2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 马秋怡, 石得阳, 汪碧忱, 曹牧天, 李浩渊, 袁卫平, 初雅婧
- MA Qiuyi, SHI Deyang, WANG Bichen, CAO Mutian, LI Haoyuan, YUAN Weiping, CHU Yajing
- 应用慢病毒shRNA文库结合二代测序筛选白血病细胞系增殖相关lncRNA
- Screening of proliferation related lncRNAs in leukemia cell lines by lentivirus shRNA library combined with second-generation sequencing
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3406-3418
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3406-3418
- 10.13345/j.cjb.220203
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文章历史
- Received: March 16, 2022
- Accepted: May 10, 2022
- Published: May 13, 2022
引用本文
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随着对真核生物复杂基因组转录过程的全面解析，人们认为在单个细胞中大约一半的基因组可以转录成RNA[1]。产生RNA的基因大致可以分为两种类型：蛋白质编码基因和非蛋白质编码基因。而非蛋白编码基因作为一个高度异质性的集合，可分为小分子非编码RNA (small non-coding RNA) 和长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)[2]，其中lncRNA被定义为长度超过200个核苷酸、缺少开放阅读框且不能翻译成蛋白质的转录产物。与小分子非编码RNA相比，lncRNA曾被认为是不精确转录产生的噪音[3]。但是由于其广泛的作用和未知的功能，近年来对lncRNA的研究越来越深入。在基因组上，转录lncRNA的基因位点既可以位于蛋白编码基因间，也可以与蛋白编码基因的内含子或外显子存在交叉，甚至完全覆盖。功能上，一些lncRNA转录本通过其本身募集调节因子到其位点和/或其本身的功能来调节邻近基因的表达；一些则从转录位点扩散，并以反式作用影响位于不同染色体上的基因；还有一些lncRNA的转录和/或剪接过程具有不依赖于lncRNA序列本身的调节功能。与特异定位于细胞质的mRNA不同，lncRNA可以位于细胞的不同的核区(例如染色质、核质、亚核结构域) 以及细胞质区[1, 4-6]，且与mRNA相比，大多数lncRNA的表达水平较低，表达方式具有组织和细胞特异性[4, 7-8]。近年来，越来越多的研究表明lncRNA在血液系统恶性肿瘤病理生理学上发挥重要作用。
造血干细胞的内环境稳态和血液细胞的形成依赖于生长因子、转录因子等不同途径间的相互作用，它们调控造血干细胞自我更新、静止、增殖和分化间的平衡[9]。这种关键作用的破坏可以导致肿瘤的发生，比如急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)、急性淋系白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)、慢性髓系白血病(chronic myelognous leukemia, CML) 等。目前已知数十种lncRNA可调节细胞多能性、谱系定向和凋亡等多种过程[10-12]，如lncRNA HOTAIRM1在白血病细胞中作为肿瘤抑制因子能够调控髓系成熟、细胞周期和自噬[13-15]；LncRNA ANRIL通过细胞中的AdipoR1/AMPK/SIRT1葡萄糖代谢通路促进AML细胞的增殖[16]；LncRNA NR-104098在体外阻碍AML细胞的生长并促进AML细胞的分化[17]；LncRNA通过分泌microRNA-608调节DDA1基因的表达，从而促进AML细胞的增殖和细胞周期[18]。许多lncRNAs已被证明通过不同途径调节AML细胞的生长。然而，迄今为止，已发现的具有功能的lncRNA不超过所有lncRNA的3%[19]。因此，需要进一步地研究来寻找可能调节AML细胞生长的lncRNAs。LncRNAs除了在白血病中发生作用外，最近的研究还表明lncRNAs可作为白血病患者诊断、预后和治疗反应的生物标志物[20]，如：LINC01255在AML患者的骨髓细胞、MDS-AML患者的CD34+细胞和AML细胞系中高度表达，且LINC01255的高表达与AML患者的低生存率相关[21]。
