中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 肖永成, 王小斌, 谢德明
- XIAO Yongcheng, WANG Xiaobin, XIE Deming
- 透明质酸微针经皮递送胰岛素智能给药系统用于糖尿病治疗
- Application of hyaluronic acid microneedles in insulin intelligent delivery system for the treatment of diabetes
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3433-3442
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3433-3442
- 10.13345/j.cjb.220129
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文章历史
- Received: February 22, 2022
- Accepted: May 30, 2022
- Published: June 6, 2022
2. 广州质量监督检测研究院, 广东 广州 511447
2. Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou 511447, Guangdong, China
2021年全球约有5.37亿成年糖尿病患者,超过670万人死于糖尿病,且预计2045年糖尿病患者数量将达到7亿[1]。目前治疗糖尿病的手段主要有两种:人工注射胰岛素和口服降糖药。口服降糖药容易让患者产生依赖性,药物的有效性和安全性较低[2],直接注射胰岛素则容易出现低血糖和体重增加等问题,一天多次的注射过程让患者饱受痛苦,依从性不高[3-4]。为了减少频繁注射以及更好的血糖控制,无创给药以及智能释放的方式受到了广泛关注。
近年来,微针贴片这种无痛的给药方式已经在美容领域获得应用。微针贴片由数十到数百根,长度数百微米的细针阵列组成,透皮时几乎没有痛觉,也不会留下明显创口,是一种理想的透皮给药形式。微针分为固体微针[5]、涂层微针[6]、空心微针[7]、水凝胶微针[8]和可溶性微针等[9]。可溶性微针因为制备相对简单、载药量高、材料来源广、生物相容性好等优势被认为在透皮给药方面最具研究潜力,其中的药物被整合到微针的针体内,随着微针的溶解而释放,药物利用率高,不产生医疗废物。然而,如果仅仅是将胰岛素整合到可溶性微针上,虽也能提高糖尿病患者的用药舒适性,却无法避免低血糖风险和频繁给药的麻烦。
本文设计制备了一种基于透明质酸的可溶性微针,通过负载矿化胰岛素(m-INS) 和矿化葡萄糖氧化酶(m-GOx),组成一个智能释放系统,可以实现自主识别血糖浓度信号,并控制胰岛素的释放行为,通过胰岛素的有效释放以维持血糖正常,藉此实现糖尿病的有效治疗,具有广阔的临床应用前景。
1 材料与方法 1.1 材料透明质酸钠(化妆品级,30 kDa,300 kDa),青州广裕生物科技有限公司;聚乙二醇(Mw= 3 350,99%),购自广州健阳生物科技有限公司;考马斯亮蓝G250 (AR),上海麦克林生化科技有限公司;猪胰岛素(BR)、葡萄糖(CP),购自大连美仑生物技术有限公司;葡萄糖氧化酶(BR),购自上海源叶生物科技有限公司;胰岛素定量试剂盒、链脲佐菌素,Solarbio;SD雄性大鼠(4–6周龄),购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1.2 方法 1.2.1 m-INS和m-GOx的制备与表征将1 mg胰岛素(msulin, INS) 加到1 mL PEG-3 350 (1%) 中混合均匀,室温搅拌30 min。加入0.5 mL柠檬酸钠溶液(60 mmol/L) 和0.5 mL CaCl2溶液(125 mmol/L),继续搅拌15 min。最后缓慢滴加1 mL Na2HPO4溶液(125 mmol/L),常温下避光反应24 h。产物6 000 r/min离心10 min,去掉上清,用超纯水洗涤3遍,得到矿化胰岛素(m-INS)。用透射电子显微镜观察产物表观形貌。将产物置于不同pH值的缓冲液中,37 ℃水浴2 h,6 000 r/min离心10 min,用Bradford法检测上清中的INS含量。
