2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 陈永臣, 温金燕, 祁丹丹, 童晓梅, 刘宁宁, 叶昕
- CHEN Yongchen, WEN Jinyan, QI Dandan, TONG Xiaomei, LIU Ningning, YE Xin
- 乙型肝炎病毒上调的lnc-HUR1抑制肝癌细胞凋亡
- HBV-upregulated Lnc-HUR1 inhibits the apoptosis of liver cancer cells
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3501-3514
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3501-3514
- 10.13345/j.cjb.220101
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文章历史
- Received: February 11, 2022
- Accepted: April 14, 2022
引用本文
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2. 中国科学院微生物研究所, 北京 100101
2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
原发性肝癌是全球第六大最常见的癌症，也是全球第三大癌症死亡原因，2020年全球新增肝癌病例约90.6万例，死亡约83万人[1]。其中肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 患者约占原发性肝癌患者数量的90%，HCC是肝癌的主要形式[2]。导致形成HCC的因素有很多，包括肝炎病毒感染、酒精肝脏疾病、酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝等。HCC的形成过程包含炎症和肝硬化，最后形成肿瘤[3]，但并不是所有的HCC患者都需要经历这几个阶段，就肝硬化和HCC的关系而言，形成80%−90%的肝硬化患者会形成HCC，HCC患者中2%−4%是肝硬化患者[4]。导致肝癌的主要因素因地域差异而不同，例如在中国和韩国，肝癌的发生主要是由于HBV的持续感染和黄曲霉素的污染；在日本和意大利肝癌的发生主要和丙型乙肝病毒 (hepatitis C virus, HCV) 的持续感染有关[5]。HBV感染和HCV感染分别占全球肝癌死亡人数的56%和20%[6]，在全球范围内，HCC患者的死亡率以每年2%−3%的速率在逐年上升，这和其他癌症的情况是相反的，例如乳腺癌、前列腺癌和肺癌等[7]，消除病毒性肝炎是预防肝癌的关键策略。乙型肝炎病毒感染是一个主要的全球健康问题，据数据统计，目前为止，全球约30亿人感染HBV，其中约有2.4亿是慢性乙肝患者，每年因为乙型肝炎病毒死去的人数约达90万[8]。值得注意的是，全球超过一半的HCC患者是因为感染了HBV而引起的[9]，HBV可以通过直接或者间接的方式促进肝癌的发生，直接的致癌作用包括将病毒基因组整合进宿主基因组中，使宿主染色体不稳定以及产生大量的突变[10]，及HBV X蛋白 (HBx) 与宿主因子相互作用，HBx可以通过促进HCC细胞中的上皮间质转化进而促进HCC细胞侵袭和转移[11]；HBx通过上调HCC细胞中的NAD依赖性去乙酰化酶 (sirtuin-1, SIRT1) 蛋白进而促进HCC的肿瘤生成[12]；HBx可通过抑制miR-129-5p的功能进而促进表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 表达，提高细胞增殖速率[13]；HBx与宿主细胞的淋巴细胞性白血病中缺失的长链非编码RNA (deleted in lymphocytic leukemia long noncoding RNA, DLEU LncRNA) 结合进而维持cccDNA 以及宿主癌症相关基因的转录[14]；HBx通过抑制microRNA-145a-5p促进小鼠肝癌发生[15]；HBx介导不育α基序结构域和组氨酸-天冬氨酸结构域蛋白质1 (sterile alpha motif domain and histidine-aspartate domain-containing protein 1, SAMHD1) 降解并通过Akt/p27通路促进肝癌细胞增殖[16]；HBV的间接作用包括HBV病毒感染引起的慢性炎症、氧化应激等，促使肝脏遗传变异和表观遗传变异的积累，导致慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化等肝损伤，最终导致肿瘤的发生和发展[17]。