在传统研究中，探究某一基因的作用主要是通过RNA干扰(RNA interference, RNAi) 的方式靶向研究单个候选基因，但是短干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) 在细胞内寿命短，且难以将siRNA有效传递给原代细胞；而短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA) 可以由宿主持续合成，作用时间相对更持久。近年来，shRNA文库的出现和高通量测序技术的发展使得对多个基因缺失的功能研究成为可能，并且有助于研究与各种生物功能相关的新基因[22]。
尽管相关研究已经取得一些进展，但是利用高通量测序结合shRNA文库筛选的方法研究AML疾病中lncRNA的功能作用仍处于起步阶段。在本研究中，我们从AML/MDS患者核型异常的造血干祖细胞中筛选出与健康人群相比表达量显著升高的lncRNA，通过设计包含靶向74个lncRNA序列和对照序列的456条特异shRNA文库，按照标准进行严格筛选及实验研究，发现其中lncRNA C20orf204-203对于白血病细胞系的增殖和凋亡有显著影响。本研究证实利用shRNA文库的敲降作用筛选白血病细胞系中的功能性lncRNA的可行性，为研究lncRNA在白血病的发生和发展过程中的作用提供了新思路。
1 材料与方法 1.1 细胞培养293T细胞系：高糖-DMEM培养基培养，含10%的胎牛血清；K562、NOMO-1、Molm-13和THP-1细胞系：含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。
1.2 慢病毒文库包装在10 cm细胞培养皿中培养工具细胞293T至细胞密度达到80%–90%，将目的质粒文库与包装质粒psPAX2、pMD2.G按照质量比为7:5:3 (µg) 的比例加入到293T细胞上清中，使其共转染至293T中进行慢病毒的包装，6–7 h后换成新鲜培养基，48 h和72 h后分别收集细胞上清，此时病毒文库存在于上清中，然后利用超速离心机对病毒文库进行10倍浓缩。
1.3 转基因K562细胞系的构建将浓缩后的病毒在感染复数(multiplicity of infection, MOI) 为0.5的情况下感染K562细胞系，使得待感染细胞数量为病毒数量的2倍。感染体系中加入聚凝胺(1 µg/mL) 提高慢病毒感染细胞的效率。感染后72 h，待病毒已经整合至细胞基因组中，加入嘌呤霉素(3 µg/mL) 培养2 d筛选出被病毒感染的细胞。对于不同细胞系，需要设定嘌呤霉素的浓度梯度(1–5 µg/mL)，选择72 h内可以破坏90%以上细胞的浓度。
1.4 shRNA文库筛选分析方法嘌呤霉素筛选之后将细胞等分成2份，一部分细胞冻存于−80 ℃用作基线测序(baseline sample)，一部分细胞继续培养5 d (Day 5 sample)，5 d后提取这两部分细胞的DNA，扩增标签序列，通过高通量测序测定每一个标签序列的读长，并且将各自标签序列测得的读长标准化到各自标签序列读长总数上。“Day 5 sample”和“baseline sample”中标签标准化读长的比值代表各个shRNA频率的分布。因为shRNA的频率分布是随机的，所以“Day 5 sample”中对照组对应的shRNA频率相对于“baseline sample”中对照组对应的shRNA频率的变化作为阈值，若“Day 5 sample”中实验组中某一lncRNA对应的shRNA有3条或3条以上的频率相对于“baseline sample”中对应的shRNA频率的变化比阈值低，则认为在K562细胞系中敲降该lncRNA后使细胞增殖能力降低。
1.5 细胞增殖实验收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度，接种于96孔板，每孔加100 µL细胞悬液。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养1–6 d。每天取一个培养板，每孔中加入10 µL CCK-8置于37 ℃培养箱中孵育4 h。轻轻振荡后在Synergy H4 Microplate Reader上测定450 nm波长处的吸光度。绘制生长曲线。
1.6 DNA提取使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN, DP304-03) 提取细胞DNA，Qubit核酸定量分析试剂盒测定微量DNA浓度。
