表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)，即HER1或ErbB1，是ErbB受体家族中的一种跨膜酪氨酸激酶受体。ErbB受体家族由4种受体(ErbB1–4或HER1–4) 组成，其中EGFR的特征最为明显^[1]。EGFR基因与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭转移及抑制凋亡有密切关系^[2]。

EGFRvIII首次发现于人胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)。研究发现正常细胞中不表达EGFRvIII，EGFRvIII仅表达于癌细胞中，这一发现使其成为癌症治疗的理想生物标志物^[3]。许多恶性肿瘤异常表达EGFR，其中包括肺小细胞癌、膀胱癌、胶质瘤及乳腺癌等^[4]。EGFRvIII突变是一种最常见的EGFR胞外区突变。国内外研究发现：40%–60%的GBM显著表达EGFR，其突变体形式主要为EGFRvIII^[5]。有研究表明18.6%的GBM出现EGFRvIII高表达，25%的EGFRvIII阳性肿瘤也表达野生型EGFR^[6]。GBM是一种高侵袭性的恶性胶质瘤^[7]，EGFRvIII在调控胶质母细胞瘤的生长、转移和血管生成方面发挥重要作用。尤其是在肿瘤的放疗和化疗过程中，发挥类似逃逸的功能，其放疗和化疗的效果均不甚理想，术后常有复发，5年相对存活率仅有3%–5%^[8]。

单域抗体(single domain antibody, sdAb)，分子量约12–15 kDa，是一种特殊的二聚体抗体。sdAb又称为纳米抗体(nanobody) 或重链抗体(heavy chain antibody, HcAb)。单域抗体的体积只有传统抗体的10%且功能完整^[9]，仅具有单一重链可变区，保留了完整的抗原结合活性特征。与传统的单克隆抗体(150 kDa) 相比，sdAb具有体积小、亲和力高、易表达、渗透性好、稳定性高(热、pH和离液介质)、生产成本低等特点^[10]。目前用于疾病的诊断和治疗的功能性sdAb的主要制备方法为噬菌体展示抗体库技术^[11]。

本试验通过构建EGFRvIII胞外区重组腺病毒，用重组腺病毒免疫双峰驼后构建EGFRvIII特异性噬菌体单域抗体库。通过噬菌体展示技术对构建的特异性噬菌体单域抗体库进行富集和筛选，对筛选出的克隆进行诱导表达、纯化及鉴定，最终得到的单域抗体具有较高抗原结合活性和免疫学反应性。为今后以EGFRvIII为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的试验依据。

人前列腺癌细胞系PC-3由内蒙古农业大学生命科学学院巩培老师惠赠，人胚肾细胞系HEK293A细胞由北京交通大学何金生教授惠赠。用于构建重组腺病毒的穿梭质粒pAdTrack-CMV及携带重组腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌(Escherichia coli) BJ5183感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。凝胶回收试剂盒、NotⅠ、SalⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自宝日医生物技术(北京) 有限公司；牛外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；PmeⅠ、PacⅠ限制性内切酶购自NEB (北京) 公司；EZ Trans细胞转染试剂购自上海李记生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；SDS-PAGE蛋白胶试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；琼脂粉、酵母提取物、胰化蛋白胨购自OXOID公司；ELISA终止液、牛血清白蛋白、ELISA包被液均购自索莱宝生物科技有限公司；TMB显色液购自普洛麦格生物技术有限公司。全蛋白提取试剂盒购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；EGFR胞外区蛋白(Human EGFR/HER1/ErbB1 Protein (IsoformvIII，His Tag))、EGFR抗体(EGFR/HER1/ErbB1 Antibody，Rabbit mAb) 购自义翘神州生物技术有限公司；HRP标记Anti-HA tag购自南京金斯瑞生物技术有限公司。

成年3岁双峰驼，雄性，体重约为350 kg，无疫病史。所有动物实验均在内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会(编号：NND2021035) 的监督和指导下进行。

