中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 史志远, 陈璐萍, 李博星, 朱宝利, 律娜
- SHI Zhiyuan, CHEN Luping, LI Boxing, ZHU Baoli, LYU Na
- 不同粪便DNA提取方法比较分析
- Comparative analysis of different fecal DNA extraction methods
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3542-3550
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3542-3550
- 10.13345/j.cjb.220085
-
文章历史
- Received: January 31, 2022
- Accepted: April 29, 2022
2. 中国科学院大学 存济医学院, 北京 100049
2. Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
随着现代分子技术不断发展,测序成本下降,越来越多研究聚焦于人体肠道微生物与疾病的关系。大量研究表明,不同个体的肠道菌群结构、肠道微生物多样性,与炎症性肠病[1-4]以及肥胖等代谢性疾病的发生、发展密切相关[5-8]。因此,揭示肠道微生物群落结构与宿主健康间的关系,有助于为相关疾病的治疗提供思路[9-11]。目前,肠道菌群的研究主要依赖于测序技术,与传统培养方法相比,该方法更便捷和高效。但测序技术所依赖的实验过程,例如:样本采集后的保存、DNA提取、文库构建等过程,均有可能对最终群落结构的分析结果产生影响[12-14]。其中,DNA提取是关键环节之一,该过程所得微生物基因组DNA的纯度以及对原始肠道菌群组成比例的还原能力,将直接影响下游测序数据质量和肠道群落结构多样性结果[15-16]。因此,评估不同DNA提取方法对肠道特定种属的提取效果,对于全面、准确地获取人体肠道微生物谱,深入探究肠道微生物群落结构具有指导意义。
本研究旨在对5种基于离心柱法提取DNA的试剂盒进行比较,借助qPCR技术,以DNA提取纯度、浓度,以及对肠道中特定种属微生物基因组DNA的提取丰度为指标,综合评估5种DNA提取方法的效果,推测不同DNA提取方法对肠道微生物谱分析的影响,以期为后续相关实验中DNA提取方法的选择提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料 1.1.1 粪便样本健康个体的粪便样本。
1.1.2 仪器和试剂组织研磨仪、涡旋振荡器、金属浴恒温器、低温高速离心机、Qubit荧光定量仪、ABI7500实时荧光定量PCR仪和Bio Tek Epoch全波长酶标仪。其中,实验过程中DNA提取所用试剂盒信息如表 1所示。
Kit name | Abbreviation | Manufacturer |
TIANamp Stool DNA Kit | TG | TIANGEN BIOTECH |
QIAamp PowerFecal® Pro DNA Kit | Q | QIAGEN |
QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit | M | QIAGEN |
PSP® Spin Stool DNA Plus Kit | PSP | STRATEC Molecular |
In-house Common Kit | N | SELF-DEVELOPED |
如图 1所示,本研究利用粪便采集管,收集5名健康个体的粪便样本,分装后及时保存于–80 ℃冰箱。取健康志愿者的粪便样本250 mg,分别利用表 1所示的5种DNA提取方法,对志愿者肠道微生物基因组进行提取。提取细胞内DNA的基本原理是利用DNA分子与细胞内其他组分(如:蛋白质、脂质、多糖等) 理化性质的差异,通过特定的物理或化学方法使不同组分得以分离。主要包括细胞裂解和纯化两大基本过程,即利用裂解液,使蛋白质变性,破坏细胞结构,再经过一系列纯化步骤,提取DNA,去除其他成分。根据纯化方式的不同,可将DNA提取方法分为多种类型,如目前常见的酚氯仿抽提法、盐析法、离心柱法和磁珠法等[17-19]。本研究旨在对5种基于离心柱法提取DNA的试剂盒进行比较,具体DNA提取操作步骤详见试剂盒说明书。
1.2.2 DNA质量、浓度检测吸取2 μL提取所得DNA,用Bio Tek Epoch全波长酶标仪测定不同试剂盒提取所得基因组DNA的浓度和A260/A280,初步检测不同DNA提取方法的效果。随后用Qubit® dsDNA HS Assay Kit和Qubit荧光定量仪对提取得到的DNA浓度进行精准定量。