1.7 核质RNA分离实验使用Cytoplasmic & Nuclear RNA纯化试剂盒(NORGEN, 21000) 分离细胞核和细胞质的RNA，用qRT-PCR进行分析。
1.8 qRT-PCR检测使用RNAprep FastPure动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(擎科，TSP413) 从细胞中分离RNA，通过逆转录试剂盒(TaKaRa, RR047A) 将100–1 000 ng RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green定量RT-PCR试剂盒(Roche, 57313500) 进行定量RT-PCR。
1.9 细胞周期的检测K562-shC20-scramble、K562-shC20-B、K562-shC20-C、THP-1-shC20-scramble、THP-1-shC20-B和THP-1-shC20-C组分别取1×106的细胞培养于6孔板中，培养12 h后用FITC-Ki67 (BD Bioscience公司) 和Hoechst 33342 (Sigma公司) 抗体标记细胞，流式细胞仪检测细胞周期比例。
1.10 细胞凋亡的检测K562-shC20-scramble、K562-shC20-B、K562-shC20-C、THP-1-shC20-scramble、THP-1-shC20-B和THP-1-shC20-C组分别取1×106的细胞培养于6孔板中，培养12 h后用FITC-Annexin V和7-AAD抗体(BD Bioscience公司) 标记凋亡细胞，流式细胞仪检测凋亡细胞比例。
1.11 免疫印迹分析K562-shC20-scramble、K562-shC20-B、K562-shC20-C、THP-1-shC20-scramble、THP-1-shC20-B和THP-1-shC20-C组分别取1×106的细胞，1 mL PBS重悬细胞清洗一遍，离心弃上清，加入1 mL RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂(Invitrogen公司)，使用超声破碎仪超声。将超声后样本上清转移到新EP管。BCA法测定蛋白浓度后进行免疫印迹实验。经12% SDS-PAGE凝胶电泳和转膜后，依次孵育一抗和二抗，加显影液并用ImageQuantLas4000 (GE公司) 检测。
1.12 统计学方法数据采用GraphPad Prism 8版本进行统计学分析，用非配对Student’s t检验进行统计学差异分析，P < 0.05为有统计学差异(*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001)。
2 结果与分析 2.1 设计针对74个lncRNAs的shRNA文库本研究首先排除AML/MDS患者造血干祖细胞中异常的染色体核型中包含已知原癌基因和抑癌基因的区域，注释剩余区段内的lncRNAs，分析这些lncRNAs在健康人群造血干祖细胞和AML/MDS患者造血干祖细胞中的表达量是否有差异，对患者造血干祖细胞中表达量高于健康人群造血干祖细胞的lncRNAs进行下一步研究。最终筛选出74个lncRNAs参与下一步实验(图 1A)。
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| 图 1 候选lncRNAs的选择策略和影响增殖的lncRNAs的筛选流程 Fig. 1 Selection strategy of candidate lncRNAs (A) and screening process of lncRNAs affecting proliferation (B). (C) Library infection quality control: scatter plot of the log 2-transformed DNA sequencing read values from baseline sample versus the sequencing reads of the input pooled plasmid library. (D) Sequencing reads of shRNA barcodes against lncRNA C20orf204-203. Data are relative to barcode reads of shRNAs of control. |