长链非编码序列 (lncRNA) 是指核苷酸长度超过200 bp且不具备编码功能的RNA。研究表明lncRNA与肝癌、乳腺癌、肺癌等多种固体肿瘤的发生发展相关。例如lncRNA MCM3AP反义RNA1 (MCM3AP antisense RNA 1, MCM3AP-AS1) 通过与miR-194-5p结合作为竞争内源性RNA (competing endogenous RNAs, ceRNA) 发挥作用，进一步促进miR-194-5p的靶标基因叉头框蛋白A1 (forkhead box A1, FOXA1) 表达，进而促进HCC细胞的增殖[18]；lncRNA 00152通过激活Janus激酶/信号转导和转录活化蛋白3 (Janus kinase/signal transducers and activator of transcription, JAK2/STAT3) 信号通路促进HCC发生发展[19]；Lnc NBR2通过细胞外调控蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinase, ERK) 和c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK) 信号通路抑制Beclin 1依赖的细胞凋亡，进而抑制细胞凋亡引起的HCC细胞增殖[20]。通过RNA深度测序分析，我们鉴定了一条HBV上调的长链非编码RNAlnc-HUR1，lnc-HUR1可以通过抑制p53转录活性促进肝癌细胞的增殖，在肝癌的发生发展过程中具有重要的作用。本研究进一步探究了lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的影响及其分子机制。通过检测caspase3/7活性，聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1) 剪切水平以及细胞凋亡水平，我们发现lnc-HUR1可以抑制肝癌细胞的凋亡，进一步的细胞及动物实验数据显示lnc-HUR1可以调控凋亡相关因子Bcl-2和BAX的转录且这一过程依赖p53的转录活性。总之，我们发现HBV上调的长链非编码RNA lnc-HUR1通过p53依赖的方式调控凋亡抑制因子Bcl-2和促凋亡因子BAX的转录，抑制肝癌细胞的凋亡。
1 材料与方法 1.1 材料感受态细胞Trans 5α购自北京全式金生物技术股份有限公司。质粒来自实验室保存库。anti-p53抗体购自Santa Cruz Biotechnology，anti-human poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) 抗体、anti-Bcl2抗体、anti-BAX抗体购自Cell Signaling Technology，anti-actin抗体购自天津三箭生物技术股份有限公司，anti-tubulin抗体购自博奥瑞京 (北京)。细胞株均为实验室保存。Lnc-HUR1肝特异性转基因小鼠委托中国医学科学院医学实验动物研究所构建。TRIzol购自Invitrogen公司；Protease Cocktail Inhibitor购自Roche公司；RNase Inhibitor购自英潍捷基 (上海) 有限公司；Luciferase Assay试剂盒和Caspase-Glo1® 3/7 Assay购自Promega公司；PAN胎牛血清购自Biotech公司；杜尔伯科改良伊格尔培养基 (Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco, DMEM) 培养基购自Life Technologies；脂质体转染试剂购自上海翊圣生物科技有限公司；Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix购自翌圣生物科技 (上海) 股份有限公司；逆转录试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB) 显色液、ChIpAssayKit购自上海碧云天生物技术有限公司；二辛可宁酸 (bicinchonininc acid, BCA) 蛋白定量测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技 (北京)。
1.2 实验方法 1.2.1 lnc-HUR1稳定细胞系的构建从美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 获得lnc-HUR1序列，设计引物从互补脱氧核糖核酸 (complementary DNA, cDNA) 文库中扩增出全长lnc-HUR1，并将其构建到pcDNA3.1载体，命名为pCMV-lnc-HUR1质粒。将质粒pCMV-lnc-HUR1及对照质粒pcDNA3.1转染HepG2细胞，用800 μg/mL遗传霉素 (geneticin, G418) 筛选，获得稳定过表达lnc-HUR1的细胞系 (HepG2-lnc-HUR1) 和对照细胞 (HepG2-3.1)。根据lnc-HUR1的序列，我们用Thermo shRNA预测网站设计靶向lnc-HUR1的shRNA，(HUR1-shRNA#1靶向HUR1的nt 507−524序列，HUR1-shRNA#2靶向HUR1的nt 277−298序列)，并连接至PSI-HI-GFP质粒中，构建HUR1-shRNA#1和HUR1-shRNA#2质粒。包装靶向lnc-HUR1的shRNA慢病毒及对照病毒，感染HepG2细胞。用流式细胞仪分选出GFP阳性细胞，获得lnc-HUR1稳定敲低细胞系(HepG2-HUR1-shRNA#1, HepG2-HUR1-shRNA#2) 及对照细胞系 (HepG2-NC)。
