2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 黄甜甜, 齐剑英, 杨刚刚, 叶贤龙
- HUANG Tiantian, QI Jianying, YANG Ganggang, YE Xianlong
- 重组rHSA-hFGF21融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析
- Expression, purification and bioactivity analysis of a recombinant fusion protein rHSA-hFGF21 in Pichia pastoris
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3419-3432
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3419-3432
- 10.13345/j.cjb.220161
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文章历史
- Received: March 3, 2022
- Accepted: April 27, 2022
- Published: May 5, 2022
引用本文
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2. 赣江中药创新中心, 江西 南昌 330000
2. Ganjiang Traditional Chinese Medicine Innovation Center, Nanchang 330000, Jiangxi, China
糖尿病作为一种非传染性的、慢性代谢类疾病，由多种病因综合所致。其最大的特点是慢性高血糖，并且伴随由于胰岛素分泌和/或作用缺陷而导致的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱[1]。传统治疗糖尿病的药物大多依赖于胰岛素或胰岛素代谢途径中的受体蛋白[2-3]，往往忽视了脂代谢紊乱在疾病发展中的作用，当糖尿病患者发展到晚期出现较为严重的胰岛素抵抗时，即使加大用药量也难以发挥药物的治疗作用，反而会进一步恶化病情。因而迫切需要一种安全有效，既能调节血脂，又能改善胰岛素抵抗的综合性治疗药物。
人成纤维细胞生长因子21 (human fibroblast growth factor 21, hFGF21) 是一种激素样蛋白，分子量为19.5 kDa，属于FGF家族，不仅参与调节体内葡萄糖的稳态，可在未观察到低血糖风险[4]的情况下促进3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的能力[5]，显著降低饮食诱导的肥胖(diet-induced obese, DIO) 小鼠、ob/ob和db/db小鼠的血糖水平；还可通过减轻外周胰岛素抵抗发挥降糖作用，或者作为胰岛素敏化剂以克服饮食诱导的胰岛素抗性[6-7]；更有研究表明FGF21可通过中枢神经系统(central nervous system, CNS) 调节交感神经系统使其长效发挥调节机体血糖稳定的作用[7-9]。但是，FGF21在体内代谢过程中易被肾小球过滤或被蛋白酶降解，具有半衰期短和不稳定等缺点，临床使用必须较大剂量或者高频给药才能达到预期效果。
人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）是血浆中含量最多的可溶性蛋白，且半衰期长、无免疫原性以及组织分布广，是天然的药物载体[10-11]。研究表明融合人血清白蛋白可以显著地改善蛋白质药物的半衰期，一是由于白蛋白相对分子质量为66.5 kDa，是肾小球滤过蛋白的上限，有助于延缓肾脏的滤过作用[12]；二是白蛋白可以以pH依赖的方式结合新生的Fc受体(FcRn)，避免了溶酶体酶的降解，并进入再循环机制[13-14]。有研究表明HSA融合后蛋白的半衰期延长了约20倍，并且可以在血浆胰岛素水平无明显变化的情况下持久地分布到靶组织内[15]。因此本研究构建并表达融合蛋白rHSA-hFGF21基因，筛选获得高表达的酵母工程菌并对表达条件进行优化，为重组蛋白rHSA-hFGF21的大规模生产奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料大肠杆菌Escherichia coli DH5α，毕赤酵母(Pichia pastoris) 菌株X33、SMD1168和GS115，表达载体pPIC9K和pPICZαA，HepG 2细胞均为本实验室保存。hFGF21蛋白为实验室纯化；db/db小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司；SD大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