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设计针对74个lncRNAs和对照序列的shRNA文库，将shRNA序列整合到pLVX慢病毒载体骨架上，此载体上包含mCherry荧光报告基因和嘌呤霉素抗性基因，通过流式细胞分析仪(fluorescence activating cell sorter, FACS) 测定荧光报告基因呈阳性的细胞所占百分比以确定病毒对细胞的转导效率，并利用嘌呤霉素筛选出被病毒感染的细胞。在此载体上U6启动子控制shRNA的表达，每条包含shRNA的载体上均带有一个独特的标签用于高通量测序后的鉴别。文库中针对每条lncRNA分别设计了6条对应的shRNA，还包含有12条shRNA不靶向任何基因序列作为对照组。由于作为对照组的12条shRNA不靶向任何序列，所以其测序后的频率分布将作为筛选的阈值(图 1B)。
2.2 利用shRNA文库筛选抑制K562细胞系增殖的lncRNA将shRNA质粒文库包装成慢病毒文库感染K562细胞系，MOI值设为0.5，以此确保每个细胞只被一个携带shRNA的病毒感染。感染后72 h收集细胞并用嘌呤霉素筛选2 d后，将细胞等分成两份，一份冻存于–80 ℃用作基线样本，另一份不再加嘌呤霉素，继续培养5 d，5 d后同时提取两份细胞的基因组DNA进行高通量测序。为了确保文库的完整性，我们对质粒文库和基线样本测序后的读长数量进行了相关性分析，结果显示两个样本的读长数量相关性良好，说明基线样本对质粒文库覆盖度良好(图 1C)。对基线样本和培养5 d后的细胞样本的测序结果进行分析，确定每一个标签的频率分布。若一个lncRNA所对应的6条shRNA中，有3条或3条以上shRNA的读长数量低于对照的读长数量，例如C20orf204-203 (图 1D)，则认为该lncRNA被敲降后会抑制K562细胞系的增殖。按照此筛选标准，最终筛选出6个lncRNA，依次为PAN3-204、C20orf204-203、RPL21-209、NELFCD-202、MKLN1-211和SUGT1P3-201。
2.3 C20orf204-203在K562和THP-1细胞中定位于胞质在筛选出的6个lncRNAs中，我们选择lncRNA C20orf204-203进行下一步研究。C20orf204基因位于20号染色体上，ENSEMBL数据库Human (GRCh38.p13) 显示其有5个转录本，其中转录本C20orf204-203为长度大于200个核苷酸的非编码RNA。qRT-PCR实验表明，在K562、THP-1、NOMO-1和Molm-13这4个白血病细胞系中，THP-1细胞系中lncRNA C20orf204-203的表达量相对较高(图 2A)，同时核质分离试验证实在K562和THP-1细胞系中，以定位于细胞核(以字母“N”表示) 的U6基因和定位于胞质(以字母“C”表示) 的β-Actin为阳性对照，lncRNA C20orf204-203相对定位在细胞质(图 2B–2C)。
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| 图 2 C20orf204-203在K562和THP-1细胞中定位于胞质 Fig. 2 C20orf204-203 was localized in the cytoplasm of K562 and THP-1 cells. (A) Expression of C20orf204-203 in leukemia cell lines. (B–C) Subcellular distribution of C20orf204-203 in K562 and THP-1 subfractions, U6 expression level in nucleic fraction and β-actin expression level in cytoplasmic fraction were measured and used as positive controls. *: P < 0.05. |
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从shRNA文库中选取3条靶向C20orf204-203的shRNA，分别命名为shC20-A、shC20-B和shC20-C，将3条序列分别整合到pLVX慢病毒载体骨架上，包装成慢病毒，构建稳转细胞系：K562-shC20-A、K562-shC20-B、K562-shC20-C、THP-1-shC20-B和THP-1-shC20-C，在K562细胞系中敲降C20orf204-203，发现shC20-B和shC20-C针对该基因有敲降作用，而shC20-A对该基因的敲降作用并不明显(图 3A–3B)。CCK-8实验证实：相比于对照组，K562-shC20-B、K562-shC20-C和THP-1-shC20-C细胞增殖相对减慢(图 3C–3D)。以上结果说明在K562细胞系和THP-1细胞系中敲降lncRNA C20orf204-203可以使细胞增殖能力降低。