1.2.2 实时荧光定量PCR实验过程中细胞用TRIzol (Life Technologies, 350301) 裂解，提取总RNA，并通过cDNA反转录试剂盒 (北京全式金生物技术股份有限公司，#N11213) 获得cDNA文库，按照Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Pius) (翌圣生物科技 (上海) 股份有限公司, H1125100) 进行实时荧光定量PCR。所用引物见表1。
| Primer name | Primer sequences (5′→3′) | Size (bp) | |
| Lnc-HUR1 | F | TCGGAACATAGGGAGCAAACG | 21 |
| R | AGACCAGTGTACA AAGGGATAGG | 23 | |
| Bcl-2 (human) | F | GGTGGGGTCATGTGTGTGG | 19 |
| R | CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC | 22 | |
| Bcl-2 (mouse) | F | ATGCCTTTGTGGAACTATATGGC | 23 |
| R | GGTATGCACCCAGAGTGATGC | 21 | |
| BAX (human) | F | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG | 21 |
| R | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT | 21 | |
| BAX (mouse) | F | TGAAGACAGGGGCCTTTTTG | 20 |
| R | AATTCGCCGGAGACACTCG | 19 | |
| Bcl Promoter | F | AAAGAGCTGGATTATAACTA | 20 |
| R | CTTGCGCCATCCTTCCCCGAAAA | 23 | |
| Bax Promoter | F | GTCACTGAAGC GACTGATGT | 20 |
| R | CTTCTTCCAGATGGTGAGTGAG | 22 | |
前一天用293T细胞铺24孔板，第2天细胞长至60%−80%密度后转染PGL4-Bax promoterluciferase或PGL4-Bcl-2 promoter-luciferase和renill质粒，海肾荧光素 (Renilla) 为内参。转染36 h后吸弃上清，用磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline, PBS) 清洗；每孔加入100 μL细胞裂解液，放置在摇床上室温裂解20 min；将裂解液转入到EP管中，离心后，分别吸取10 μL上清加入到96孔酶标板中；在荧光测定仪上测定双萤光素酶活性及Renilla数值，以Renilla为内参计算萤光素酶活性。
1.2.4 Western blotting分析在细胞样品中加入细胞裂解液，置于冰上裂解20 min；对于小鼠肝组织，液氮研磨，放置冰上裂解20 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒 (鼎国昌盛，B1700150) 进行蛋白定量。取等量蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (dodecyl sulfate sodium salt (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。80 V进行浓缩胶电泳，样品浓缩后在120 V进行分离胶电泳。之后进行蛋白转膜，封闭，一抗孵育和二抗孵育。最后使用TMB试剂显色。
1.2.5 染色质免疫共沉淀实验 (ChIP assay)染色质免疫共沉淀实验使用标准实验方法进行，主要实验步骤如下，细胞用甲醛固定后用裂解液裂解，裂解后的细胞用超声破碎仪将DNA打断至200−1 000 bp的合适片段，并与anti-p53抗体或对照IgG孵育，然后与蛋白A磁珠共孵育，富集获得的DNA用于实时定量PCR实验。Bcl启动子引物以及Bax启动子引物如表1。
1.2.6 Annexin X和PI联合染色检测细胞凋亡细胞使用胰酶消化后，室温1 000 r/min离心5 min；用预冷的PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min，吸弃PBS；加入300 μL的1×结合缓冲液悬浮细胞；加入5 μL的膜联蛋白Ⅴ标记，避光，室温孵育15 min；加入5 μL的碘化丙啶 (propidiumIodide, PI) 染色；加200 μL的1×结合缓冲液，使用流式细胞仪分析凋亡情况。