胰蛋白胨、酵母提取物购于Oxoid；酵母表达重组人血清白蛋白(HSA) 购于北京百奥莱博科技有限公司；胶回收试剂盒购于Omega广州飞扬生物工程有限公司；无内毒素质粒大提试剂盒购于天根生化科技(北京) 有限公司，DP120、BCA试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；重组Anti-FGF21抗体(ab171941)、山羊抗兔IgG H & L (ab205718) 购于Abcam；博来霉素(Zeocin) 购于Invitrogen；遗传霉素(G418)、低分子量预染蛋白marker、ECL Plus超敏发光液、考马斯亮蓝快速染色液购于北京索莱宝科技有限公司；40Q柱填料、AKTATM flux 6切向膜过滤系统、AKTATM AVANT 150、750 kDa及10 kDa中空纤维柱购于GE Healthcare；Blue Bestarose FF色谱柱填料购于上海博格隆生物技术有限公司；葡萄糖氧化酶法测定试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司；血糖仪及检测试纸购于强生医疗器材有限公司；成纤维细胞生长因子21 (FGF21) 检测试剂盒购于武汉云克隆科技股份有限公司；其余试剂为分析纯。
1.2 方法 1.2.1 重组rHSA-hFGF21基因的合成和表达载体的构建从GenBank上获取HSA (gene ID: 213) 和hFGF21 (gene ID: 26291) 的基因序列，通过柔性连接肽(GGGGS) 3将hFGF21的N端连接至HSA的C端，经由毕赤酵母偏好性密码子优化以及GC含量调节后，通过在重组基因末端引入酶切位点将其转入pPIC9K (BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ)、pPICZαA (BstB Ⅰ和EcoR Ⅰ) 表达载体。将该重组基因命名为rHSA-hFGF21，重组质粒命名为pPIC9K-rHSA-hFGF21、pPICZαA-rHSA-hFGF21，交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.2.2 酵母的转化及重组子的筛选用无内毒素质粒大提试剂盒从含有pPIC9K-rHSA-hFGF21、pPICZαA-rHSA-hFGF21质粒的E. coli DH5α中提取质粒。用Sal I酶切获取线性化质粒，再通过凝胶回收以及离心浓缩提高线性化质粒浓度。按电压1.5 kV、电容25 µV、电阻200 Ω、电击时间4−10 ms的条件将线性化的重组质粒电转入毕赤酵母感受态，如表 1所示。将X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21涂布于YPD平板；SMD1168/GS115-pPIC9K-rHSA-hFGF21涂布于Sc-his平板；X33/SMD1168/GS115-pPICZαA-rHSA-hFGF21涂布于含50 μg/mL Zeocin的YPD平板。平板培养条件均为30 ℃，约培养2−3 d，直至获得相应的重组转化子。
| Host strains | Recombinant plasmids | Recombinant strains |
| X33 | pPIC9K-rHSA-hFGF21 | X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21 |
| pPICZαA-rHSA-hFGF21 | X33-pPICZαA-rHSA-hFGF21 | |
| SMD1168 | pPIC9K-rHSA-hFGF21 | SMD1168-pPIC9K-rHSA-hFGF21 |
| pPICZαA-rHSA-hFGF21 | SMD1168-pPICZαA-rHSA-hFGF21 | |
| GS115 | pPIC9K-rHSA-hFGF21 | GS115-pPIC9K-rHSA-hFGF21 |
| pPICZαA-rHSA-hFGF21 | GS115pPICZαA-rHSA-hFGF21 |
将长势良好的SMD1168/GS115-pPIC9K-rHSA-hFGF21转化子分别划线于含1、2和4 mg/mL G418的Sc-his平板进行加压筛选，X33/SMD1168/GS115-pPICZαA-rHSA-hFGF21转化子分别划线于含0.5、1.0和2.0 mg/mL Zeocin的YPD平板进行加压筛选，培养温度为30 ℃。从4 mg/mL G418和2 mg/mL Zeocin的加压筛选平板上挑选重组转化子(X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21直接从转化平板上挑取)，用酶法提取酵母基因组DNA为模板，作PCR鉴定(引物序列如表 2所示)。
| Name | Primer sequences (5′→3′) | Size (bp) |
| rHSA-hFGF21-F | GGTGGGAATACTGCTGATAGCC | 22 |
| rHSA-hFGF21-R | GCTGCGAGATAGGCTGATCAGG | 22 |