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| 图 3 C20orf204-203敲降的K562和THP-1细胞增殖能力降低 Fig. 3 Knockdown of C20orf204-203 decreased K562 and THP-1 proliferation. (A–B) Relative expression of C20orf204-203 in K562-shC20-B, K562-shC20-C, THP-1-shC20-B and THP-1-shC20-C. Expression level was measured with qPCR. (C–D) Cell growth curve. *: P < 0.05; ***: P < 0.001; ****: P < 0.000 1. |
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为了进一步探究K562和THP-1细胞中敲降lncRNA C20orf204-203后对细胞的影响，用Ki67和Hoechst 33342标记K562-shC20-B、K562-shC20-C、THP-1-shC20-B和THP-1-shC20-C，通过流式细胞仪检测细胞周期发现，与对照组K562-shScramble和THP-1-shScramble相比，实验组细胞周期没有明显差异(图 4A–4B)；但是通过Annexin V和7-AAD标记细胞，流式细胞仪检测显示，实验组早期凋亡细胞比例增加(图 4C–4D)。qRT-PCR实验显示K562-shC20-B和K562-shC20-C细胞中基因TP53和抗凋亡基因BCL2表达量变化不明显，但是促凋亡基因BAD表达水平上升；THP-1-shC20-B和THP-1-shC20-C细胞中TP53和BCL2基因表达量下降，THP-1-shC20-B中BAD基因表达水平上升(图 4E)。蛋白水平检测发现在THP-1-shC20-B和THP-1-shC20-C细胞中，BCL2、TP53蛋白表达量下降，Caspase 3蛋白表达量下降，激活型Caspase 3蛋白表达量上升，但是在K562-shC20-B和K562-shC20-C细胞中变化不明显(图 4F)。
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| 图 4 C20orf204-203敲降的K562和THP-1凋亡增加，细胞周期变化不明显 Fig. 4 Knockdown of C20orf204-203 increased K562 and THP-1 apoptosis without obvious changes of cell cycle. (A–B) K562-shC20-B、K562-shC20-C, THP-1-shC20-B and THP-1-shC20-C cell cycle detection by Ki67. (C–D) K562-shC20-B、K562-shC20-C, THP-1-shC20-B and THP-1-shC20-C cell apoptosis analysis by Annexin V. (E) Expression level of TP53, BCL2 and BAD in K562-shC20-B, K562-shC20-C, THP-1-shC20-B and THP-1-shC20-C. Expression level was measured with qRT-PCR. (F) Validation of TP53, BCL2, Caspase 3 and Cleaved Caspase 3 protein level in K562-shC20-B, K562-shC20-C, THP-1-shC20-B and THP-1-shC20-C. Expression level was measured using Western blotting. **: P < 0.01; ns: not significant. |
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MDS是一种无效造血性疾病，其特征是造血细胞前体分化缺陷和异常克隆扩增[23-25]。大约30%患有这种骨髓衰竭综合征的MDS患者会发展为AML[26]。而AML是由于造血细胞前体基因改变导致克隆性髓系干细胞产生过度的造血干细胞的疾病。近年人们发现lncRNAs是多种细胞机制的新型调节因子。事实上，由于lncRNAs数量多、作用模式广泛，它们很可能几乎在任何细胞途径中起着关键作用[27]。已有文献系统地总结了lncRNAs在正常造血和恶性造血中扮演的角色[28]，并且发现在血液细胞中，lncRNA对不同分化谱系和免疫反应等生理环境具有高度特异性[29-30]。