1.2.7 Caspase 3/7活性检测Caspase3/7检测试剂提前解冻，按说明书配制caspase3/7检测缓冲液；在96孔板中，加入一定量诱导凋亡药物，在细胞培养箱中孵育4−6 h，诱导细胞凋亡；每孔加入100 μL caspase3/7检测缓冲液，摇匀，避光，室温孵育1 h；使用Promega荧光仪进行检测。
1.2.8 CCL4诱导急性肝损伤准备8周龄大的雄性野生型小鼠或者lnc-HUR1转基因小鼠；将CCL4与矿物油按 1︰1的比例配制成注射液，采用腹腔注射，注射量为2.4 μL/g，对照组腹腔注射矿物油；24 h后处死小鼠，取出肝组织，提取RNA和蛋白质，用于反转录合成cDNA和Western blotting。实验设计符合中国科学院微生物研究所动物实验与人类生物医学研究伦理审查办法，批准单位为中国科学院微生物研究所伦理委员会，批准号为APZMCAS2019009。
1.2.9 BCA蛋白浓度测定按说明书将50体积试剂A和1体积试剂B的比例配制适量BCA工作液，充分混匀；将蛋白标准样品按0、1、2、4、6、8、10 μL加入到96孔板中，加双蒸水补足到10 μL；取10 μL待测样品加入96孔板中，每个测定做2−3个平行；向待测样品孔和蛋白标准品孔加入200 μL BCA工作液，混匀；37 ℃恒温孵育30 min；酶标仪562 nm波长处测定吸光度；制作标准曲线，从标准曲线中计算样品浓度。
1.2.10 数据处理统计分析采用配对t检验。使用GraphPad Prism 5.0版软件进行分析，统计显著性用星号表示 (*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.000 1)。
2 结果与分析 2.1 Lnc-HUR1具有抑制肝癌细胞凋亡的作用 2.1.1 Lnc-HUR1能够抑制caspase3/7的活性为了分析lnc-HUR1是否具有抑制细胞凋亡的功能，将pCMV-lnc-HUR1质粒及对照pcDNA3.1空载体质粒转染至HepG2细胞中，并用G418筛选，构建HepG2过表达细胞系HepG2-lnc-HUR1及过表达对照细胞HepG2-3.1；用携带靶向lnc-HUR1的shRNA (#1，#2) 及对照shRNA (不靶向细胞内任何基因的random序列) 感染HepG2细胞，构建HepG2敲低
细胞系 (HepG2-HUR1-shRNA#1, HepG2-HUR1-shRNA#2) 及敲低对照细胞 (HepG2-NC)。首先以HepG2-3.1为对照检测HepG2-lnc-HUR1的过表达效果 (图1A左)，以HepG2-NC为对照检测HepG2-HUR1-shRNA#1和HepG2-HUR1-shRNA#2的敲低效果 (图1B)。分别使用TGF-β、五氟尿嘧啶 (5-fluorouracil, 5-FU) 和星孢菌素 (staurosporine) 处理过表达lnc-HUR1的稳定细胞系HepG-lnc-HUR1和对照细胞系HepG2-3.1 6 h，加入caspase3/7检测缓冲液，避光室温孵育1 h，检测荧光值，并以细胞HepG2-3.1为对照归一化。结果表明，与对照组相比 (图1A)，过表达lnc-HUR1能够显著降低TGF-β、五氟尿嘧啶和星孢菌素引起的caspase3/7活性的升高，说明过表达lnc-HUR1能够抑制TGF-β、五氟尿嘧啶和星孢菌素引起的细胞凋亡；相反，在相同药物的处理条件下，敲低lnc-HUR1与对照组相比显示更高的caspase3/7的活性，说明敲低lnc-HUR1后促进TGF-β、五氟尿嘧啶和星孢菌素引起的细胞凋亡 (图1B)。以上结果表明lnc-HUR1能够抑制caspase3/7的活性，对促凋亡药物产生的凋亡效果起抑制作用。
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| 图 1 Lnc-HUR1抑制HepG2细胞caspase3/7活性 Fig. 1 Lnc-HUR1 inhibits caspase3/7 activity in HepG2 cells HepG2-3.1 and HepG2-lnc-HUR1 cells (A) or HepG2-NC HepG2-HUR1-shRNA#1 and HepG2-HUR1-shRNA#2 (B) were treated with TGF-β (10 ng/mL), 5-FU (40 mg/mL) or stauroporine (1 mmol/L) for 6 hours. The cell lysates were harvested for caspase3/7 activity assay. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.000 1. |