将1.2.2鉴定有目的基因的重组转化子和其相应空载质粒，接种至YPD培养基中过夜活化。取100 μL经YPD活化后的菌液并接种于含10 mL BMGY培养基的50 mL锥形瓶中，30 ℃、220 r/min振荡培养至OD600为2–6；4 ℃、3 000 r/min离心5 min，收集菌体并重悬于含50 mL BMMY培养基(甲醇浓度为0.5%，控制菌液转入后OD600为1左右) 的250 mL锥形瓶中，30 ℃、220 r/min振荡培养；每隔24 h加1次甲醇致其终浓度为0.5 %，在诱导后72 h取样鉴定。12% SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。Image-j 1.50处理凝胶图片，以蛋白marker为1对上清表达量进行归一化处理，并结合BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算重组蛋白表达量，筛选出目的蛋白表达量最高的工程菌株。
1.2.4 工程菌表达条件的优化取1.2.3中筛选出的高表达rHSA-hFGF21工程菌株进行表达条件的优化，诱导表达方法同1.2.3。设置诱导起始菌液OD600分别为0.5、1.0和1.5；诱导的甲醇终浓度分别为0.5%、1.0%和2.0% (每个实验条件下设置3个平行)；在诱导后的48、72和96 h取样进行SDS-PAGE分析并计算目的蛋白的表达量，方法同1.2.3。
1.2.5 重组蛋白的分离纯化按1.2.4优化后的诱导条件对工程菌株进行诱导表达，4 ℃、4 300 r/min离心20 min收集上清。用750 kDa中空纤维柱将离心后的上清进一步进行澄清；再用10 kDa的中空纤维柱对上述澄清液体进行浓缩和缓冲液置换洗滤。
用缓冲液A (50 mmol/L NaAc、pH 8.0) 平衡Blue Bestarose FF亲和层析柱，并将上述浓缩液进行上样，通过缓冲液B (50 mmol/L NaAc、400 mmol/L KSCN、pH 8.0) 来洗脱融合蛋白，收集洗脱馏分即为rHSA-hFGF21重组蛋白；将收集到的馏分脱盐至缓冲液C (10 mmol/L Na3PO4、pH 7.2) 中；使用被缓冲液C平衡好的40 Q离子交换柱，进一步对rHSA-hFGF21蛋白精纯，用缓冲液D (10 mmol/L Na3PO4、1 mol/L NaCl、pH 7.2) 采用线性梯度洗脱的方式纯化，收集5%−30%梯度下的洗脱峰馏分。12% SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC分析蛋白纯度。
1.2.6 Western blotting验证纯化后的rHSA-hFGF21重组蛋白、hFGF21蛋白(实验室纯化) 及重组人血清白蛋白HSA进行SDS-PAGE电泳。按200 mA、1.5 h的条件进行PVDF的转膜操作；将PVDF膜置于5%脱脂牛奶室温振荡封闭1.5 h后，用重组Anti-FGF21抗体(1:10 000稀释) 4 ℃振荡孵育过夜；TBST洗膜3次，每次5 min；用山羊抗兔IgG H & L (1:10 000稀释) 抗体室温振荡孵育4 h；TBST洗涤后加入适量ECL Plus超敏发光液，ChemiDoc成像系统拍摄并保存实验结果。
1.2.7 重组蛋白的体内外稳定性分析取1.2.5中纯化后rHSA-hFGF21重组蛋白、HSA以及hFGF21蛋白，并将其调整为0.5 mg/mL，加入胰蛋白酶使底物与酶的质量比为50:1、75:1、100:1；放置于37 ℃恒温水浴锅中，处理后12 h和24 h取样分析重组蛋白的稳定性；再取上述蛋白各100 µL，放置于60 ℃恒温水浴锅中，在处理后12、24 h取样，鉴定重组蛋白的温度稳定性。
将8只8周龄雄性SD大鼠预饲养一周后随机分为两组，通过背部皮下注射的方式分别对两组注射2 mg/kg的rHSA-hFGF21或hFGF21蛋白；在注射前及注射后2、5、8、10、14、20、24、32、48、72和96 h时颈静脉取血300 μL/只/次，每次取血后均给予每只大鼠300 μL生理盐水；取血后室温静置1 h，3 000 r/min离心10 min取上清液并保存至–80 ℃冰箱；使用FGF21检测试剂盒检测血液中FGF21含量，每个样本3个复孔，检测重组蛋白的体内稳定性。
1.2.8 重组蛋白细胞活性分析生长状态良好的HepG2细胞用浓度为0.25%胰蛋白酶消化，离心后收集细胞，将细胞密度调整为1×105 cell/mL后接种至96孔板，每孔200 μL，置于37 ℃ CO2培养箱中继续培养至细胞汇合度为70%–80%。弃去上层培养液，PBS洗1遍，加入新鲜无血清的DMEM高糖培养基培养细胞12 h。用浓度为10、100及1 000 nmol/L的rHSA-hFGF21和hFGF21蛋白刺激细胞24 h，每个浓度做3个复孔，同时设置空白对照孔(不加蛋白)。使用葡萄糖氧化酶法测定试剂盒，检测培养基中葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗率。
培养基中残留的葡萄糖含量(nmol/L)= 0.071 9×OD样品+0.037 1；细胞葡萄糖消耗率(%)=[(C空白葡萄糖–C给药葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100%。
1.2.9 重组蛋白对db/db小鼠长效降糖效果将24只8−10周龄雄性db/db小鼠预饲养1周后，根据血糖水平和体重随机分为3组，每组8只。通过皮下注射的方式，分别向两个治疗组小鼠注射剂量为50 nmol/kg的hFGF21或rHSA-hFGF21蛋白，向Vehicle (对照组) 注射相同体积的0.9% NaCl溶液。每2 d注射1次，连续治疗14 d。在治疗后每2 d及停药后第4天早上8点通过尾静脉取血监测小鼠血糖水平。