将3 mg葡萄糖氧化酶(GOx) 加入到6 mL PBS缓冲液中,室温静置30 min,加入40 μL硫酸铜溶液(120 mmol/L) 搅拌均匀,放入4 ℃冰箱中孵育72 h,将产物转移到离心管中5 000 r/min离心10 min,去掉上清后用PBS缓冲液洗涤离心3遍,冷冻干燥得到矿化葡萄糖氧化酶(m-GOx)。在扫描电子显微镜下观察产物的表观形貌。用葡萄糖氧化酶活性检测试剂盒检测矿化后的葡萄糖氧化酶的酶活力稳定性。
1.2.2 葡萄糖响应体系的体外验证分别用1 000 mg/L和4 000 mg/L的葡萄糖溶液模拟正常(5.6 mmol/L) 和高血糖(22.2 mmol/L) 两种状态,将m-INS和m-GOx投入到不同浓度的葡萄糖溶液中,混合均匀后37 ℃水浴。于不同时间点取样,7 000 r/m离心5 min,吸取上清,用Bradford法检测样品中的胰岛素含量,分析INS在不同葡萄糖浓度环境中的释放情况。
1.2.3 载药微针的制备将300 kDa和30 kDa分子量的透明质酸钠粉末按2:8质量比配成8% (W/V) 的水溶液,超声振荡脱气。负压条件下将溶液倒入自制微针制造装置并使其充分流延,40 ℃烘干,得到HA微针(HA-MN)。在体式显微镜和扫描电子显微镜下观察微针的形貌。按同样方法,将被FITC标记的m-INS和被Cy5标记m-GOx加入到HA溶液中混合均匀,制得负载药物的微针,在荧光显微镜下观察药物在微针中的分布。往小培养皿中加入1 mL PBS,用镊子夹住m-INS微针边缘,将针体部分沾湿,约1 min后将溶胀后的针体刮下,待完全溶于PBS中后用Bradford法检测其INS含量。同样方法可测得m-INS/m-Gox微针中的INS和Gox含量。
1.2.4 1型糖尿病大鼠模型的构建为了在体内验证HA微针负载胰岛素智能给药系统用于稳定血糖的可行性,用链脲佐菌素(streptozocin, STZ) 诱导建立1型糖尿病大鼠模型。4–6周龄的SD雄性大鼠在SPF环境中饲养适应10 d,用2.1%的柠檬酸溶液和2.94%的柠檬酸钠溶液按1:1.32比例混合得到的缓冲液溶解STZ,配制2%浓度的STZ溶液,用0.22 μm滤器过滤除菌后避光4 ℃保存,现配现用。对每只大鼠按55 mg/kg的量经腹腔注射2%的STZ溶液,之后每日用血糖仪检测尾静脉血的血糖浓度,称量体重,连续记录11 d,选取血糖高于16.7 mmol/L的大鼠纳入实验(暨南大学实验动物伦理委员会;批准编号:IACUC- 20210113-08)。
1.2.5 载药微针的降糖效果验证将糖尿病模型大鼠随机分成4组,每组3只,用剃毛器去除背部的毛发,分别将负载不同药物成分的微针(纯透明质酸微针HA/MN,负载胰岛素的微针INS/MN,负载矿化胰岛素的微针m-INS/MN,负载矿化胰岛素和矿化葡萄糖氧化酶的微针m-INS/m-GOx/MN) 贴在大鼠皮肤表面,针尖垂直于皮肤,施加一定的压力使微针刺入皮肤,用PU膜固定。每隔一段时间测量大鼠尾静脉血的血糖浓度,直到血糖重新上升并稳定在高水平。
1.2.6 葡萄糖耐受实验将所有实验动物提前禁食不禁水处理12 h,其中两组6只糖尿病鼠被随机均分并给以INS微针或m-INS/m-GOx微针处理,另外3只健康鼠给以空白微针处理。1 h后给以每只大鼠1.5 g/kg的葡萄糖溶液经腹腔注射,每隔20 min检测血糖浓度。
分析数据应用SPSS 16.0软件,使用Origin 2018软件作图。Student t检验来分析数据的显著性差异。显著性差异表示为*:P < 0.05;**:P < 0.01;***:P < 0.001。