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用TGF-β (终浓度为10 ng/mL) 处理HepG2-3.1、HepG2-lnc-HUR1和HepG2-NC、HepG2-HUR1-shRNA#1及HepG2-HUR1-shRNA#2细胞，诱导细胞凋亡，对照组不做处理。6 h后收样，Western blotting检测PARP-1的剪切情况。结果显示 (图2A)，HepG2-3.1和HepG2-lnc-HUR1在没有使用TGF-β处理的情况下，细胞内PARP-1基本都没有被剪切；在使用TGF-β处理的情况下，HepG2-3.1、HepG2-lnc-HUR1细胞均出现PARP-1剪切带，但HepG2-lnc-HUR1中PARP-1的剪切带比HepG2细胞中剪切带要弱，说明过表达lnc-HUR1能够抑制TGF-β引起的PARP-1的剪切，抑制细胞的凋亡。在敲低lnc-HUR1的稳定细胞系中 (图2B)，在没有使用TGF-β处理的情况下，HepG2-HUR1-shRNA#1和HepG2-HUR1-shRNA#2中已经出现了微弱的PARP-1剪切带，推测可能是lnc-HUR1的敲低引起了细胞本身启动了凋亡程序，增加了PARP-1的剪切；在TGF-β处理的情况下HepG2-NC、HepG2-HUR1-shRNA#1和HepG2-HUR1-shRNA#2均出现了PARP-1的剪切带，但是敲低lnc-HUR1的细胞中PARP-1的剪切带比对照细胞要更明显，说明lnc-HUR1能够促进细胞内PARP-1的剪切和细胞的凋亡。
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| 图 2 Lnc-HUR1抑制PARP-1的剪切 Fig. 2 Lnc-HUR1 inhibits PARP-1 cleavage in HepG2 cells. HepG2-3.1 and HepG2-lnc-HUR1 cells (A) or HepG2-NC, HepG2-HUR1-shRNA#1 and HepG2-HUR1-shRNA#2 (B) were treated with TGF-β (10 ng/mL) for 6 hours. The cell lysates were harvested and subjected to immunoblotting with PARP-1 antibody, and with actin as an internal control. |
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为了进一步验证lnc-HUR1能够抑制细胞凋亡，使用AnnexinⅤ和PI联合染色，再利用流式细胞仪检测Annexin Ⅴ阳性细胞比率。结果显示 (图3A)，不使用TGF-β处理的情况下，HepG2-3.1细胞和HepG2-lnc-HUR1细胞的凋亡情况没有显著性差异；当在TGF-β处理的条件下，HepG2-lnc-HUR1细胞的Annexin Ⅴ阳性细胞率显著低于HepG2-3.1细胞。另外一组实验在没有使用TGF-β处理的情况下 (图3B)，HepG2-NC、HepG2-HUR1-shRNA#1和HepG2-HUR1-shRNA#2 Annexin Ⅴ的阳性细胞率没有显著性差异；在TGF-β处理的条件下，HepG2-HUR1-shRNA#1和HepG2-HUR1-shRNA#2的Annexin Ⅴ阳性细胞率显著高于对照组HepG2-NC的Annexin Ⅴ的阳性率。提示lnc-HUR1在细胞内能够通过抑制caspase3/7的活性，进而抑制caspase3/7对PARP-1的剪切，从而抑制细胞的凋亡。
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| 图 3 Lnc-HUR1抑制TGF-β诱导的细胞凋亡 Fig. 3 Lnc-HUR1 inhibits cell apoptosis induced by TGF-β. HepG2-3.1 and HepG2-lnc-HUR1 cells (A) or HepG2-NC, HepG2-HUR1-shRNA#1 and HepG2-HUR1-shRNA#2 cells (B) were treated with TGF-β (10 ng/mL) for 6 hours. Then cells were stained with Annexin V and PI, and subjected to flow cytometry (left panels). The Annexin V positive cells were calculated (right panels). ns: no significance. |
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将过表达lnc-HUR1的稳定细胞HepG2-lnc-HUR1及其对照细胞HepG-3.1、敲低lnc-HUR1的稳定细胞 (HepG2-HUR1-shRNA#1 and HepG2-HUR1-shRNA#2) 及其对照细胞(HepG2-NC) 收样后，进行RT-PCR检测细胞中Bcl-2及BAX的mRNA水平和Western blotting 检测Bcl-2及BAX的蛋白水平。结果显示 (图4A)，与对照相比，过表达lnc-HUR1会促进Bcl-2的表达，抑制BAX的表达；相反地 (图4B)，敲低lnc-HUR1会抑制Bcl-2的表达，促进BAX的表达。提示lnc-HUR1在细胞水平能够调节Bcl-2及BAX的表达水平进而影响细胞的凋亡。