1.2.10 统计分析所有数据均使用SPSS 26进行统计学分析，组间数据采用t检验。统计学显著性定义为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 重组rHSA-hFGF21蛋白的诱导表达从筛选平板上挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达，其中X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21系列转化子目的蛋白的表达量最高(58.4±7.7 mg/L)，X33-pPICZαA-rHSA-hFGF21 (49.4±4.8 mg/L) 和GS115-pPIC9K-rHSA-hFGF21 (46.0±6.4 mg/L) 系列次之，SMD1168-pPIC9K-rHSA-hFGF21系列相对较少(25.5±9.3 mg/L)，SMD1168/GS115-pPICZαA-rHSA-hFGF21系列表达量几乎无法计算。因而选定X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21作为工程菌株。
2.2 工程菌表达条件的优化为了进一步提高工程菌株目的蛋白的表达量，本实验探究了诱导时间、诱导起始菌浓度和诱导甲醇浓度对rHSA-hFGF21重组蛋白表达量的影响，结果如图 1所示，随着诱导时间的延长，rHSA-hFGF21蛋白的表达量逐步提升，但96 h时蛋白降解严重，因而诱导72 h时收集上清最为合适。甲醇浓度为0.5%时，rHSA-hFGF21的表达水平最低，当甲醇浓度为1%和2%时，rHSA-hFGF21的表达水平相近，考虑到高浓度甲醇对毕赤酵母细胞的毒性，确定甲醇的最佳浓度为1%。从表达结果可知诱导起始OD600对rHSA-hFGF21的影响相对较小，但在诱导起始OD600为1，蛋白表达量较为稳定。综上所述在诱导起始OD600为1、诱导甲醇终浓度为1%及诱导72 h的条件下(图 2)，rHSA-hFGF21的表达量最高，可达到(97.82±1.03) mg/L，因而选定该条件作为X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21工程菌株的诱导条件。
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| 图 1 工程菌表达条件的优化 Fig. 1 Optimization of expression conditions for engineered bacteria. (A–C): SDS-PAGE analysis after 48 h, 72 h and 96 h of induction. M: marker; lane 1, 4, 7: methanol concentration was 0.5%; lane 2, 5, 8: methanol concentration was 1.0%; lane 3, 6, 9: methanol concentration was 2.0%; OD600 0.5, OD600 1.0, OD600 1.5: initial bacterial concentration at induction. |
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| 图 2 工程菌条件优化对目的蛋白表达量的影响 Fig. 2 Effect of conditions optimization on the expression of target protein. The values (x±s) shown are the average of 3 independent measurements. |
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按照2.2中的优化后的条件对X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21进行诱导表达，离心收集上清液，用中空纤维膜处理系统对上清进行澄清、浓缩及缓冲液的置换，除去菌体、部分杂蛋白、脂质和色素等分子。经SDS-PAGE检测可知，应用中空纤维柱超滤浓缩和洗滤的方法，可以有效地降低酵母诱导表达后上清液的体积，初步对rHSA-hFGF21蛋白进行富集和粗纯(图 3)。
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| 图 3 中空纤维膜过滤系统纯化rHSA-hFGF21的SDS-PAGE鉴定 Fig. 3 SDS-PAGE of rHSA-hFGF21 purified by hollow fiber membrane filtration system. M: marker; 1: engineered strain induced 72 h supernatant; 2–3: 750 kDa hollow fiber column retentate and filtrate; 4–6: 10 kDa hollow fiber column retentate, filtrate and system residue. |
