALL AR. Direct detection of conserved viral sequences and other nucleic acid motifs with solid-state nanopores. ACS Nano, 2021, 15(5): 8474-8483. DOI:10.1021/acsnano.0c10887
|
| [20] |
NOURI R, JIANG YQ, TANG ZF, LIAN XL, GUAN WH. Detection of SARS-CoV-2 with solid-state CRISPR-Cas12a-assisted nanopores. Nano Letters, 2021, 21(19): 8393-8400. DOI:10.1021/acs.nanolett.1c02974
|
| [21] |
HEO W, LEE K, PARK S, HYUN KA, JUNG HI. Electrochemical biosensor for nucleic acid amplification-free and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2) RNA via CRISPR/Cas13a trans- cleavage reaction. Biosensors and Bioelectronics, 2022, 201: 113960. DOI:10.1016/j.bios.2021.113960
|
| [22] |
MYHRVOLD C, FREIJE CA, GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, METSKY HC, DURBIN AF, KELLNER MJ, TAN AL, PAUL LM, PARHAM LA, GARCIA KF, BARNES KG, CHAK B, MONDINI A, NOGUEIRA ML, ISERN S, MICHAEL SF, LORENZANA I, YOZWIAK NL, MACINNIS BL, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR- Cas13. Science, 2018, 360(6387): 444-448. DOI:10.1126/science.aas8836
|
| [23] |
JIANG YZ, HU ML, LIU AN, LIN Y, LIU LL, YU B, ZHOU XM, PANG DW. Detection of SARS-CoV-2 by CRISPR/Cas12a-enhanced colorimetry. ACS Sensors, 2021, 6(3): 1086-1093. DOI:10.1021/acssensors.0c02365
|
| [24] |
HU ML, YUAN CQ, TIAN T, WANG XS, SUN J, XIONG EH, ZHOU XM. Single-step, salt-aging-free, and thiol-free freezing construction of AuNP-based bioprobes for advancing CRISPR-based diagnostics. Journal of the American Chemical Society, 2020, 142(16): 7506-7513. DOI:10.1021/jacs.0c00217
|
| [25] |
JOUNG J, LADHA A, SAITO M, KIM NG, WOOLLEY AE, SEGEL M, BARRETTO RPJ, RANU A, MACRAE RK, FAURE G, IOANNIDI EI, KRAJESKI RN, BRUNEAU R, HUANG ML W, YU XG, LI JZ, WALKER BD, HUNG DT, GRENINGER AL, JEROME KR, et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. The New England Journal of Medicine, 2020, 383(15): 1492-1494. DOI:10.1056/NEJMc2026172
|
| [26] |
CHEN Y, MEI YX, ZHAO XH, JIANG XY. Reagents-loaded, automated assay that integrates recombinase-aided amplification and Cas12a nucleic acid detection for a point-of-care test. Analytical Chemistry, 2020, 92(21): 14846-14852. DOI:10.1021/acs.analchem.0c03883
|
| [27] |
FENG W, PENG HY, XU JY, LIU YM, PABBARAJU K, TIPPLES G, JOYCE MA, SAFFRAN HA, TYRRELL DL, BABIUK S, ZHANG HQ, LE XC. Integrating reverse transcription recombinase polymerase amplification with CRISPR technology for the one-tube assay of RNA. Analytical Chemistry, 2021, 93(37): 12808-12816. DOI:10.1021/acs.analchem.1c03456
|
| [28] |
de PUIG H, LEE RA, NAJJAR D, TAN X, SOEKNSEN LR, ANGENENT-MARI NM, DONGHIA NM, WECKMAN NE, ORY A, NG CF, NGUYEN PQ, MAO AS, FERRANTE TC, LANSBERRY G, SALLUM H, NIEMI J, COLLINS JJ. Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants. Science Advances, 2021, 7(32): eabh2944. DOI:10.1126/sciadv.abh2944
|
| [29] |
DING X, YIN K, LI ZY, LALLA RV, BALLESTEROS E, SFEIR MM, LIU CC. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications, 2020, 11: 4711. DOI:10.1038/s41467-020-18575-6
|
| [30] |
LU SH, TONG XH, HAN Y, ZHANG K, ZHANG YZ, CHEN QB, DUAN JY, LEI XL, HUANG MH, QIU Y, ZHANG DY, ZHOU X, ZHANG Y, YIN H. Fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA using suboptimal protospacer adjacent motifs for Cas12a. Nature Biomedical Engineering, 2022, 6(3): 286-297. DOI:10.1038/s41551-022-00861-x
|
| [31] |
WU H, HE JS, ZHANG F, PING JF, WU J. Contamination-free visual detection of CaMV35S promoter amplicon using CRISPR/Cas12a coupled with a designed reaction vessel: rapid, specific and sensitive. Analytica Chimica Acta, 2020, 1096: 130-137. DOI:10.1016/j.aca.2019.10.042
|
| [32] |
CHEN YJ, SHI Y, CHEN Y, YANG ZN, WU H, ZHOU ZH, LI J, PING JF, HE LP, SHEN H, CHEN ZX, WU J, YU YS, ZHANG YJ, CHEN H. Contamination-free visual detection of SARS-CoV-2 with CRISPR/Cas12a: a promising method in the point-of-care detection. Biosensors & Bioelectronics, 2020, 169: 112642.
