雷公藤红素是从卫矛科雷公藤属木质藤本植物雷公藤(Triptergium wilfordii Hook. F.) 中提取出来的一种活性良好的成分，属于醌甲基三萜类化合物^[1]，具有多种生物活性。雷公藤红素大多存在于雷公藤的根部，并且会受到环境和地理位置的影响，先前的研究发现表明，雷公藤红素具有抗癌、抗氧化、抗炎、免疫抑制等多种生理作用^[2]。

镉(cadmium, Cd) 是一种有毒性的重金属，具有很高的潜在生态风险。虽然镉在自然界中没有广泛分布，且在自然条件下对人体也不会造成影响，但近年来由于很多人为因素，镉对环境和人类身体健康造成了严重危害^[3]。镉一般通过食物摄取进入人体^[4]，并在人体器官中积累，Cd²⁺可以产生致癌作用，损害人体的心血管、肾脏、肝脏、神经、胃肠、生殖和呼吸系统^[5]。研究表明，镉会穿过血脑屏障，导致神经毒性。在大脑中，镉诱导参与炎症、氧化应激和神经元凋亡的各种信号通路的激活^[6]。环境中的镉可以影响小胶质细胞的正常发育过程，因此也影响了神经元的存活、轴突的生长和突触的形成^[7]，2010年朱俊德等^[8]发现慢性镉中毒致小鼠海马CA3区星型胶质细胞和小胶质细胞增多，而少突胶质细胞减少，这些变化可能是镉的神经毒性作用之一。

小胶质细胞分布在大脑中，是中枢神经系统中主要的常驻免疫细胞和吞噬细胞^[9]，各种神经退行性疾病，包括帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)，都与小胶质细胞介导的神经炎症有关^[10]。神经炎症现在被认为是一把双刃剑，对神经元既有害又有益。越来越多的证据表明，中枢神经系统的小胶质细胞活化是不均匀的，可以分为两种相反的类型：促炎的M1表型和免疫抑制的M2表型。M1激活的小胶质细胞表达促炎细胞因子，驱动细胞浸润，而M2激活的小胶质细胞更具有修复性，促进碎片的吞噬作用，促进与细胞稳定性和修复相关的蛋白的表达^[11]。

越来越多的研究表明，雷公藤红素在各种神经退行性疾病模型中表现出了显著的神经保护性作用。雷公藤红素可以通过抑制各种炎症因子的形成、清除自由基及过氧化物、启动热激反应，上调热休克蛋白(heat shock protein, Hsp) 的表达，减少异常蛋白质的合成，逆转蛋白质的错误折叠等有效防治中枢神经退行性病变^[12]。雷公藤红素还能够通过下调神经元中p-JNK，p-c-Jun和NF-κB的表达、诱导AMPKα磷酸化^[13]和抑制Ca²⁺-CaMKII依赖的Akt/mTOR途径^[14]起到一定的神经保护作用。但是，当前对于雷公藤红素对Cd²⁺诱导的小胶质细胞毒性是否有保护作用尚属未知。而本课题组前期曾经系统研究了不同浓度雷公藤红素对小胶质细胞炎症反应的影响机制^[15]，基于此，本文详细探究了Cd²⁺对小胶质细胞HMC3细胞增殖和细胞凋亡的影响，并且系统探索了雷公藤红素对Cd²⁺诱导的神经毒性的保护作用。

雷公藤红素、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)、Tris buffered saline Tween (TBST) 缓冲液、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH) 细胞毒性检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、脂质氧化(MDA) 检测试剂盒、一抗：Phospho-PI3K P85α/β/P55γ (Y467/ Y464/Y199)、Rabbit Polyclonal Antibody和Phospho-Akt (Ser473) 抗体(兔多抗) 购自上海碧云天生物技术有限公司。β-actin抗体购自Proteintech公司，胎牛血清和胰酶购自Gibco by Life Technologies公司。DMEM培养基购自Hyclon公司。五水氯化镉购自上海麦克林生化科技有限公司。小胶质细胞(HMC3) 购自北京北纳创联生物技术研究院。

超净工作台(SW-CJ-1D，Suzhou purification公司)，离心机(Heraeus Pico 17, Thermo Fisher公司)，酶联免疫检测仪(K3 Plus, BIO-DL公司)，恒温培养箱(311, Thermo Fisher公司)。