2 结果与分析 2.1 m-INS和m-GOx的制备与表征在透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM) 下,如图 1A所示,m-INS为不规则的聚集状晶簇,直径约1 μm。体外模拟释放实验如图 1B所示,m-INS在pH越低的缓冲液中INS释放量越多,而在中性环境中几乎不释放。说明m-INS确实具有感应环境pH变化的能力,同时释放出胰岛素。m-GOx在扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM) 下的形貌如图 1C所示,产物呈花球状,有较高的比表面积,直径约1–2 μm。酶活力稳定性实验结果如图 1D所示,m-GOx比游离的GOx具有更高的酶活力稳定性。
2.2 m-INS/m-GOx响应释放INS的体外验证将制备的m-INS/m-GOx置于葡萄糖溶液中,37 ℃水浴恒温,于不同时间点取样,检测上清液中的INS浓度,如图 2A所示。5.6 mmol/L的葡萄糖溶液中胰岛素的释放比较缓慢,而22.2 mmol/L的葡萄糖溶液中释放较快,这表明高浓度的葡萄糖溶液中,由于m-GOx催化产生较多的葡萄糖酸而使pH快速下降,使得m-INS中的磷酸钙快速溶解,释放出INS。图 2B中,介质中葡萄糖浓度的升高,INS释放越多,释放速率越快。图 2C中,当该载药微针交替暴露在正常和高浓度葡萄糖两种状态下1 h时,能对葡萄糖浓度的变化快速做出反应,即在正常血糖状态下INS释放减缓,在高血糖状态释放加速,并且至少能维持5个周期。证明由m-INS/m-GOx组成的体系能有效识别介质中葡萄糖浓度,在高糖状态时快速释放出INS,当糖浓度正常后,体系封闭进入“OFF”状态,葡萄糖浓度再次升高至一定水平后体系打开再次进入状态“ON”,且能够较长时间内有效地将血糖控制在正常范围内,实现葡萄糖浓度的动态调控。
2.3 HA微针的制备图 3A所示为制备的HA微针阵列的体视显微镜照片。图 3B所示为HA微针的电子显微镜照片,可见微针针体饱满,形状均一,针体高约730 μm,底宽约356 μm,针尖直径约30 μm。用万能试验机检测HA微针的机械强度,每根针能承受约0.33 N的力,与合成聚合物微针机械强度相当[10-12],足够刺穿皮肤。
用1 mg INS和3 mg GOx分别制备m-INS和m-GOx,将所得产物全部加入到5 mL HA溶液(4%) 中混合均匀,倒入模具中–90 kPa真空处理,40 ℃干燥1 h,然后加入10 mL HA溶液(8%),–90 kPa真空处理后40 ℃干燥过夜。用Bradford法检测后得出,每片载药微针贴片的针体部分含有约0.012 mg m-INS和0.1 mg m-GOx,万能试验机检测出载药微针的机械强度由纯HA微针的0.33 N/针提高到了0.43 N/针,因为磷酸钙、磷酸铜结晶颗粒与HA分子之间的相互作用增强了材料的强度[13]。用FITC标记INS,用Cy5标记GOx,按同样步骤制备载药微针,在倒置荧光显微镜下观察结果如图 3C–3E所示,微针针体饱满,形态规则,在488 nm激发波长下能看到强烈的绿色荧光,在546 nm激发波长下能看到强烈的红色荧光,表明FITC-m-INS和Cy5-m-GOx在微针中均匀分布。
2.4 负载m-INS/m-GOx的HA微针调控血糖4–6周龄雄性SD大鼠按55 mg/kg的量经腹腔注射链脲佐菌素(STZ) 以建立1型糖尿病大鼠模型,注射后大鼠的血糖持续升高,10 d后平均血糖稳定在21.7 mmol/L左右,明显高于3.9–6.1 mmol/L的正常范围,证明成功构建了1型糖尿病SD大鼠模型。
将糖尿病鼠随机分为4组,每组3只,分别给以HA/MN、INS/MN、m-INS/MN和m-INS/m-GOx/MN贴在大鼠皮肤表面。为了防止脱落,微针刺入皮肤后用PU胶固定,如图 4A和4B所示。36 h后观察大鼠皮肤表面无创口,无红肿发炎等情况。如图 4C所示,HA/MN组和m-INS/MN组的大鼠血糖浓度几乎不变,INS/MN组和m-INS/m-GOx/MN组的血糖均在1 h内下降到了6–7 mmol/L,说明HA微针成功地把胰岛素递送到了大鼠体内。INS/MN组在6 h后血糖恢复到了19.3 mmol/L。m-INS/m-GOx/MN组在给药10 h后血糖仍维持在较低的11.3 mmol/L,在36 h内均低于对照组(HA/MN),说明相对于单纯的胰岛素给药来说,由m-INS和m-GOx组成的胰岛素智能给药系统降糖药效更持久,药物利用率更高。
