2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 孟庆鑫, 焦鹏涛, 孙蕾, 王大燕, 罗廷荣, 范文辉, 刘文军
- MENG Qingxin, JIAO Pengtao, SUN Lei, WANG Dayan, LUO Tingrong, FAN Wenhui, LIU Wenjun
- B型流感病毒B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株的遗传进化及其对小鼠的致病性分析
- Phylogenetic and pathogenicity analysis of influenza B virus strain B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3390-3405
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3390-3405
- 10.13345/j.cjb.220139
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文章历史
- Received: February 25, 2022
- Accepted: June 6, 2022
引用本文
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2. 中国科学院微生物研究所 病原微生物与免疫学重点实验室, 北京 100101;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 中国疾病预防控制中心, 北京 102206
2. Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
流感病毒(influenza virus) 是引起人和动物呼吸道疾病的重要病原体，对公共卫生和人类健康构成严重威胁。流感病毒目前分为A、B、C、D四个型[1-2]，A型流感病毒(influenza A virus, IAV) 宿主范围较广[3]，可感染人、哺乳动物和禽类等，而B、C和D型流感病毒的宿主范围有限，其中，B型流感病毒(influenza B virus, IBV) 自然条件下仅感染人和海豹[4-7]。IAV可引起人类流感大流行，而IBV常在全球范围内以与IAV共流行的方式引起流感的局部暴发或季节性流行，尤其对儿童和青少年较为易感[8]。相较于IAV，IBV更容易引发感染者产生并发症，且在一定季节内造成的疾病负担甚至超过IAV[9]，但目前关于IBV的研究较少。
IBV (B/Lee/1940) 于1940年被首次分离[10]，从1985年开始逐渐进化为B/Victoria和B/Yamagata两大谱系，于20世纪90年代开始共同循环流行，并且经常在局部区域交替出现[11-12]。IBV基因组包括8个分节段的单股负链RNA，共编码至少11种蛋白[13]，主要通过碱基插入、缺失、突变以及谱系间和谱系内的频繁重配实现抗原进化[14-17]。对IBV核苷酸和氨基酸的遗传进化及突变位点比对分析有助于评估抗原进化、发现新的突变基因并对流感病毒的防控提供参考。另外，如果要对IBV的致病性机制进行深入研究，稳定的IBV动物感染模型显得尤为重要。目前大多数研究者通过对小鼠进行免疫抑制后感染或采用传代法筛选出致死性的IBV鼠适应株[18-19]，从而建立小鼠致死模型，而用临床毒株直接感染建立小鼠致死模型的研究鲜有报道。
本研究对IBV Victoria谱系的临床分离毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018进行了关键基因片段血凝素(hemagglutinin, HA) 和神经氨酸酶(neuraminidase, NA) 的遗传进化特点分析，并研究了其对BALB/c小鼠的致病性，结果发现该毒株对小鼠高度易感并致死。本研究旨在为研究IBV的致病及传播机制奠定基础，为评价新型疫苗、抗病毒和抗炎症药物提供理想的动物模型。
1 材料与方法 1.1 实验室设备与临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018有关的实验操作均在生物安全二级实验室(bio-safety level laboratory-2, BLS-2) 进行，根据病原微生物的危害等级穿戴相应的防护用品，且所有操作严格遵循BLS-2操作规范。本研究中用到的实验动物均饲养于独立通气笼盒(individual ventilated cages, IVC) 中。
1.2 毒株、细胞及实验动物IBV毒株(B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018)由中国疾病预防控制中心提供并由本实验室保存；犬肾细胞系(madin-darby canine kidney cells, MDCK) 由本实验室保存；6周龄雌性无特定病原体(specific pathogen free, SPF) BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
所有动物实验均经过中国科学院微生物研究所动物实验与人类生物医学研究伦理委员会审核并批准(APIMCAS2021)。