用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，于5% CO₂恒温37 ℃的培养箱中进行培养，等待细胞生长稳定后，取对数生长期的细胞进行后续的实验^[16]。

首先取对数生长期的细胞，制成细胞浓度为(5−10)×10⁴个/mL的细胞悬液，分于96孔板，每个孔板加100 μL细胞悬液，约8 000个细胞/孔，孔板边缘用无菌PBS填充，接种好的孔板放于培养箱中培养，直到细胞贴壁^[17]，用不同浓度Cd²⁺处理细胞设为实验组，只含培养基的孔设为空白组，只含正常细胞的孔设为对照组。将96孔板放入5% CO₂、37 ℃的培养箱中孵育24 h，然后吸取上清液，加入100 μL新鲜培养基和10 μL MTT试剂，继续培养4 h，培养结束后，将上清液去掉，每孔加入150 μL DMSO溶液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度(OD) 值。按照式(1) 和(2) 计算细胞存活率(A) 和抑制率(B)。

(1)

(2)

式中，A为细胞活力，B为细胞抑制率，OD_E为实验组吸光度值，OD_B为空白组吸光度值，OD_C为对照组吸光度值。

本实验采用LDH检测试剂盒进行细胞膜完整性的评估^[18]。实验分成4组，分别是只含培养基的空白组，只含正常细胞的对照组和用不同Cd²⁺浓度处理的实验组，只含正常细胞的样品最大酶活性为对照组。细胞铺板后放入培养箱中培养，待细胞贴壁后，用PBS清洗一次，每孔加入200 μL不含血清的培养基，在相应孔中加入不同浓度的雷公藤红素，放入培养箱中培养。在培养第23 h时取出孔板，每孔加入20 μL的LDH释放剂，反复吹吸混匀，放入培养箱中继续培养1 h。将孔板放入离心机中400×g离心5 min，离心结束后将上清液转移到新的孔板中。每孔加入60 μL LDH检测工作液，避光条件下在摇床上孵育30 min，在酶标仪490 nm处检测各孔的OD值。根据得到的OD值，计算出每孔的LDH释放值。

(3)

式中，C为LDH释放量(阳性对照的百分比)，OD_F为样品最大酶活性对照孔的吸光度值。

在96孔板中进行细胞铺板，本实验包括空白组、对照组和用不同Cd²⁺浓度和不同雷公藤红素预处理的实验组。培养一段时间后待细胞贴壁，先在对应孔中加入雷公藤红素，培养1 h后实验组加入相应浓度的Cd²⁺，放入培养箱中培养24 h。先将NO试剂盒从–20 ℃冰箱取出恢复至室温，用细胞培养基稀释NO标准品，标准品的浓度分别为0、1、2、5、10、20、40、60、100 µmol/L，分别取50 μL加入到新的孔板中，将之前培养好的样品孔板放入离心机中400×g离心5 min，离心后每孔取50 μL上清液加入新的孔板中，每孔依次加入50 μL室温Griess Reagent Ⅰ、Griess Reagent Ⅱ。在酶标仪540 nm处检测各孔的OD值。

本实验用6孔板铺板，分成2组，只含正常细胞的对照组和加入不同浓度Cd²⁺的实验组和不同雷公藤红素预处理后加入不同浓度Cd²⁺的实验组。待细胞贴壁后加入相应药品，在对照组加入新鲜培养基，对应实验组加入雷公藤红素预处理1 h，随后用不同浓度的Cd²⁺处理细胞，24 h后进行后续实验。提前制冰，裂解全程在冰上操作，先用PBS清洗细胞，每孔加入200 μL的细胞裂解液，反复吹打后吸取裂解液放入离心管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液。进行蛋白含量测定并配制TBA储存液和检测工作液。将MDA标准品用去离子水稀释成相应浓度并绘出标准曲线。设置只含有裂解液的空白对照组、标品组和待测样品组，各为100 μL，然后每孔分别加入200 μL的MDA检测工作液，混合均匀后放入100 ℃金属浴中15 min，恢复室温后在1 000×g的离心条件下离心10 min，每管取200 μL上清液于新的96孔板中，用酶标仪于532 nm处检测各孔的OD值。