根据GenBank中双峰驼抗体基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计2对特异性引物P1/P2和P3/P4；根据EGFRvIII基因序列，设计特异性引物EGFR1/EGFR2，分别插入NotⅠ、SalⅠ酶切位点，送生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。EGFRvIII胞外区基因长度为1 056 bp，P1/P2扩增产物长度为900 bp和600 bp，P3/P4扩增产物长度为400 bp，引物序列信息见表 1。

从PC-3细胞中提取总RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，以EGFR1/EGFR2为引物，扩增EGFRvIII胞外区基因。将EGFRvIII胞外区基因与pAdTrack-CMV质粒分别用SalⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行酶切。将回收的基因片段与pAdTrack-CMV质粒用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化至E. coli Trans-T1感受态细胞后于LB/Kana固体培养基中培养。次日挑取3个单菌落接种于LB/Kana液体培养基培养，提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，反应产物用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳。将鉴定正确的菌落过夜培养，提取质粒后用PmeⅠ限制性内切酶酶切，将线性化产物通过电转化至E. coli BJ5183感受态细胞(含有pAdEasy-1质粒) 中让其发生同源重组，电转产物于LB/Kana平板上培养。次日挑取单克隆，提取质粒后进行电泳(0.8%的琼脂糖凝胶)。将电泳正确的质粒用PacⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定。

用含10%新生牛血清、1%双抗(100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL链霉素) 的DMEM液体培养基于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱培养，待细胞密度约80%时更换含2%新生牛血清的DMEM，每25 mm细胞培养瓶用EZ Trans细胞转染试剂转染4 μg质粒。37 ℃培养6 h后更换新鲜培养基。待细胞开始变圆呈现葡萄串状，约70%细胞漂浮后收取细胞，冻融3次，离心取上清液，即为第1代重组腺病毒。将HEK293A细胞接种至75 mm细胞瓶，待细胞培养汇合度约达到70%后，加入600 μL第1代重组腺病毒。3 d后约60%–70%细胞漂浮，用移液枪将细胞瓶中的细胞吹下连同培养液一起转移至离心管，4 ℃、1 000 r/min离心5 min；沉淀用5 mL PBS重悬，于液氮反复冻融4次，4 ℃、15 000 r/min离心15 min，收集上清分装于1.5 mL离心管内，病毒原液于–80 ℃保存。反复感染HEK293A细胞，扩增至第5代重组腺病毒。利用PCR方法检测重组腺病毒中的EGFRvIII基因。提取细胞全蛋白，采用Western blotting方法验证EGFRvIII胞外区基因在HEK293A细胞中能否正常表达。采用CsCl梯度离心法纯化病毒，透析后采用TCID₅₀法测定重组腺病毒滴度，用Reed-Muench法计算TCID₅₀。

使用剂量为1 mL 1×10¹⁰ PFU/mL的重组腺病毒采用肌肉注射的方式对双峰驼进行免疫，每隔14 d免疫一次。采集双峰驼免疫后的全血，使用牛外周血淋巴细胞分离试剂盒分离淋巴细胞，并提取总RNA，通过RT-PCR转化为cDNA。将cDNA作为PCR的模板，以P1/P2作为引物进行第1轮扩增，回收目的条带为600 bp的产物。将回收产物作为第2轮PCR的模板，P3/P4作为引物进行第2轮扩增，回收目的条带为400 bp的产物。使用限制性内切酶NcoⅠ和NotⅠ将第2轮PCR回收的产物及pMECS噬菌粒载体进行双酶切，将酶切产物进行切胶回收并使用T4 DNA连接酶连接，连接产物通过化学转化的方法转化至E. coli TG1感受态细胞，于2×YT/AG固体培养基进行培养，构建EGFRvIII特异性噬菌体单域抗体库，构建成功后测定其抗体库容量及转化效率。