1.2.3 实时荧光定量PCR检测将DNA样本与所需试剂置于冰上融化并混匀,按表 2所示比例进行混合,将适当体积的主混合物、DNA模板和引物加入到qPCR板的每个反应孔中,短暂离心,放入ABI 7 500实时荧光定量PCR仪中进行定量检测。实时荧光定量PCR主要通过向扩增体系中加入特异性的荧光基团,根据特定阶段荧光阈值与起始DNA模板拷贝数的线性关系,借助标准曲线,实现对起始DNA丰度的准确定量[20-21]。本研究中拟杆菌门微生物的定量检测使用染料法,其余微生物物种的定量均使用Taqman探针法,具体引物信息请见表 3。
Reagents | Volume (μL) | Final concentration |
KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix | 10.0 | 1× |
10 µmol/L Forward Primer | 0.4 | 100–400 nmol/L |
10 µmol/L Reverse Primer | 0.4 | 100–400 nmol/L |
10 µmol/L Probe | 0.8 | 100–500 nmol/L |
Template DNA | 2.0 | < 250 ng |
50× ROX Low | 0.4 | 1× |
Aseptic water | 6.0 | ‒ |
Primer name | Primer sequences (5′→3′) | Size (bp) | |
Total | Forward | CGTCAGCTCGTGYCGTGAG | 19 |
Reverse | CGTCRTCCCCRCCTTCC | 17 | |
Probe | FAM-TTAAGTCCCRYAACGAGCGCAACCC-TAMRA | 25 | |
Bifidobacterium | Forward | GCGTGCTTAACACATGCAAGTC | 22 |
Reverse | CACCCGTTTCCAGGAGCTATT | 21 | |
Probe | FAM-TCACGCATTACTCACCCGTTCGCC-TAMRA | 24 | |
Lactobacillus | Forward | TGGATGCCTTGGCACTAGGA | 20 |
Reverse | AAATCTCCGGATCAAAGCTTACTTAT | 26 | |
Probe | FAM-TATTAGTTCCGTCCTTCATC | 20 | |
Faecalibacterium prausnitzii | Forward | CCCGGCATCGGGTAGAG | 17 |
Reverse | GGACGCGAGGCCATCTC | 17 | |
Probe | FAM-AAAAGGAGCAATCCGCT | 17 | |
Akkermansia muciniphila | Forward | CAGCACGTGAAGGTGGGGAC | 20 |
Reverse | CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT | 20 | |
Probe | FAM-CCCCACCTTCCTCCCAGTTGAT | 22 | |
Bacteroidetes | Forward | CRAACAGGATTAGATACCCT | 20 |
Reverse | GGTAAGGTTCCTCGCGTAT | 19 | |
Candida albicans | Forward | TTGATAACCCTGAAGATTTTGA | 22 |
Reverse | ACCCATAATCAACTTCATCAGA | 22 | |
Probe | FAM-TGGGATACTGCTGCTGCCAA | 20 | |
Escherichia coli | Forward | CAACGAACTGAACTGGCAGA | 20 |
Reverse | CATTACGCTGCGATGGAT | 18 | |
Probe | FAM-CCCGCCGGGAATGGTGATTAC | 21 |
应用5种DNA提取试剂盒分别对5名健康个体的粪便样本进行DNA提取,所得DNA的完整性结果如图 2所示,Q试剂盒和N试剂盒提取所得DNA的电泳条带单一、明亮,降解程度小,质量较高。PSP试剂盒提取所得DNA电泳条带弥散并伴有RNA污染。相比之下,M试剂盒和TG试剂盒提取所得DNA的电泳条带较暗,DNA浓度较低。
此外,以A260/A280比值为DNA纯度指标[22],评估不同方法的提取效果。纯DNA样本A260/A280的比值为1.8,通常情况下,DNA A260/A280比值在1.8–2.0之间为佳。若比值低于1.6,表明提取所得DNA有蛋白质等污染,高于2.2则表明有较多RNA残留。如图 3B所示,试剂盒PSP、TG提取所得DNA A260/A280比值整体高于1.9,平均值分别为1.97和1.92,表明通过这两种试剂盒提取得到的DNA可能有RNA残留。而其余3种试剂盒Q、N和M提取所得DNA A260/A280比值均在1.8左右,平均值分别为1.83、1.84和1.82,表明该3种方法所得DNA纯度较高。