|
| [33] |
WANG B, WANG R, WANG DQ, WU J, LI JX, WANG J, LIU HH, WANG YM. Cas12aVDet: a CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Analytical Chemistry, 2019, 91(19): 12156-12161. DOI:10.1021/acs.analchem.9b01526
|
| [34] |
YIN K, DING X, LI ZY, ZHAO H, COOPER K, LIU CC. Dynamic aqueous multiphase reaction system for one-pot CRISPR-Cas12a-based ultrasensitive and quantitative molecular diagnosis. Analytical Chemistry, 2020, 92(12): 8561-8568. DOI:10.1021/acs.analchem.0c01459
|
| [35] |
KAMINSKI MM, ABUDAYYEH OO, GOOTENBERG JS, ZHANG F, COLLINS JJ. CRISPR-based diagnostics. Nature Biomedical Engineering, 2021, 5(7): 643-656. DOI:10.1038/s41551-021-00760-7
|
| [36] |
ACKERMAN CM, MYHRVOLD C, THAKKU SG, FREIJE CA, METSKY HC, YANG DK, YE SH, BOEHM CK, KOSOKO-THORODDSEN TS F, KEHE J, NGUYEN TG, CARTER A, KULESA A, BARNES JR, DUGAN VG, HUNG DT, BLAINEY PC, SABETI PC. Massively multiplexed nucleic acid detection with Cas13. Nature, 2020, 582(7811): 277-282. DOI:10.1038/s41586-020-2279-8
|
| [37] |
HUANG MQ, LIU SH, XU YN, LI AQ, WU W, LIANG MF, NIU GY, WANG ZY, WANG T. CRISPR/Cas12a technology combined with RPA for rapid and portable SFTSV detection. Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 754995. DOI:10.3389/fmicb.2022.754995
|
| [38] |
ZHANG BB, XIA Q, WANG Q, XIA XY, WANG JK. Detecting and typing target DNA with a novel CRISPR-typing PCR (ctPCR) technique. Analytical Biochemistry, 2018, 561/562: 37-46. DOI:10.1016/j.ab.2018.09.012
|
| [39] |
ZHANG BB, WANG Q, XU XH, XIA Q, LONG FF, LI WW, SHUI YC, XIA XY, WANG JK. Detection of target DNA with a novel Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR (CARP) technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2018, 410(12): 2889-2900. DOI:10.1007/s00216-018-0873-5
|
| [40] |
WANG Q, ZHANG BB, XU XH, LONG FF, WANG JK. CRISPR-typing PCR (ctPCR), a new Cas9-based DNA detection method. Scientific Reports, 2018, 8: 14126. DOI:10.1038/s41598-018-32329-x
|
| [41] |
BROUGHTON JP, DENG XD, YU GX, FASCHING CL, SERVELLITA V, SINGH J, MIAO X, STREITHORST JA, GRANADOS A, SOTOMAYOR-GONZALEZ A, ZORN K, GOPEZ A, HSU E, GU W, MILLER S, PAN CY, GUEVARA H, WADFORD DA, CHEN JS, et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology, 2020, 38(7): 870-874. DOI:10.1038/s41587-020-0513-4
|
| [42] |
WANG XJ, ZHONG MT, LIU Y, MA PX, DANG L, MENG QZ, WAN WW, MA XD, LIU J, YANG G, YANG ZF, HUANG XX, LIU M. Rapid and sensitive detection of COVID-19 using CRISPR/Cas12a-based detection with naked eye readout, CRISPR/Cas12a- NER. Science Bulletin, 2020, 65(17): 1436-1439. DOI:10.1016/j.scib.2020.04.041
|
| [43] |