2.5 m-INS/m-GOx/MN给药后糖尿病大鼠的葡萄糖耐受性INS/MN和m-INS/m-GOx/MN分别作用于3只糖尿病大鼠,1 h后血糖接近正常范围后,再给以1.5 g/kg的葡萄糖溶液腹腔注射,健康组3只被直接注射葡萄糖溶液。由图 5A可以看出,注射葡萄糖后大鼠血糖均出现升高,其中健康组大鼠血糖在20 min达到峰值14.0 mmol/L后快速下降,在150 min时恢复到了正常水平,m-INS/m-GOx/MN组血糖在40 min时达到峰值16.3 mmol/L,然后缓慢下降并在150 min后维持在较低水平的11.1 mmol/L左右,而INS/MN组血糖升高后则一直维持在较高的水平。图 5B葡萄糖耐受实验0–150 min的血糖浓度曲线下面积积分结果表明,相对于INS/MN组,健康组和m-INS/m-GOx/MN组的葡萄糖耐受性明显更强。
3 讨论为了解决直接注射胰岛素所带来的问题,近年来,学者们提出了诸多方案,如将胰岛素封装在一个缓释体系中,通过微针递送药物,再根据血糖的变化来释放胰岛素的策略受到了人们的关注。但这些方案中的核心药物成分往往存在着成分过于复杂、合成过程繁琐、制备效率低、成本高等问题,难以实现产业化。本研究以一种简单的方法制备了一种具有酸响应能力的胰岛素-磷酸钙复合物,该复合物制备流程简单,药物利用率高,安全且有效,具备放大生产的商业化潜力。
其中,磷酸钙是一种pH敏感的生物材料,在酸性条件下能自发溶解[14],也常常作为骨水泥的成分用于成骨修复[15],具有良好的生物相容性。选择磷酸钙作为无机盐成分,利用胰岛素分子中含有的酸性氨基酸残基(8个谷氨酸Glu,2个天冬氨酸Asp),在Ca2+饱和的环境中酸性氨基酸残基中的羧基会与Ca2+螯合[16],当体系中引入磷酸根后,会在胰岛素分子表面形成晶核,之后胰岛素被磷酸钙包裹进一步形成微晶[17]。过饱和的环境使得磷酸钙晶体不断各向异性生长,小晶体之间不断集聚并沉淀析出矿化胰岛素。矿化胰岛素呈不定型的聚集状团簇,形成介晶,尺寸在稳定在1–1 000 nm之间[18-19]。由此构建的m-INS具有良好的pH响应性能,在pH为7.4的生理环境中能保持稳定,同时在酸性环境中随着磷酸钙的溶解可有效地释放出INS,m-INS的这种酸响应特性在胰岛素智能释放系统中有很大的应用潜力。
类似地,m-GOx由GOx和Cu3(PO4)2·3H2O组成“酶-无机杂化”的结构[20],这种无机盐与酶共嵌入的策略既提高了酶的催化效率,又保持了酶的活性,常常用于酶的固定化,在催化、分析科学等领域得到了广泛应用[21]。m-GOx可将葡萄糖氧化成葡萄糖酸,从而将葡萄糖浓度信号转化成pH信号,进而调节m-INS释放,在模拟葡萄糖浓度环境中,该系统表现出来很强的葡萄糖浓度识别能力和良好的响应释放能力。
利用HA微针作为载体,可有效负载m-INS和m-GOx,通过皮肤穿刺后,HA溶解于组织液中,逐步暴露出负载的m-INS和m-GOx。m-GOx将从毛细血管中扩散出来的葡萄糖催化氧化生成葡萄糖酸,使局部组织pH下降,形成酸性环境,m-INS中的胰岛素被释放出来,胰岛素促进了机体对葡萄糖的摄取利用,从而达到降低血糖浓度的效果。当血糖浓度恢复到正常范围后,较低的葡萄糖浓度不足以形成酸性环境,尚未反应的m-INS被保留下来,直到下一次刺激信号的出现,由此实现动态检测血糖的作用和多次按需给药的目标,能较长时间动态监控和调节血糖浓度。相对于直接负载胰岛素的HA微针来说,负载m-INS和m-GOx的微针体系具有更长的药效、更强的葡萄糖耐受性和更小的低血糖风险。
4 结论可溶性透明质酸微针负载药物构建的具有血糖响应性的胰岛素智能释放系统应用于临床糖尿病治疗具有明显的优势。研究结果验证了由m-INS和m-GOx所构建的胰岛素给药系统具有良好的血糖浓度识别能力和响应释放能力。HA微针能有效将胰岛素给药系统递送到大鼠皮下,安全、有效地降低糖尿病大鼠的血糖浓度,提高其葡萄糖耐受能力,不至于引发低血糖风险,具有替代注射胰岛素的方式应用于糖尿病治疗的潜力。