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浓缩后的上清液经Blue Bestarose FF亲和层析(图 4A) 初步纯化，收集rHSA-hFGF21蛋白洗脱峰并脱盐后，再通过40 Q离子交换层析(图 4B) 进一步纯化，收集的洗脱峰即为rHSA-hFGF21重组蛋白。还原和非还原性SDS-PAGE的结果表明(图 5A)，纯化出的rHSA-hFGF21蛋白为单体结构，还原和非还原条件下rHSA-hFGF21条带的位置不同，是由于非变性蛋白存在二级及三级结构，因而在分子量大小、染色水平上与变性蛋白存在一定差异。经SEC-HPLC分析可知，rHSA-hFGF21的纯度约为98.18%，最终收率为37.2%，此时蛋白浓度为0.94 mg/mL (图 5C)。Western blotting实验中，以HSA为阴性对照，证明纯化后的蛋白为rHSA-hFGF21重组蛋白(图 5B)。
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| 图 4 rHSA-hFGF21的纯化分析图 Fig. 4 Purification analysis chart of rHSA-hFGF21. (A) Blue Bestarose affinity chromatography results of rHSA-hFGF21. (B) 40 Q ion exchange chromatography results of rHSA-hFGF21. |
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| 图 5 rHSA-hFGF21的纯度和Western blotting分析 Fig. 5 Purity and Western blotting analysis of rHSA-hFGF21. (A) SDS-PAGE analysis of reduced and non-reduced rHSA-mFGF21. M: molecular weight marker; A1: non-reduced rHSA-hFGF21; A2: reduced rHSA-hFGF21. (B) Western blotting analysis of rHSA-hFGF21. B1: hFGF21; B2: rHSA-hFGF21; B3: rHSA. (C) SEC-HPLC analysis of purified rHSA-hFGF21. The purity of rHSA-hFGF21 was evaluated by SEC-HPLC analysis using a BioCore SEC-150. As seen from the chromatogram, the y-axis indicates the absorbance, while the x-axis represents elution time (min). The purity of purified rHSA-hFGF21 was 98.18%. |
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rHSA-hFGF21、HSA以及hFGF21与胰蛋白酶以不同质量比(50:1, 75:1和100:1) 混合孵育12 h和24 h，hFGF21蛋白孵育12 h就已降解完全，而重组蛋白rHSA-hFGF21在与胰蛋白酶质量比为50:1的条件下孵育24 h后仍有(39.3±0.01)%的剩余(图 6A、B)，说明与hFGF21相比，rHSA-hFGF21有更好的抗胰蛋白酶降解能力。在60 ℃恒温孵育实验中，hFGF21在孵育12 h后即出现明显弥散，而rHSA-hFGF21在孵育24 h时无明显变化(图 6C)，说明rHSA-hFGF21具有更好的温度稳定性。以上结果均表明融合HSA后，hFGF21在体外的稳定性有明显提升。
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| 图 6 rHSA-hFGF21的稳定性分析 Fig. 6 Stability analysis of rHSA-hFGF21. (A–B): protein mixed with trypsin according to different mass ratio and incubated at 37 ℃ for 12 h and 24 h. M: molecular weight marker; lane 1: rHSA-hFGF21 as sample control; lane 2, 3, 4: the mass ratio of rHSA-hFGF21 to trypsin was 50:1, 75:1 and 100:1; lane 5: rHSA as sample control; lane 6, 7, 8: the mass ratio of rHSA to trypsin was 50:1, 75:1 and 100:1; lane 9, hFGF21 as sample control; lane 10, 11, 12: the mass ratio of hFGF21 to trypsin