选择对数生长期的细胞，用6孔板铺板，放入培养箱中培养，待细胞贴壁后吸去上清液，在对应孔中加入相应浓度的雷公藤红素预处理1 h，其余孔加入新鲜培养基，然后再加入不同浓度的Cd²⁺处理24 h，提取细胞内的蛋白并用BCA法进行定量。配制合适浓度的凝胶，上样进行电泳，电泳完毕后将蛋白条带转到PVDF膜上，转膜过程在4 ℃的环境下进行，转膜完毕后用5%的脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入用脱脂奶粉稀释过的一抗孵育1 h，用TBST溶液清洗3次，每次清洗15 min，然后加入稀释好的二抗孵育1 h，用TBST溶液清洗3次，每次清洗15 min，完成后加入显影液反应2 min，于化学成像发光仪内检测成像。

本实验数据均采用Origin统计软件分析，实验结果以平均值±标准差(x±s) 表示，样本均数的比较采用完全随机设计的单因素方差分析，P < 0.05说明差异具有统计学意义。

通过MTT实验检测不同浓度Cd²⁺对HMC3细胞活力的影响，Cd²⁺选取0、1、5、10、20、40、50、100 μmol/L这8个浓度进行实验。

图 1为不同浓度Cd²⁺对HMC3细胞活力的影响，根据实验结果，与对照组相比，当Cd²⁺浓度是0、1、5、10 μmol/L时对HMC3细胞增殖没有明显的抑制作用(P > 0.01，n=5)。当Cd²⁺浓度为40−100 μmol/L时对HMC3细胞增殖有明显的抑制作用(P < 0.01，n=5)，且呈现浓度依赖性。当Cd²⁺浓度达到40 μmol/L时，对HMC3细胞的增殖抑制率为(57.17±8.23)% (P < 0.01, n=5)，当药物的浓度增大时，细胞的活力也逐渐降低。

图 1 Cd2+对HMC3细胞活性影响 Fig. 1 Effect of Cd2+ on HMC3 viability. *: P < 0.05 compared with Cd2+ concentration of 0 μmol/L; **: P < 0.01 compared with Cd2+ concentration of 0 μmol/L.

图选项

LDH存在于正常细胞的细胞质中，一旦细胞膜受损，LDH就会释放到细胞外环境中。因此，可以通过检测培养基中LDH的含量来评估细胞膜的完整性^[19]。

在之前实验的基础上进一步探究不同浓度Cd²⁺对HMC3细胞膜的影响，选择Cd²⁺浓度为0、1、5、10、20、40、50、100 μmol/L进行接下来的实验。

图 2是不同浓度Cd²⁺作用下HMC3细胞LDH的释放量。根据实验结果，与对照组相比，当Cd²⁺浓度为0‒20 μmol/L时，细胞LDH的释放量没有明显变化(P > 0.01, n=4)。当Cd²⁺浓度为40‒100 μmol/L时，LDH释放量显著增加。当Cd²⁺浓度为40 μmol/L时增加量为阳性对照组的(22.97±5.12)% (P < 0.01, n=4)，LDH释放量开始随Cd²⁺浓度增大而增加，该实验结果与上述MTT实验基本一致，说明当Cd²⁺浓度达到40 μmol/L以上时，会对HMC3细胞膜造成破坏作用，且呈现浓度依赖性。

图 2 Cd2+对HMC3细胞LDH释放量的影响 Fig. 2 Effect of Cd2+ on LDH release of HMC3. **: P < 0.01 compared with Cd2+ concentration of 0 μmol/L.

图选项

为了进一步探究不同浓度的Cd²⁺对HMC3细胞的影响，进行了细胞形态学研究，本实验在光学显微镜下观察了不同浓度Cd²⁺处理后HMC3细胞形态学变化。图 3是用0 μmol/L (A)、1 μmol/L (B)、5 μmol/L (C)、10 μmol/L (D)、20 μmol/L (E)、40 μmol/L (F)、50 μmol/L (G)、100 μmol/L (H) 8个浓度的Cd²⁺处理HMC3细胞后的细胞形态。根据观察结果，当细胞没有受到Cd²⁺影响时，细胞贴壁情况良好，大部分细胞都紧贴细胞培养瓶的底部，呈现短梭形。当Cd²⁺浓度增加时，细胞的贴壁程度逐渐减弱，细胞变圆，说明当Cd²⁺浓度增加时HMC3细胞会受到影响，细胞可能会被激活^[20]，并且存活率降低，与MTT和LDH实验的结果保持一致。

图 3 Cd2+浓度对HMC3细胞形态的影响 Fig. 3 Effect of Cd2+ concentration on the morphology of HMC3 cells. The Cd2+ concentrations were 0 μmol/L (A), 1 μmol/L (B), 5 μmol/L (C), 10 μmol/L (D), 20 μmol/L (E), 40 μmol/L (F), 50 μmol/L (G), and 100 μmol/L (H), respectively.