MENG QZ, WANG XJ, WANG YQ, DANG L, LIU XY, MA XD, CHI T, WANG X, ZHAO Q, YANG G, LIU M, HUANG XX, MA PX. Detection of the SARS-CoV-2 D614G mutation using engineered Cas12a guide RNA. Biotechnology Journal, 2021, 16(6): e2100040. DOI:10.1002/biot.202100040
|
| [44] |
NIU MW, HAN Y, DONG X, YANG L, LI F, ZHANG YC, HU Q, XIA XS, LI H, SUN YS. Highly sensitive detection method for HV69-70del in SARS-CoV-2 alpha and Omicron variants based on CRISPR/Cas13a. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, 10: 831332. DOI:10.3389/fbioe.2022.831332
|
| [45] |
LIANG YH, ZOU LR, LIN HQ, LI BS, ZHAO JH, WANG HY, SUN JF, CHEN JD, MO YL, YANG XF, DENG XL, TANG SX. Detection of major SARS-CoV-2 variants of concern in clinical samples via CRISPR-Cas12a-mediated mutation-specific assay. ACS Synthetic Biology, 2022, 11(5): 1811-1823. DOI:10.1021/acssynbio.1c00643
|
| [46] |
LIANG YH, LIN HQ, ZOU LR, DENG XL, TANG SX. Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay. Biosensors and Bioelectronics, 2022, 205: 114098. DOI:10.1016/j.bios.2022.114098
|
| [47] |
FOZOUNI P, SON S, de LEÓN DERBY MD, KNOTT GJ, GRAY CN, D'AMBROSIO MV, ZHAO CY, SWITZ NA, KUMAR GR, STEPHENS SI, BOEHM D, TSOU CL, SHU J, BHUIYA A, ARMSTRONG M, HARRIS AR, CHEN PY, OSTERLOH JM, MEYER-FRANKE A, JOEHNK B, et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell, 2021, 184(2): 323-333. DOI:10.1016/j.cell.2020.12.001
|
| [48] |
HUANG CH, LEE KC, DOUDNA JA. Applications of CRISPR-cas enzymes in cancer therapeutics and detection. Trends in Cancer, 2018, 4(7): 499-512. DOI:10.1016/j.trecan.2018.05.006
|
| [49] |
LIU Y, CHEN YL, DANG L, LIU YX, HUANG SS, WU SY, MA PX, JIANG HQ, LI Y, PAN YB, WEI YC, MA XD, LIU M, JI QJ, CHI T, HUANG XX, WANG XJ, ZHOU FL. EasyCatch, a convenient, sensitive and specific CRISPR detection system for cancer gene mutations. Molecular Cancer, 2021, 20(1): 157. DOI:10.1186/s12943-021-01456-x
|
| [50] |
LIANG MD, LI ZL, WANG WS, LIU JK, LIU LS, ZHU GL, KARTHIK L, WANG M, WANG KF, WANG Z, YU J, SHUAI YT, YU JM, ZHANG L, YANG ZH, LI C, ZHANG Q, SHI T, ZHOU LM, XIE F, et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications, 2019, 10: 3672. DOI:10.1038/s41467-019-11648-1
|
| [51] |
XIONG Y, ZHANG JJ, YANG ZL, MOU QB, MA Y, XIONG YH, LU Y. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society, 2020, 142(1): 207-213. DOI:10.1021/jacs.9b09211
|
| [52] |
QIAO B, XU JK, YIN WH, XIN WM, MA LX, QIAO J, LIU Y. "Aptamer-locker" DNA coupling with CRISPR/Cas12a-guided biosensing for high-efficiency melamine analysis. Biosensors and Bioelectronics, 2021, 183: 113233. DOI:10.1016/j.bios.2021.113233
|
| [53] |
IWASAKI RS, BATEY RT. SPRINT: a Cas13a-based platform for detection of small molecules. Nucleic Acids Research, 2020, 48(17): e101. DOI:10.1093/nar/gkaa673
|
| [54] |