[1] |
Sun H, Saeedi P, Karuranga S, et al. IDF Diabetes Atlas: global, regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045. Diabetes Res Clin Pract, 2022, 183: 109119. DOI:10.1016/j.diabres.2021.109119
|
[2] |
Valerón PF, de Pablos-Velasco PL. Limitations of insulin-dependent drugs in the treatment of type 2 diabetes mellitus. Med Clin (Barc), 2013, 141(Suppl 2): 20-25.
|
[3] |
Perreault L, Vincent L, Neumiller JJ, et al. Initiation and titration of basal insulin in primary care: barriers and practical solutions. J Am Board Fam Med, 2019, 32(3): 431-447. DOI:10.3122/jabfm.2019.03.180162
|
[4] |
Shah S, Sharma SK, Singh P, et al. Consensus evidence-based guidelines for insulin initiation, optimization and continuation in type 2 diabetes mellitus. J Assoc Physicians India, 2014, 62(7 Suppl): 49-54.
|
[5] |
Hoang MT, Ita KB, Bair DA. Solid microneedles for transdermal delivery of amantadine hydrochloride and pramipexole dihydrochloride. Pharmaceutics, 2015, 7(4): 379-396. DOI:10.3390/pharmaceutics7040379
|
[6] |
Chong RHE, Gonzalez-Gonzalez E, Lara MF, et al. Gene silencing following siRNA delivery to skin via coated steel microneedles: in vitro and in vivo proof-of-concept. J Control Release, 2013, 166(3): 211-219. DOI:10.1016/j.jconrel.2012.12.030
|
[7] |
Jun H, Han MR, Kang NG, et al. Use of hollow microneedles for targeted delivery of phenylephrine to treat fecal incontinence. J Control Release, 2015, 207: 1-6. DOI:10.1016/j.jconrel.2015.03.031
|
[8] |
Caffarel-Salvador E, Tuan-Mahmood TM, McElnay JC, et al. Potential of hydrogel-forming and dissolving microneedles for use in paediatric populations. Int J Pharm, 2015, 489(1/2): 158-169.