EGFRvIII胞外区蛋白以每轮递减的方式将抗原包被在酶标板上。加入300 μL/孔PBST，洗5遍。加入待筛选的噬菌体抗体库，于37 ℃放置1 h。加入300 μL/孔PBST，洗5遍。100 μL/孔三乙胺洗脱缓冲液(100 mmol/L)，室温下静置10 min；加入50 μL/孔1 mol/L Tris-HCl (pH 9.7) 缓冲液进行中和。将洗脱后的重组噬菌体感染大肠杆菌TG1，涂布于2×YT/AG固体培养基过夜培养，此步骤重复3次。从3轮洗脱产物涂布的2×YT/AG固体培养基上随机挑取90个单克隆过夜培养。次日各取50 μL加入到含有400 μL 2×YT/AG+M13K07的液体中，37 ℃、250 r/min培养2 h后14 000 r/min离心5 min，用400 μL的2×YT/AK液体培养基重悬沉淀后过夜培养。次日4 ℃、14 000 r/min离心5 min后收集上清液。加入20%的PEG8 000充分混匀，于4 ℃静置30 min后4 ℃、10 000 r/min离心20 min，离心后弃上清，取100 μL PBS重悬重组噬菌体，用于phage ELISA的鉴定。

将EGFRvIII胞外区蛋白按照2 μg/孔包被在酶标板中，每孔加入100 μL重组噬菌体，以PBS缓冲液作为空白对照，辅助噬菌体M13K07作为阴性对照。室温结合2 h后每孔加入100 μL HRP标记的anti-M13抗体(1︰5 000稀释)。室温结合1 h后每孔加入100 μL TMB溶液进行显色，显色结束后加入50 μL/孔2 mol/L H₂SO₄终止反应并测定OD₄₅₀值。将(试验组OD₄₅₀值–空白组OD₄₅₀值)/(阴性对照OD₄₅₀值–空白组OD₄₅₀值)≥2.1 (P/N值) 以上即判定为阳性。

取phage ELISA阳性克隆菌液50 μL加入到5 mL 2×YT液体培养基中，37 ℃、250 r/min过夜培养，对培养后的菌液进行质粒提取并基因测序。经序列分析后，将正确的克隆质粒用限制性内切酶NcoⅠ和NotⅠ进行双酶切，与相同的限制性内切酶酶切的pET-22b(+) (NotⅠ和XhoⅠ位点中间携带HA标签序列) 质粒进行连接，将连接产物转化至E. coli Transetta (DE3) 感受态细胞，于2×YT/A固体培养基培养。挑取单克隆至5 mL 2×YT液体培养基中，37 ℃、250 r/min过夜培养。取500 μL菌液加入到50 mL 2×YT/A液体培养基通过IPTG诱导表达，培养8–12 h后离心收集菌体。加入10 mL PBS重悬菌体后使用超声波破碎仪进行破碎，待菌液破碎至几乎透明后于4 ℃离心机离心，分别收集上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析。利用Ni-NTA纯化填料对破碎后上清进行纯化并纯化获得的重组单域抗体。

用100 μL/孔5 μg/mL的EGFRvIII胞外区蛋白包被酶标板，3% BSA封闭2 h后用PBST洗涤；以不同浓度稀释的重组单域抗体作为一抗，以PBS为空白对照，pET-22b(+) 空质粒的细菌破碎液为阴性对照(培养及诱导纯化条件与1.2.6相同)，100 μL/孔孵育1 h后用PBST洗涤；以1︰8 000比例稀释的HRP标记的Anti-HA tag为二抗，100 μL/孔孵育1 h后用PBST洗涤；100 μL/孔TMB溶液显色10 min后加入50 μL/孔2 mol/L H₂SO₄终止反应，测定OD₄₅₀值。当(试验组OD₄₅₀值–空白组OD₄₅₀值)/(阴性对照OD₄₅₀值–空白组OD₄₅₀值)≥2.1 (即P/N值) 以上即判定为阳性。