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| 图 4 Lnc-HUR1促进Bcl-2的表达和抑制BAX的表达 Fig. 4 Lnc-HUR1 promotes the expression of Bcl-2 and inhibits the expression of BAX. HepG2-3.1 and HepG2-lnc-HUR1 cells (A) or HepG2-NC, HepG2-HUR1-shRNA#1 and HepG2-HUR1-shRNA#2 cells (B) were harvest, and the total RNA were extracted and sujected to by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) for the mRNA level of lnc-HUR1, Bax and Bcl-2 (left panels). The total cell lysates were collected for immunoblotting with indicated antibodies (right panels). |
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为进一步研究lnc-HUR1在体内对Bcl-2表达的调控作用，腹腔注射野生型和lnc-HUR1肝特异性转基因小鼠CCL4与矿物油的混合物 (CCL4︰MO=1︰1，用量为2.4 μL/g)，24 h后收小鼠肝组织，利用Western blotting检测Bcl-2的蛋白表达。结果显示 (图5)，与野生型相比，lnc-HUR1转基因小鼠肝组织表达更高水平的Bcl-2。提示在体内lnc-HUR1促进了Bcl-2表达。
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| 图 5 Lnc-HUR1能在体内促进Bcl-2的表达 Fig. 5 Lnc-HUR1 promotes the expression of Bcl-2 in vivo. The wild type and lnc-HUR1 transgenic mice were treated with CCL4 (1.2 mL/kg) for 24 hours, then the mice were sacrificed. The lysates of liver tissues were prepared for immunoblotting with Bcl-2 antibody or Tubulin antibody as an internal control (A). The density of Bcl-2 in (A) was quantified (B). |
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为了验证Lnc-HUR1是否通过p53调控Bcl-2和BAX的表达，将质粒pcDNA3.1及pCMV-lnc-HUR1转染至HCT116细胞及敲除p53的HCT116细胞 (HCT116-p53−/−)，之后进行RT-PCR检测细胞Bcl-2及BAX的mRNA表达 (图6A)。结果显示p53参与lnc-HUR1对Bcl-2和BAX表达的调控。为了进一步确定p53在lnc-HUR1调控Bcl-2家族蛋白表达中的作用，在p53存在或者不存在条件下，在293T细胞中转染BAX和Bcl-2荧光素酶报告基因质粒和海肾荧光素酶基因质粒，再转染不同剂量的lnc-HUR1。24 h后收样，检测荧光值。结果显示 (图6B)，单独转染p53的条件下，能够促进BAX启动子抑制Bcl-2启动子；在转染p53的情况下同时转染lnc-HUR1，lnc-HUR1能够抑制BAX的启动子，促进Bcl-2的启动子，lnc-HUR1剂量越高，对p53调控Bcl-2和Bax转录的抑制效果越好。以上结果说明lnc-HUR1通过p53调控Bcl-2和BAX的表达。接下来通过染色质免疫共沉淀 (chromatin immunoprecipitation, ChIP) 探究lnc-HUR1影响p53作为转录因子对Bcl-2和BAX的转录调控。分别使用IgG和抗p53抗体进行免疫共沉淀，纯化DNA后进行实时荧光定量PCR检测BAX和Bcl-2启动子区DNA的量。结果显示 (图6C)，lnc-HUR1能够影响p53在BAX和Bcl-2启动子区的富集，从而抑制BAX的转录，促进Bcl-2的转录。综上所述，lnc-HUR1能够通过p53调节Bcl-2和BAX的表达，Bcl-2和Bax水平的变化可以影响线粒体外膜的通透性，从而调控caspase级联反应抑制细胞凋亡。