2.2 特异性Qubit荧光法测定DNA浓度与传统紫外分光光度计测定DNA浓度相比,利用特异性和高灵敏度的荧光探针能够实现对DNA分子的准确定量。图 3A为5种方法提取所得DNA经Qubit荧光定量仪测定后的提取浓度。经克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test) 可知,不同提取方法所得DNA浓度差异显著(P < 0.05)。其中,Q试剂盒提取所得DNA浓度最高,平均为134.62 ng/μL。N试剂盒次之,平均浓度为56 ng/μL。PSP试剂盒提取所得DNA平均浓度位居第三,为53.78 ng/μL,但由于其存在一定的RNA残留(图 3B),因此该结果可能高于实际浓度。与其他3种试剂盒相比,M和TG试剂盒提取所得DNA浓度最低,平均浓度分别为13.76 ng/μL和9.89 ng/μL,与图 2较暗的电泳条带结果一致。
2.3 5种提取方法所得细菌丰度的绝对定量对于特定肠道微生物基因组的提取,不同试剂盒的提取效果存在差异。本研究选取了7种常见人体肠道微生物,分别为双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、白色念珠菌(Candida albicans) 和大肠杆菌(Escherichia coli),利用实时荧光定量PCR技术,通过设计种属特异性的探针来准确定量提取所得指定微生物的丰度,评估不同试剂盒,对指定肠道微生物基因组的提取效果,以推测不同DNA提取方法对肠道群落结构分析的影响。如图 4所示,是不同提取方法对5名健康个体指定肠道微生物提取平均丰度的比较结果。纵轴代表 1 μL提取所得DNA中指定微生物16S rRNA基因的拷贝数(为了方便展示,为原始数据取对数后的数值)。
对于粪便样本中总16S rRNA基因即总菌(total) 的提取效果,如图 4A所示,Q试剂盒提取所得丰度最高,平均为1.70×109 copies/μL。N试剂盒提取所得总菌丰度位居第二,为1.02×109 copies/μL。而其他3种试剂盒提取所得总菌丰度相对较低,M试剂盒:4.22×108 copies/μL、PSP试剂盒:3.08×108 copies/μL、TG试剂盒:1.64×108 copies/μL。
相比之下,对于双歧杆菌属、乳杆菌属等革兰氏阳性菌基因组的提取,试剂盒Q具有更好的提取效果,N试剂盒次之(图 4B,4C)。以双歧杆菌为例,Q试剂盒提取所得平均拷贝数为1.15×107 copies/μL,N试剂盒的提取丰度平均为1.20×106 copies/μL。而试剂盒PSP、TG和M,提取所得平均丰度较低,分别为1.35×105 copies/μL、1.15×105 copies/μL和2.58×104 copies/μL。
对于拟杆菌门微生物基因组的提取(图 4F),M、N、Q试剂盒提取所得拷贝数,显著高于PSP、TG试剂盒。同时,对于肠道白色念珠菌的提取(图 4G),PSP、TG试剂盒所得拷贝数也显著低于其他3种方法。值得注意的是,就肠道普拉梭菌、阿克曼氏菌和大肠杆菌的提取丰度而言,不同方法间差异不显著(P > 0.05)。
3 结论与讨论对于肠道内特定微生物,如普拉梭菌、阿克曼氏菌和大肠杆菌的提取,不同方法间差异不显著。但对于具有特殊细胞壁结构的革兰氏阳性菌而言,不同方法的提取效果差异显著。提取过程中的裂解步骤可能是导致这种差异的主要原因之一。除裂解液组分的影响外,机械振荡研磨有助于获得更多样的微生物群落结构[23]。同时,Santiago等[24]研究发现,研磨珠机械振荡可提高群落中Blautia、Bifidobacterium等革兰氏阳性菌的丰度,与未经研磨珠机械振荡的对照组相比,二者间的群落结构存在明显差异。因此,不同DNA提取方法对肠道中特定菌种提取效果的差异,是影响肠道微生物谱分析结果的重要原因之一。
本研究比较了5种DNA提取方法在提取质量、DNA浓度以及所得细菌丰度方面的差别。其中,应用较为广泛的Q试剂盒,其提取效果最佳,平均浓度为134.62 ng/μL,所得DNA纯度较高,A260/A280比值平均为1.83。与Lim等[14]、吴仲文等[25]的研究结果一致,Q方法对革兰氏阳性菌如双歧杆菌有较好的提取效果,是获取高质量基因组DNA的有效方法。N试剂盒成本较低,其平均DNA提取浓度较Q试剂盒低,但在纯度方面,二者无显著性差异。与其他3种商用试剂盒(M、PSP、TG) 相比,N方法对肠道内指定微生物基因组的提取效果仅次于Q试剂盒,位居第二。相比之下,M试剂盒提取所得DNA,质量较高,但浓度偏低,对于肠道内革兰氏阳性菌的提取效果不很理想。而试剂盒TG和PSP提取所得DNA,在浓度、质量以及细菌丰度方面均不及其他验证的试剂盒。此外,在Lim等[23]的研究中,Q试剂盒提取所得肠道微生物群落的α多样性显著高于M试剂盒。
综上所述,Q试剂盒可作为肠道微生态研究相关实验中获取高质量基因组DNA的方法,但根据不同的实验要求与目的,可选择不同的提取方法。
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