|
[9] |
Cole G, McCaffrey J, Ali AA, et al. Dissolving microneedles for DNA vaccination: improving functionality via polymer characterization and RALA complexation. Hum Vaccin Immunother, 2017, 13(1): 50-62. DOI:10.1080/21645515.2016.1248008
|
[10] |
Yu WJ, Jiang GH, Liu DP, et al. Fabrication of biodegradable composite microneedles based on calcium sulfate and gelatin for transdermal delivery of insulin. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2017, 71: 725-734. DOI:10.1016/j.msec.2016.10.063
|
[11] |
Zhu ZZ, Luo HF, Lu WD, et al. Rapidly dissolvable microneedle patches for transdermal delivery of exenatide. Pharm Res, 2014, 31(12): 3348-3360. DOI:10.1007/s11095-014-1424-1
|
[12] |
Chen MC, Ling MH, Lai KY, et al. Chitosan microneedle patches for sustained transdermal delivery of macromolecules. Biomacromolecules, 2012, 13(12): 4022-4031. DOI:10.1021/bm301293d
|
[13] |
Nonoyama T, Wada S, Kiyama R, et al. Double-network hydrogels strongly bondable to bones by spontaneous osteogenesis penetration. Adv Mater, 2016, 28(31): 6740-6745. DOI:10.1002/adma.201601030
|
[14] |
Alam MM, Han HS, Sung S, et al. Endogenous inspired biomineral-installed hyaluronan nanoparticles as pH-responsive carrier of methotrexate for rheumatoid arthritis. J Control Release, 2017, 252: 62-72. DOI:10.1016/j.jconrel.2017.03.012
|
[15] |
李晓玉, 李光大, 赵三团, 等. 载丹皮酚透钙磷石骨水泥的制备与表征. 中国组织工程研究, 2018, 22(10): 1499-1505. Li XY, Li GD, Zhao ST, et al. Preparation and characterization of paeonol loaded brushite calcium phosphate cement. Chin J Tissue Eng Res, 2018, 22(10): 1499-1505 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0815 |
[16] |
Matsumoto N, Yoshida K, Hashimoto K, et al. Synthesis and characterization of hydroxyapatite using polymerized complex method by chelation of calcium ions with organic phosphonic acid. J Ceram Soc Japan, 2009, 117(1363): 249-254. DOI:10.2109/jcersj2.117.249
|
[17] |
Tsubery H, Mironchik M, Fridkin M, et al. Prolonging the action of protein and peptide drugs by a novel approach of reversible polyethylene glycol modification. J Biol Chem, 2004, 279(37): 38118-38124. DOI:10.1074/jbc.M405155200
|
[18] |
Xu AW, Ma YR, Cölfen H. Biomimetic mineralization. J Mater Chem, 2007, 17(5): 415-449. DOI:10.1039/B611918M
|
[19] |
Cölfen H, Mann S. Higher-order organization by mesoscale self-assembly and transformation of hybrid nanostructures. Angew Chem Int Ed, 2003, 42(21): 2350-2365. DOI:10.1002/anie.200200562
|
[20] |
Ge J, Lei JD, Zare RN. Protein–inorganic hybrid nanoflowers. Nat Nanotechnol, 2012, 7(7): 428-432. DOI:10.1038/nnano.2012.80
|
[21] |
Sun JY, Ge JC, Liu WM, et al. Multi-enzyme co-embedded organic-inorganic hybrid nanoflowers: synthesis and application as a colorimetric sensor. Nanoscale, 2014, 6(1): 255-262. DOI:10.1039/C3NR04425D
|