图选项

上述实验说明Cd²⁺会抑制小胶质细胞增殖，对细胞膜造成破坏，使细胞形态发生变化，从而影响细胞活力，产生神经毒性。

小胶质细胞经活化后会产生NO，形成自由基，从而造成蛋白质、线粒体结构的损坏^[21]，本实验研究了雷公藤红素对Cd²⁺诱导的NO释放量的影响。

由于NO本身极不稳定，在细胞内很快代谢成亚硝酸盐，因此本实验中通过检测亚硝酸钠的量，从而测定出一氧化氮的相对释放量，其中亚硝酸钠和NO的摩尔浓度相同。图 4为小胶质细胞NO释放量的标准曲线，经计算得到标准曲线的R²为0.998。由该标准曲线和实验得到的数据可以计算出NO的释放量。图 5为雷公藤红素对Cd²⁺诱导的NO释放量的影响，根据研究结果该实验选择了对HMC3细胞没有显著毒性的两个雷公藤红素浓度(10^–6、10^–7 mol/L)^[15]，以及对HMC3细胞有显著毒性的Cd²⁺浓度(20、40 μmol/L)。根据实验结果可以得出，Cd²⁺对HMC3细胞NO释放量有促进作用，随着Cd²⁺浓度的增加NO的释放量也显著增加，且雷公藤红素可以有效地抑制Cd²⁺诱导的HMC3细胞NO的释放。当用20 μmol/L Cd²⁺处理后，HMC3细胞NO释放量为1.52 μmol/L，而当先用10^–7 mol/L的雷公藤红素进行预处理后，NO释放量为0.86 μmol/L (P < 0.01, n=3)；当用10^–6 mol/L的雷公藤红素进行预处理后，NO释放量为0.53 μmol/L (P < 0.01, n=3)。当用40 μmol/L Cd²⁺处理后，NO释放量为2.53 μmol/L，而当先用10^–7 mol/L的雷公藤红素预处理后，NO释放量为1.58 μmol/L (P < 0.01, n=3)；当先用10^–6 mol/L的雷公藤红素预处理后，NO释放量为0.91 μmol/L (P < 0.01, n=3)。根据实验结果可以得出，Cd²⁺可以激活小胶质细胞，从而使小胶质细胞释放NO，产生了大量的毒性因子，而雷公藤红素可以抑制Cd²⁺诱导的HMC3细胞NO释放量的增加。

图 4 NO检测标准曲线 Fig. 4 Standard curve of NO test.

图选项

图 5 雷公藤红素对Cd2+诱导的HMC3细胞NO释放量的影响 Fig. 5 Effect of celastrol on NO release in Cd2+ induced HMC3 cells. **: P < 0.01.

图选项

细胞脂质过氧化水平通常被认为是评估细胞损伤的一个重要指标，该实验通过加入不同浓度Cd²⁺研究对HMC3细胞脂质过氧化氢水平的影响以及加入10^–7 mol/L雷公藤红素是否能够抑制Cd²⁺造成的细胞损伤。

图 6为不同浓度Cd²⁺和雷公藤红素对HMC3细胞MDA释放量的影响，根据实验结果，与对照组相比，当Cd²⁺浓度为10 μmol/L时，释放MDA的量为15.37 μmol/(L·mg)，当Cd²⁺浓度为20 μmol/L时，释放MDA的量为53.85 μmol (L·mg)，MDA释放量随Cd²⁺浓度增加而增大，当加入10^–7 mol/L雷公藤红素后，对应不同Cd²⁺浓度处理组分的MDA释放量明显减少，说明雷公藤红素可以抑制Cd²⁺对HMC3细胞造成的氧化损伤。

图 6 雷公藤红素对Cd2+诱导的HMC3细胞MDA释放量的影响 Fig. 6 Effect of celastrol on MDA release in Cd2+ induced HMC3 cells. Cd2+ concentrations were 0, 10, and 20 μmol/L. Celastrol concentration was 10–7 mol/L.