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| 图 6 Lnc-HUR1对Bcl-2和Bax的转录调控依赖于p53 Fig. 6 Lnc-HUR1 regulates the transcription of Bcl-2 and Bax dependent upon p53. (A) pCMV-3.1-lnc-HUR1 (lnc-HUR1) and pCMV-3.1 (3.1) were transfected into HCT116 or HCT116 p53−/− cells. The cells were harvest and total RNA were extracted for qRT-PCR. (B) pCMV-3.1-lnc-HUR1 (lnc-HUR1), pCMV-p53 and pGL4-Bax-Luciferase (left) or pGL4-Bcl-2-luciferase (right) were co-transfected into 293T cells for 24 hours. The cell lysates were harvested and subjected to luciferase asaay. (C) HepG2-3.1 and HepG2-lnc-HUR1 cells were fixed with formaldehyde, and the chromatin were sonicated and subjected to chromatin immunoprecipitation with p53 antibody or IgG as control. The enrichment of p53 on Bax and Bcl-2 promoter were detected by qRT-PCR. |
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乙型肝炎病毒HBV是一种小包膜DNA病毒，属于肝炎病毒科。病毒基因组包含3.2 kb，有4个开放阅读框：编码外膜蛋白的S基因区、编码核衣壳蛋白的C基因区、编码P蛋白的 P基因区及编码X蛋白的X基因区[21]。宿主细胞感染乙肝病毒后，细胞内的lncRNA的表达谱也会发生改变[22]，这些表达差异的lncRNA与HBV相关。为了鉴定这些与HBV相关的长链非编码RNA，通过RNA深度测序技术 (RNA deep sequencing) 分析比较了HepG2和HBV转基因细胞系HepG2-4D14细胞系中lncRNA的表达差异，选取了在HepG2-4D14细胞中上调表达倍数最高的一条命名为lnc-HUR1。实验室前期的结果表明，lnc-HUR1在肝癌患者癌组织中显著上调，能够促进细胞的增殖和肿瘤的形成[23]。LncRNA在肿瘤细胞的增殖和凋亡方面发挥重要的调节作用，在报道的大多数能促进肿瘤细胞增殖的lncRNA中都能减少细胞的凋亡[24]。在lnc-HUR1抑制肝癌细胞凋亡的研究中，本研究以课题组先前的研究结果作为基础展开工作，进一步阐释了lnc-HUR1作为促癌基因抑制细胞凋亡的分子机制，更加完全展现lnc-HUR1的功能。本研究证明，lnc-HUR1能够通过抑制p53活性，进而促进Bcl-2的表达抑制BAX的表达，从而抑制细胞的凋亡。其中，lnc-HUR1对p53活性的抑制作用还需要进一步的探究。此外，lnc-HUR1作为促癌基因对肝癌细胞的转移和浸润是否有促进作用也需要进一步的探究。在CCL4诱导急性肝损伤模型中，lnc-HUR1转基因小鼠的肝组织表达更高水平的Bcl-2，初步显示了lnc-HUR1在体内抑制细胞凋亡的作用，是否引起caspase活性的改变还需要进一步的验证。由于小鼠之间存在个体差异，lnc-HUR1转基因小鼠肝组织中Bcl-2的表达水平高低不均，在转基因小鼠肝组织中在CCL4处理条件下能否更好抑制BAX的蛋白水平还需要进一步验证。另外，lnc-HUR1能显著上调Bcl-2的表达水平，无论是在细胞水平还是在小鼠水平，Bcl-2的转录也受到NF-κB的影响[25-26]，且NF-κB与p53之间存在相互负调控的关系[27]，本研究探索lnc-HUR1能否通过直接或间接作用影响其他信号通路如NF-κB信号通路抑制细胞的凋亡。
4 结论本研究证明过表达lnc-HUR1的细胞系能够促进Bcl-2表达抑制BAX的表达，通过抑制内源性凋亡途径，抑制caspase3/7的激活，从而抑制了PARP-1的剪切，抑制细胞凋亡的发生；相反，在敲低lnc-HUR1的稳定细胞系中能够抑制Bcl-2的表达促进BAX的表达，促进了caspase级联和caspase3/7激活，从而促进了PARP-1的剪切，促进细胞的凋亡。为了探究lnc-HUR1抑制凋亡的具体机制，根据课题组已发表的研究结果作为基础，本研究在敲除p53的HCT116中转染cCMV-lnc-HUR1，结果显示在敲除p53的HCT116细胞中过表达lnc-HUR1、Bcl-2及BAX其mRNA水平与对照组没有差别，说明lnc-HUR1通过p53调节Bcl-2和BAX的表达；双荧光素酶活性检测实验证明lnc-HUR1能够抑制p53对Bcl-2和BAX的转录调节；染色质免疫共沉淀实验证明lnc-HUR1能够抑制p53在Bcl-2和BAX启动子区的富集，从而调节Bcl-2和BAX的表达。综上所述，lnc-HUR1能够通过抑制p53的活性，促进Bcl-2的表达抑制BAX的表达，从而抑制细胞的凋亡。
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