以反转录得到的cDNA为模板，EGFR1/ EGFR2为引物扩增EGFRvIII胞外区基因，得到的目的条带大小为1 056 bp (图 1A)，与预期大小一致。将EGFRvIII胞外区基因与pAdTrack-CMV质粒的连接产物转化E. coli Trans-T1感受态细胞后涂布于LB/Kana固体培养基上进行培养。次日挑取3个单克隆于5 mL LB/Kana液体培养基中进行培养，提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，反应产物用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳。得到一条9 000 bp和一条1 000 bp左右的条带(图 1B)，与预期大小一致。

图 1 EGFRvIII胞外区基因PCR扩增(A) 及重组腺病毒穿梭载体双酶切鉴定(B) Fig. 1 PCR amplification of EGFRvIII ECD gene (A) and identification of recombinant adenovirus shuttle vector by enzyme digestion (B). (A) Lane M: DL2000 DNA marker; lane 1–2: PCR products of the EGFRvIII ECD gene. (B) Lane M: DL15000 DNA marker; lane 1: DL2000 DNA marker; lane 2–4: the digestion product of recombinant shuttle vector; lane 6: the digestion product of pAdTrack-CMV vector.

图选项

将重组腺病毒穿梭载体线性化后通过电转化的方法转入E. coli BJ5183感受态细胞后涂布于LB/Kana固体培养基上培养，次日挑取单克隆培养，提取质粒，用0.8%的琼脂糖凝胶检测。在15 000 bp以上有特异性条带，理论大小约30 000 bp，初步判断重组腺病毒载体构建成功，结果如图 2所示。将电泳正确的质粒用PacⅠ限制性内切酶进行单酶切鉴定。在15 000 bp以上和4 500 bp左右有特异性条带(图 3)，与理论值相符，重组腺病毒载体构建成功。

图 2 重组腺病毒表达载体鉴定 Fig. 2 Identification of recombinant adenovirus expression vectors. Lane M: DL15000 DNA marker; lanes 1–5: the recombinant plasmid.

图选项

图 3 重组腺病毒表达载体酶切鉴定 Fig. 3 Identification of recombinant adenoviral expression vectors by enzyme digestion. Lane M: DL15000 DNA marker; lanes 1–5: the recombinant adenovirus plasmid with pAdEasy-1 backbone expression vectors and EGFRvIII ECD gene; lane 6: pAdTrack-CMV vector.

图选项

将重组腺病毒载体转染到HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装，转染后持续观察HEK293A细胞中荧光表达量，3 d后可见荧光蛋白的表达，7 d后表达量显著增多，结果如图 4所示。

图 4 EGFRvIII胞外区基因重组腺病毒的包装 Fig. 4 Packaging of recombinant adenovirus with EGFRvIII extracellular domain gene.

图选项

待病毒扩增至第5代时，收集细胞上清及细胞裂解液，以EGFR1/EGFR2为引物采用PCR方法验证EGFRvIII胞外区基因在HEK293A细胞中的表达，结果如图 5所示。提取细胞总蛋白，采用Western blotting方法验证EGFRvIII胞外区基因在HEK293A细胞中的表达。以1︰8 000稀释的EGFR兔单克隆抗体作为一抗，1︰10 000稀释的山羊抗兔单克隆抗体作为二抗，在38 kDa左右有特异性条带(图 6)，与理论值相符。采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒，透析后获得2.5 mL病毒液。用TCID₅₀法测定病毒滴度，用Reed-Muench法计算重组腺病毒滴度为1×10¹⁰ PFU/mL。

图 5 PCR鉴定EGFRvIII胞外区基因 Fig. 5 PCR identification of EGFRvIII ECD gene. Lane M: DL2000 DNA marker; lane 1: cell lysate of recombinant adenovirus-transfected cells; lane 2: supernatant of recombinant adenovirus-transfected cells; lane 3: control cell lysate; lane 4: control cell supernatant.