图选项

PI3K-AKT信号通路是与神经退行性疾病治疗有关的一条重要通路，本实验探究了Cd²⁺对该信号通路的影响以及雷公藤红素是否能够抑制这种影响。

图 7为不同浓度Cd²⁺对细胞p-PI3K和p-AKT蛋白表达量的影响，根据实验结果，当用不同浓度Cd²⁺作用于细胞时，p-PI3K和p-AKT蛋白都可以被激活，p-PI3K蛋白表达量也随Cd²⁺浓度升高而增加。当加入不同浓度雷公藤红素处理后，抑制了相应p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白的激活，且抑制作用随雷公藤红素浓度升高而增大，说明Cd²⁺通过影响PI3K-ATK通路来影响HMC3细胞活力，而雷公藤红素能够抑制PI3K-ATK通路进而保护Cd²⁺诱导的神经损伤。

图 7 雷公藤红素对Cd2+诱导的HMC3细胞内PI3K-AKT通路的影响 Fig. 7 Effect of celastrol on Cd2+ induced PI3K-AKT pathway in HMC3 cell. (A) Expression levels of p-PI3K and p-AKT treated with different concentrations of Cd2+ and celastrol. (B) Histogram of expression levels of p-PI3K and p-AKT after treatment with different concentrations of Cd2+ and celastrol.

图选项

随着工业的发展，重金属离子造成的环境污染和损害人类健康问题日趋严重^[22]，镉暴露会导致很多疾病的发生，尤其是它对神经系统的危害。雷公藤红素作为雷公藤有效提取物，在各种疾病模型中表现出神经保护作用，并且雷公藤红素显著减弱镉导致的神经细胞存活降低、形态改变和核断裂以及神经细胞caspase-3的活化^[23]。同时，雷公藤红素还显著阻止镉诱导JNK的磷酸化，但对Erk1/2和P38通路没有影响^[24]。2016年朱雨等^[25]发现雷公藤红素通过抑制神经细胞Cd²⁺-CaMKII依赖的Akt/mTOR通路干预镉诱导神经细胞凋亡。2017年王晓雪^[26]发现雷公藤红素靶向神经细胞NOX2-ROS介导PP5-JNK通路改善镉诱导的神经细胞凋亡。然而以上研究均针对神经元细胞，而雷公藤红素对Cd²⁺诱导的小胶质细胞毒性是否有保护作用尚不清晰，基于此，本文通过多种现代分析技术，系统探索了Cd²⁺对小胶质细胞的毒性作用以及雷公藤红素对Cd²⁺诱导的小胶质细胞神经毒性的影响作用。

首先考察了Cd²⁺会对小胶质细胞增殖的影响作用，根据MTT实验结果，当Cd²⁺浓度为40–100 μmol/L时，HMC3细胞的增殖能力明显减弱，并且细胞活性随Cd²⁺浓度的升高逐渐下降。接着由LDH实验，探讨了Cd²⁺是否会对细胞膜产生破坏作用，结果显示在同样的浓度范围内，即40–100 μmol/L时，LDH释放量与Cd²⁺浓度呈现正相关。同时，细胞形态学检验也说明当Cd²⁺浓度增加时，细胞贴壁状况逐渐变差，细胞变圆。综合以上结果，可以说明Cd²⁺通过破坏细胞膜和细胞形态的方式，对小胶质细胞产生毒性作用。

然后，通过NO和MDA实验探索了雷公藤红素对Cd²⁺诱导HMC3细胞毒性的保护作用，结果显示，雷公藤红素对Cd²⁺诱导HMC3细胞产生过多的NO和MDA有明显的抑制作用，从而抑制了Cd²⁺诱导的神经损伤。

最后，利用Western blotting实验阐释了雷公藤红素的神经保护机制，发现雷公藤红素通过调节PI3K–AKT通路的方式显著抑制Cd²⁺诱导的HMC3细胞凋亡。

当Cd²⁺浓度达到40 μmol/L时，对小胶质细胞增殖产生影响，破坏细胞膜完整性和细胞形态，从而减少细胞活力，且呈现浓度依赖性。Cd²⁺可以增加HMC3细胞的NO、MDA释放量，还可以提高细胞凋亡相关蛋白p-PI3K和p-AKT蛋白表达量，而雷公藤红素可以相应抑制Cd²⁺诱导小胶质细胞产生的上述变化。综上所述，雷公藤红素可以通过调节小胶质细胞NO、MDA释放量和PI3K-AKT通路蛋白表达量的方式抑制Cd²⁺引起的神经毒性，对解决金属镉带来的环境和健康危害有一定的借鉴作用。