was 50:1, 75:1 and 100:1. (C) Protein incubated at 60 ℃ for 12 h and 24 h. M: molecular weight marker; lane 1: rHSA-hFGF21 as sample control; lane 2, 3: rHSA-hFGF21 incubated at 60 ℃ for 12 h and 24 h; lane 4, rHSA as sample control; lane 5, 6: rHSA incubated at 60 ℃ for 12 h and 24 h; lane 7, hFGF21 as sample control; lane 8, 9: hFGF21 incubated at 60 ℃ for 12 h and 24 h. |
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给SD大鼠皮下注射hFGF21和rHSA-hFGF21蛋白，在不同的时间点取样，检测血浆中FGF21含量，血药浓度和时间曲线如图 7所示。hFGF21在血浆中的半衰期约为0.85 h，而rHSA-hFGF21蛋白的血浆清除半衰期约为23.5 h，其半衰期延长了约27.6倍。表明hFGF21蛋白经HSA融合后体内稳定性显著增加。
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| 图 7 重组蛋白血药浓度-时间曲线图 Fig. 7 Plasma concentration-time curve of recombinant proteins. SD rat were injected with 2 mg/kg rHSA-hFGF21 or hFGF21, before injection and at 2, 5, 8, 10, 14, 20, 24, 32, 48, 72, 96 h after injection 300 μL/rat·time of blood from the jugular vein, and each rat was given 300 μL of 0.9% saline after each blood collection. |
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为了检测重组蛋白rHSA-hFGF21的细胞活性，本实验采用10、100及1 000 nmol/L的重组蛋白rHSA-hFGF21和hFGF21蛋白刺激饥饿处理后的HepG2细胞24 h，通过GOD-POD法检测其葡萄糖吸收率。结果如图 8所示，rHSA-hFGF21和hFGF21均能促进葡萄糖吸收，且呈现出剂量依赖性；在100和1 000 nmol/L的蛋白刺激下，rHSA-hFGF21蛋白的HepG2细胞活性显著强于hFGF21。
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| 图 8 rHSA-hFGF21的细胞活性分析 Fig. 8 Cell activity analysis of rHSA-hFGF21. The cells were treated with 10, 100 or 1 000 nmol/L rHSA-hFGF21 or hFGF21. After 24 h treatment, glucose uptake by the model cells were examined using GOD-POD method. The values (x±s) shown are the average of 3 independent measurements. *: P < 0.05 vs. hFGF21. |
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用hFGF21和rHSA-hFGF21蛋白分别治疗db/db小鼠，每2 d给药一次，连续注射14 d，并在停药后第4天检测血糖水平。治疗效果如图 9所示，在治疗期间，hFGF21和rHSA-hFGF21蛋白均能显著降低db/db小鼠血糖水平，但是hFGF21在治疗后第4天开始db/db小鼠血糖有逐渐回升的趋势，而且停药4 d后hFGF21治疗组小鼠的血糖水平基本回升到了对照组的水平。rHSA-hFGF21治疗组的db/db小鼠血糖水平一直稳定维持在6.87–8.79 mmol/L之间，停药4 d后血糖仍然能够维持在较低的水平(9.35 mmol/L)。以上结果说明与hFGF21相比，rHSA-hFGF21具有更好的长效降糖效果。