1.3 主要试剂与仪器设备麻醉剂(1.25%阿佛丁) 购自南京爱贝生物科技有限公司；Trizol Reagent、DMEM培养基购自Thermo Fisher科技公司；逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂购自Promega公司；脱氧核苷酸混合物(dNTPs)、寡聚胸腺嘧啶(oligo dT) 和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ购自大连宝生物工程有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 为Gibco公司产品。组织细胞破碎仪购自湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 仪购自ABI公司；NanoDrop 1 000超微量分光光度计购自Thermo Fisher公司；PCR仪购自杭州柏恒科技有限公司。
1.4 病毒的遗传进化与分子特征分析以WHO推荐的IBV疫苗株和国内2016–2021年部分IBV流行毒株为参考毒株，其HA、NA基因登录号见表 1，利用MEGA 7.0软件中的Clustal W进行多序列比对，采用相邻连接法(neighbor-joining method) 绘制毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 HA和NA基因片段的遗传进化树，bootstrap循环值设为1 000。利用DNAstar软件中的MegAlign对该毒株的HA、NA氨基酸序列与参考毒株进行同源性分析。以疫苗株为对照，对研究毒株HA和NA的关键氨基酸位点变化进行分析，并通过SWISS-MODEL搜索HA和NA氨基酸序列的三维结构模板并模拟其三维结构，关键突变位点均通过Py MOL软件编辑并标出。
| Strain name | Strain ID |
| B/Wisconsin/01/2010 | JN993031.1 (HA)/JN993012.1 (NA) |
| B/Brisbane/60/2008 | KX058884.1 (HA)/FJ766841.1 (NA) |
| B/Colorado/06/2017 | CY236607.1 (HA)/CY236609.1 (NA) |
| B/Washington/02/2019 | MN155753.1 (HA)/MN155755.1 (NA) |
| B/Massachusetts/2/2012 | MT056027.1 (HA)/MT056021.1 (NA) |
| B/Phuket/3073/2013 | EPI1381150 (HA)/EPI1381149 (NA) |
| B/Zhejiang-Shangcheng/16/2018 | EPI1229511 (HA)/EPI1229513 (NA) |
| B/Guangxi-Xixiangtang/11019/2016 | EPI963544 (HA)/EPI963543 (NA) |
| B/Guizhou-Kaili/11102/2020 | EPI1845137 (HA)/EPI1844417 (NA) |
| B/Zhejiang-Yiwu/1976/2019 | EPI1692080 (HA)/EPI1692079 (NA) |
| B/Shanghai-Pudongxin/11420/2019 | EPI1648907 (HA)/EPI1648906 (NA) |
| B/Zhejiang-Jiaojiang/11018/2019 | EPI1648448 (HA)/EPI1648447 (NA) |
| B/Henan-Wolong/1275/2019 | EPI1503775 (HA)/EPI1503774 (NA) |
| B/Jiangxi-Xihu/1876/2018 | EPI1381120 (HA)/EPI1381119 (NA) |
| B/Shanxi-Xinghualing/1104/2019 | EPI1381093 (HA)/EPI1381092 (NA) |
| B/shenzhen/2018-22511/2017 | EPI1341167 (HA)/EPI1341166 (NA) |
| B/Yunnan-Funing/31/2017 | EPI1340152 (HA)/EPI1340151 (NA) |
| B/Sichuan-Gaoxin/1914/2017 | EPI1340131 (HA)/EPI1340130 (NA) |
| B/Guizhou-Jinping/31/2017 | EPI1340089 (HA)/EPI1340088 (NA) |
| B/Anhui-Tianjiaan/1773/2017 | EPI1340074 (HA)/EPI1340073 (NA) |
| B/Jilin-Hunjiang/1316/2018 | EPI1339735 (HA)/EPI1339734 (NA) |
| B/Heilongjiang-Daowai/1185/2018 | EPI1339711 (HA)/EPI1339710 (NA) |
| B/Shanghai-Pudongxin/1293/2018 | EPI1339684 (HA)/EPI1339683 (NA) |
| B/Guangdong-nanshan/39/2018 | EPI1339309 (HA)/EPI1339308 (NA) |
| B/Liaoning-Shuangta/1535/2016 | EPI885522 (HA)/EPI885521 (NA) |
| B/Guangxi-Jiangzhou/1924/2016 | EPI885486 (HA)/EPI885485 (NA) |
| B/Heilongjiang-Nangang/1224/2016 | EPI768871 (HA)/EPI768870 (NA) |