CHEN YJ, WU H, QIAN S, YU XP, CHEN H, WU J. Applying CRISPR/Cas system as a signal enhancer for DNAzyme-based lead ion detection. Analytica Chimica Acta, 2022, 1192: 339356. DOI:10.1016/j.aca.2021.339356
|
| [55] |
SUN X, WANG Y, ZHANG L, LIU S, ZHANG M, WANG J, NING BA, PENG Y, HE J, HU YG, GAO ZX. CRISPR-Cas9 triggered two-step isothermal amplification method for EE. coli O157:H7 detection based on a metal-organic framework platform. Analytical Chemistry, 2020, 92(4): 3032-3041. DOI:10.1021/acs.analchem.9b04162
|
| [56] |
LEE SY, OH SW. Filtration-based LAMP-CRISPR/Cas12a system for the rapid, sensitive and visualized detection of Escherichia coli O157:H7. Talanta, 2022, 241: 123186. DOI:10.1016/j.talanta.2021.123186
|
| [57] |
LIU H, WANG JB, ZENG HJ, LIU XF, JIANG W, WANG Y, OUYANG WB, TANG XM. RPA-Cas12a-FS: a frontline nucleic acid rapid detection system for food safety based on CRISPR-Cas12a combined with recombinase polymerase amplification. Food Chemistry, 2021, 334: 127608. DOI:10.1016/j.foodchem.2020.127608
|
| [58] |
ZHUANG JW, ZHAO ZY, LIAN K, YIN LJ, WANG JJ, MAN SL, LIU GZ, MA L. SERS-based CRISPR/Cas assay on microfluidic paper analytical devices for supersensitive detection of pathogenic bacteria in foods. Biosensors and Bioelectronics, 2022, 207: 114167. DOI:10.1016/j.bios.2022.114167
|
| [59] |
LI C, CHEN X, WEN RQ, MA P, GU K, LI C, ZHOU CY, LEI CW, TANG YZ, WANG HN. Immunocapture magnetic beads enhanced the LAMP-CRISPR/Cas12a method for the sensitive, specific, and visual detection of Campylobacter jejuni. Biosensors, 2022, 12(3): 154. DOI:10.3390/bios12030154
|
| [60] |
ZHOU J, YIN LJ, DONG YN, PENG L, LIU GZ, MAN SL, MA L. CRISPR-Cas13a based bacterial detection platform: sensing pathogen Staphylococcus aureus in food samples. Analytica Chimica Acta, 2020, 1127: 225-233. DOI:10.1016/j.aca.2020.06.041
|
| [61] |
SHEN JJ, ZHOU XM, SHAN YY, YUE HH, HUANG R, HU JM, XING D. Sensitive detection of a bacterial pathogen using allosteric probe-initiated catalysis and CRISPR-Cas13a amplification reaction. Nature Communications, 2020, 11: 267. DOI:10.1038/s41467-019-14135-9
|
| [62] |
ZHANG T, ZHOU WH, LIN XY, KHAN MR, DENG S, ZHOU M, HE GP, WU CY, DENG RJ, HE Q. Light-up RNA aptamer signaling-CRISPR-Cas13a-based mix- and-read assays for profiling viable pathogenic bacteria. Biosensors and Bioelectronics, 2021, 176: 112906. DOI:10.1016/j.bios.2020.112906
|
| [63] |
METSKY HC, WELCH NL, PILLAI PP, HARADHVALA NJ, RUMKER L, MANTENA S, ZHANG YB, YANG DK, ACKERMAN CM, WELLER J, BLAINEY PC, MYHRVOLD C, MITZENMACHER M, SABETI PC. Designing sensitive viral diagnostics with machine learning. Nature Biotechnology, 2022, 40(7): 1123-1131. DOI:10.1038/s41587-022-01213-5
|