图选项

图 6 Western blotting鉴定EGFRvIII胞外区基因表达 Fig. 6 Western blotting identification of the expression of EGFRvIII ECD gene. Lane M: protein molecular weight marker; lane 1: total protein of HEK293A cells infected with recombinant adenovirus.

图选项

以骆驼的cDNA为模板通过两轮PCR扩增VHH基因。利用特异性引物P1/P2进行第1轮PCR扩增，扩增出抗体前导肽至CH2区基因序列，扩增产物在900 bp和600 bp有特异性条带(图 7A)；切胶回收600 bp的条带作为第2轮PCR扩增的模板，利用特异性引物P3/P4进行PCR扩增，扩增出VHH基因FR1–FR4全长基因，扩增产物在400 bp有特异性条带(图 7B)。

图 7 VHH PCR扩增结果 Fig. 7 VHH PCR amplification. (A) The first round of PCR amplification. Lane M: DL2000 DNA marker; lane 1–2: first round of PCR amplification products. (B) The second round of PCR amplification. Lane M: DL2000 DNA marker; lane 1–3: second round of PCR amplification products.

图选项

通过倍比稀释的方法测定构建的抗体库库容量，计算后得出抗体库库容为1.4×10⁹；通过菌落PCR的方法测定抗体库的转化效率，随机挑取2×YT/AG固体培养基上24个单克隆进行PCR鉴定。结果显示有19个单克隆在600 bp左右出现特异性条带(图 8)，初步鉴定抗体库重组率为79%。

图 8 抗体库转化效率检测结果 Fig. 8 Antibody library transformation efficiency. Lane M: DL2000 DNA marker; lane 1–24: PCR amplification products from individual clone.

图选项

以辅助噬菌体M13K07为阴性对照，PBS为空白对照，通过phage ELISA的方法鉴定3轮筛选洗脱后的重组噬菌体。其中M13K07的OD₄₅₀值为0.060。phage ELISA结果(图 9) 显示有31个重组噬菌体具有抗原结合活性，从中选取结合活性最高的14号克隆(E14) 进行表达、纯化及鉴定。

图 9 重组噬菌体phage-ELISA检测结果 Fig. 9 Phage-ELISA detection of binding of recombinant phage.

图选项

通过SDS-PAGE对表达和纯化后的重组sdAb E14进行分析，结果显示(图 10A)，通过诱导表达后的菌液、细菌破碎后的上清液和沉淀均在17 kDa左右出现特异性条带，与重组单域抗体E14理论大小相符。将纯化后的重组sdAb E14进行SDS-PAGE，结果显示(图 10B)，通过纯化得到了纯度较高的重组sdAb E14。

图 10 E14抗体表达和纯化结果 Fig. 10 E14 antibody expression and purification. (A) SDS-PAGE analysis of sdAb E14 expression. Lane M: protein molecular weight marker; lane 1: uninduced E. coli cells; lane 2: induced E. coli cells; lane 3: sediment of E. coli cells lysates; lane 4: supernatant of E. coli cells lysates. (B) SDS-PAGE analysis of sdAb E14 purification. Lane M: protein molecular weight marker; lane 1: purified sdAb E14 antibody.

图选项

为了检测纯化的重组sdAb E14对EGFRvIII蛋白的结合活性，用EGFRvIII胞外区蛋白包被酶标板，用重组sdAb E14作为一抗进行ELISA鉴定，以pET-22b(+) 空载体转化菌液的破碎液为阴性对照，PBS为空白对照。结果显示(图 11)，EGFRvIII蛋白与sdAb E14的浓度呈现相关性。与阴性对照相比，当sdAb E14浓度为312.5 ng/mL时仍具有结合活性。

图 11 重组单域抗体对抗原结合特性ELISA鉴定结果 Fig. 11 ELISA identification of recombinant single domain antibodies for antigen binding properties.