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| 图 9 db/db小鼠长效降糖作用分析 Fig. 9 Analysis of long-term hypoglycemic effect in db/db mice. db/db mice were subcutaneously injected with 50 nmol/kg rHSA-hFGF21 or hFGF21 every two days for 2 weeks. Vehicle: 0.9% saline-treated diabetic group. Plasma glucose levels were examined every two days from day 0 to 14 after the first administration and day 4 during the withdrawal periods. The values (x±s) shown are the average of 8 independent measurements. *: P < 0.05; **: P < 0.01 vs. vehicle; #: P < 0.05; ##: P < 0.01 vs. hFGF21. |
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FGF21作为21世纪初新发现的FGF家族的成员[16]，可在不依赖肝素的情况下，通过β-Klotho依赖性的方式传递信号，调节糖、脂及能量代谢，改善胰岛素抵抗以及与肥胖相关的代谢紊乱性疾病[17-18]。FGF21不仅具有长效降糖的活性[19-21]，还可联合胰岛素等降糖药物呈现出显著的协同作用[5-22]，是治疗糖尿病、肥胖症和脂代谢异常的理想药物。
大肠杆菌在表达FGF21通常会面临靶蛋白的内含体表达以及内毒素的去除等问题，从而导致纯化成本的增加[5, 23-25]；毕赤酵母是目前最成功的真核表达系统之一，其自身的分泌蛋白较少，具有复杂的翻译后修饰且培养成本相对较低并可高密度发酵，十分适合异源蛋白的表达[26]。另外，通过酵母表达重组蛋白不含有内毒素、致癌基因和病毒DNA[27]。本实验即通过基因工程的方法构建了pPIC9K-rHSA-hFGF21和pPICZαA-rHSA-hFGF21重组表达载体，进而实现了重组rHSA-hFGF21蛋白在毕赤酵母中分泌表达。而本研究获得的高表达工程菌株X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21是没有经过加压筛选的，其目的蛋白的表达量要高于其他加压筛选菌株，原因可能是X33作为野生型菌株与GS115和SMD1168相比，其分泌能力、对外源蛋白的适应性以及对培养基的耐受性更强，对养分利用率和转化效率更高，这也表明X33作为野生型菌株在表达异源蛋白方面具有的部分优势[28-30]。
甲醇浓度是影响重组蛋白表达水平的重要参数，不仅控制着外源蛋白的表达效率更显著影响着细胞代谢的活力[31]。有研究表明，在合适的甲醇浓度下，外源蛋白的转录水平是甲醇不足时的5倍[32]，因此本研究对甲醇浓度进行优化，当甲醇浓度为0.5%时，rHSA-hFGF21的表达水平最低；当甲醇浓度为1.0%和2.0%时，rHSA-hFGF21的表达相近，考虑到高浓度甲醇对毕赤酵母细胞的毒性，确定甲醇的最佳浓度为1%。酵母细胞的数量以及外源蛋白的降解程度与培养时间有关，这是获得高蛋白表达水平的关键因素之一[33]。研究表明，异源蛋白表达的最佳培养时间为72 h至96 h[34]。此外，其他研究表明，较长的孵育时间可能导致表达的异源蛋白发生更多的蛋白水解消化[35]。所以在本研究中，我们探究了3种培养时间(48、72和96 h) 对蛋白表达的影响。结果表明，rHSA-hFGF21蛋白的表达水平在72 h时达到最高，培养96 h后rHSA-hFGF21蛋白降解严重，这与文献报道结果一致。经条件优化后rHSA-hFGF21的表达量可达到(97.8±1.0) mg/L。
传统初步纯化酵母上清的方法多为热处理法、硫酸铵沉淀法或超滤浓缩[28-29, 33]，但却面临耗时长及目的蛋白损失较多等问题，难以实现规模化生产。本实验通过中空纤维膜处理系统对工程菌诱导后上清进行澄清、浓缩及缓冲液的置换，不仅发挥了其处理量大、损耗低等优势，更除去菌体、部分杂蛋白、脂质和色素等分子，降低了非特异性吸附于下游亲和层析柱上的杂蛋白，有利于目的蛋白的纯化。并通过后续的亲和层析以及离子交换层析得到了纯度为98.18%的蛋白。
重组蛋白在表达及纯化过程中易产生多聚体，当HSA多聚体蛋白制品被注入人体后可导致血液中胶体渗透压的迅速下降，进而在体内排泄加快及引发其他不利反应。而本实验的非还原性SDS-PAGE电泳结果表明，纯化出的rHSA-hFGF21蛋白为单体结构。FGF21蛋白的稳定性及半衰期相对较短，经HSA融合后其体外稳定性实验表明，rHSA-hFGF21的抗胰蛋白酶降解能力和高温条件下的稳定性显著提升，更有利于蛋白的长期储存和运输。同时蛋白的体内稳定性分析实验也表明，与HSA融合后FGF21的半衰期延长了约27.6倍；在针对db/db小鼠的长效降糖作用研究中，hFGF21治疗组中小鼠在治疗后第4天血糖即有逐渐回升的趋势，但rHSA-hFGF21治疗组即使停药4 d后其血糖仍可维持在较低的水平，表明与hFGF21相比rHSA-hFGF21具有更好的长效降糖效果。
本研究筛选了一株高表达rHSA-hFGF21的毕赤酵母工程菌株。通过优化发酵条件，如OD值、甲醇浓度和诱导时间，提高了rHSA-hFGF21的表达量。经两步纯化后，rHSA-hFGF21的纯度达到98.18%，且该方法纯化的rHSA-hFGF21蛋白具有良好的体外稳定性及长效降糖活性。本研究发酵及纯化工艺的建立为rHSA-hFGF21的大规模生产奠定了基础。
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