目前利用shRNA逆转录病毒和慢病毒载体文库，RNAi筛查已成为从基因上剖析正常和恶性HSC功能的有力工具[31]，并且RNAi筛查成功地在体外[32]和体内[33]鉴定了恶性造血中的几个重要驱动基因，尤其是在AML疾病中。但是，AML的病因尚未完全了解，而且由于AML患者，尤其是复发和难治性AML患者的复杂性和异质性，改善AML的治疗仍然是一个巨大的挑战。K562细胞系是人红白血病细胞系，因9号和22号染色体间的易位导致BCR和ABL基因融合，使胞质中Bcr-Abl激酶表达[34]；并且其在蛋白和mRNA水平都有TP53基因表达缺陷；在一定的体外条件下，K562细胞系可被多种化学物质诱导向红系分化，因为其染色体核型异常且多变，所以是临床和基础领域中筛选新的抗肿瘤药物的常用工具细胞。在本实验中，我们首先通过分析健康人群的造血干祖细胞和核型异常的AML/MDS患者造血干祖细胞中表达量有差异的lncRNA确定我们的研究对象，然后利用shRNA慢病毒文库结合高通量测序的方法筛选出对K562细胞系增殖有影响的lncRNAs，其中lncRNA PAN3-204在数据库ENSEMBL Human (GRCh37) 中显示位于13号染色体28 712 643–28 846 450位置，而circPAN3基因位于13号染色体28 830 428–28 841 538位置，虽然二者之间的关系目前尚不明确，但是有研究表明，circPAN3被发现与AML细胞的增殖、凋亡和细胞周期有关[35]，并且circPAN3的上调参与AML细胞耐药性的形成[36]。同时CCK8实验显示，在K562和THP-1细胞系中敲降lncRNA C20orf204-203会导致细胞增殖减慢，说明我们在AML细胞系中利用shRNA文库筛选功能性lncRNA的方法是可行的。
前期研究表明，包括信号和激酶途径(FLT3、KRAS、NRAS、KIT、PTPN11和NF1)、表观遗传修饰物(DNA甲基化和染色质修饰)、核磷蛋白(NPM1)、转录因子(CEBPA、RUNX1和GATA2)、肿瘤抑制因子(TP53)、剪接体复合物(SRSF2、U2AF1、SF3B1和ZRSR2)和黏着素复合体(RAD21、STAG1、STAG2、SMC1A和SMC3) 等许多基因突变在发病机制、预后和治疗中发挥着重要作用[37]。其中TP53介导多种细胞途径，包括DNA损伤修复、细胞周期阻滞和凋亡的启动[38-39]。TP53蛋白在肿瘤细胞中积累，从而导致并促进肿瘤的发生和化疗耐药。在包括造血干细胞在内的大多数细胞中，TP53在非活性状态下维持在低水平[40-41]。在我们的实验中发现敲降lncRNA C20orf204-203的K562和THP-1细胞TP53、BCL2基因在mRNA水平上表达降低；BAD基因在mRNA水平上表达升高。TP53、BCL2和Caspase 3基因在蛋白水平上表达明显降低。以上结果与早期凋亡细胞比例增加结果一致。虽然在我们的实验中发现敲降lncRNA C20orf204-203会导致细胞增殖能力降低，但是通过Ki67检测细胞周期实验发现敲降lncRNA C20orf204-203后，K562和THP-1细胞周期变化没有明显差异，并且靶向同一lncRNA的不同shRNA在不同细胞系的敲降效率以及对同一lncRNA在同种细胞系中的敲降效率存在差异。同时实验结果显示，在敲降C20orf204-203的K562和THP-1细胞系中，活化的Caspase 3蛋白水平变化不一致，可能由于文库筛选是在K562细胞系中进行，所以导致在K562和THP-1细胞系中分别验证时结果出现差异，也可能因此导致一些在AML/MDS患者中表达量相对高的lncRNA在筛选过程中被遗漏。这也表明该文库在其他细胞系中的筛选结果有待验证，敲降lncRNA C20orf204-203后对细胞周期的影响以及导致细胞系凋亡增加的作用机制还需要进一步实验探究。
综上所述，我们的研究显示在K562和THP-1细胞系中敲降lncRNA C20orf204-203后使细胞增殖能力降低，促进了细胞的凋亡，TP53、BCL2基因在mRNA和蛋白水平表达量下调，BAD在mRNA水平表达量升高，同时在蛋白水平上，Caspase 3表达量下降，激活型Caspase 3表达水平上升。本课题研究结果表明，利用shRNA文库靶向AML/MDS患者核型异常的造血干祖细胞中表达量与正常造血干祖细胞中表达量有差异的lncRNAs，进而筛选出功能性lncRNAs是可行的。
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