图选项

表皮生长因子受体EGFR在多种实体肿瘤细胞中高度表达，比如肺癌、结肠癌、头颈癌、口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)等^[12]。在很长的一段时间里，中国的EGFR靶向药物市场一直被外国进口药物所垄断，2008年我国第一个用于治疗恶性肿瘤的功能性单抗药物泰欣生(尼妥珠单抗^[13-14]) 获准上市，首次打破了国外垄断。目前用于治疗EGFRvIII阳性肿瘤的方法主要有西妥昔单抗等单克隆抗体或吉非替尼等小分子抑制剂，但使用这些药物治疗的胶质瘤细胞往往表现出很强的耐药^[15]。它们只是通过增加其他生长因子的表达量或者使它们转向不同的信号通路来克服抑制作用。而EGFR单克隆抗体能够竞争性结合EGFR，阻断由EGFR与配体结合介导的下游信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖和生长分化、促进细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管的生成和增加放化疗疗效，被认为是一种有希望的免疫抑制药物^[16-17]。sdAb可以与荧光染料、小分子药物、寡核苷酸结合，使其应用于广泛的领域，包括成像、治疗和检测，以及作为递送剂。在影像学应用中，将sdAb带上标签后可以用作纳米级的检测工具，可将半衰期短的放射性核素标记单域抗体后用于肿瘤成像；sdAb可以单独使用或与其他中和抗体协同使用，可以通过小螯合剂或直接与放射性治疗性核素偶联(或与小药物偶联成抗体-药物偶联物)，从而达到快速外渗及向深部组织扩散；在医学诊断中，sdAb作为捕获剂和检测剂被引入即时电化学测试中，可以缩短检测时间并提高诊断的灵敏度；此外，sdAb可以通过吸入的方式被输送到肺部，可以用于呼吸系统疾病的治疗^[18-19]。目前EGFRvIII单域抗体药物还没有被批准上市，因此EGFRvIII单域抗体药物的研发具有广阔的应用前景和研究意义。

目前，用于基因干预的方法主要有腺相关病毒导入、逆转录病毒、慢病毒和腺病毒等^[20]。20世纪60年代末，人们发现腺病毒在培养过程中是可以进行重组的，这一发现为腺病毒作为载体奠定了基础^[21]。研究发现，用腺病毒作为疫苗免疫人类时，不需要免疫佐剂就能很好地刺激自然免疫反应^[22]。目前已开发出多种具有不同免疫刺激细胞因子和趋化因子的腺病毒。在最近的研究中，已经开发出许多带有免疫激活配体和双特异性T细胞剪接剂(BiTE) 分子的腺病毒，并在临床研究中进行了测试^[23]。

本研究利用Ad5型重组腺病毒系统成功构建并纯化了EGFRvIII胞外区基因重组腺病毒，通过Western blotting鉴定发现EGFRvIII胞外区基因可以由HEK293A细胞包装并在HEK293A细胞中稳定表达。通过测定TCID₅₀计算病毒滴度为1×10¹⁰ PFU/mL；以骆驼外周血淋巴细胞作为建库基因来源，成功构建了EGFRvIII胞外区特异性噬菌体单域抗体库。噬菌体抗体库的质量取决于抗体库的库容及重组率，重组率越高的抗体库筛选到特异性抗体的概率越高，经过计算EGFRvIII单域抗体库库容量为1.4×10⁹，达到预期标准。采用phageELISA筛选出31株阳性克隆，选择其中1株结合活性最高的14号克隆(命名为E14) 通过大肠杆菌进行表达纯化。通过ELISA鉴定，重组单域抗体E14能够与EGFRvIII胞外区蛋白特异性结合。本研究通过表达EGFRvIII胞外区基因的重组腺病毒免疫双峰驼，构建噬菌体抗体库，筛选和制备了EGFRvIII特异性单域抗体，为今后以EGFRvIII为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗奠定了实验基础。