| B/Fujian-Zhangping/32/2016 | EPI768856 (HA)/EPI768855 (NA) |
| B/Jiangxi-Anyuan/1750/2021 | EPI1918235 (HA)/EPI1918234 (NA) |
| B/Guangxi-Hengxian/314/2020 | EPI1845170 (HA)/EPI1844483 (NA) |
| B/Hubei-Danjiangkou/2380/2021 | EPI1918283 (HA)/EPI1918282 (NA) |
| B/Jiangxi-Linchuan/1969/2021 | EPI1918227 (HA)/EPI1918226 (NA) |
| B/Chongqing-Yuzhong/1781/2021 | EPI1918115 (HA)/EPI1918114 (NA) |
| B/Zhejiang-Ninghai/2531/2021 | EPI1917675 (HA)/EPI1917674 (NA) |
| B/Guangxi-Lingshan/359/2018 | EPI1340873 (HA)/EPI1340872 (NA) |
| B/Guangxi-Jiangzhou/1311/2018 | EPI1340560 (HA)/EPI1340559 (NA) |
| B/Guangxi-Jiangzhou/1722/2018 | EPI1339369 (HA)/EPI1339368 (NA) |
| B/Guangxi-Jiangzhou/512/2018 | EPI1340539 (HA)/EPI1340538 (NA) |
| B/Guangxi-Jiangzhou/1584/2018 | EPI1340308 (HA)/EPI1340307 (NA) |
| B/Guangxi-Lingshan/340/2018 | EPI1339750 (HA)/EPI1339749 (NA) |
| B/Hunan-Kaifu/1628/2021 | EPI1918043 (HA)/EPI1918042 (NA) |
| B/Guangxi-Chengzhong/133/2018 | EPI1168548 (HA)/EPI1168547 (NA) |
| B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 | EPI1340557 (HA)/EPI1340556 (NA) |
| B/Guangxi-Changzhou/373/2018 | EPI1339516 (HA)/EPI1339515 (NA) |
取生长状态良好的MDCK细胞于96孔细胞培养板中培养，待细胞汇合度至80%后使用。将IBV 10倍梯度稀释(10−3−10−10) 后感染(每个梯度设8个重复孔)，同时设立非感染孔作为阴性对照。置于33 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h，观察并记录细胞病变(cytopathic effect, CPE) 结果。根据Reed-Muench方法计算IBV的半数组织感染量(median tissue culture infective dose, TCID50)。
1.6 IBV感染BALB/c小鼠半数致死量的测定将初始滴度为107.5 TCID50/mL的IBV用无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS) 进行2倍梯度稀释后置于冰上备用。将6周龄BALB/c雌性小鼠随机分成5组，每组6只，腹腔注射阿佛丁麻醉后，用初始浓度及2倍梯度稀释后的IBV对其进行滴鼻感染，50 μL/只，对照组以相同方式给予无菌PBS。连续15 d观察小鼠存活状况并记录体重，根据Reed-Muench方法计算IBV感染小鼠的半数致死量(median lethal dose, LD50)。
1.7 IBV对BALB/c小鼠的致病性分析选取6周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为2组，分别为IBV感染组(30只) 与阴性对照组(3只)，将小鼠腹腔麻醉后，以0.5 LD50/只的剂量滴鼻感染小鼠，阴性对照组以相同方式给予无菌PBS。感染组分别在感染后12 h、1 d、3 d、5 d和7 d时解剖6只小鼠，其中3只无菌取肺脏置于1 mL含1‰双抗无血清DMEM中，经3次冻融研磨后离心取上清，进行TCID50测定；另外3只无菌取肺脏，左肺于4%的多聚甲醛中固定72 h后，送武汉赛维尔生物科技有限公司制备苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE) 的病理切片，右肺置入无菌研磨管中研磨，TRIzol法提取RNA并反转录成cDNA，实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction, RT-qPCR) 方法检测cDNA中的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素6 (interleukin 6, IL-6)、白介素1 β (interleukin 1 beta, IL-1β) 和天然免疫相关细胞因子干扰素α (interferon alpha, IFN-α)、干扰素β (interferon beta, IFN-β)、干扰素γ (interferon gamma, IFN-γ) 的mRNA水平。阴性对照组左右肺分开处理。其中，炎性细胞因子的RT-qPCR引物序列见表 2。
| Gene | Forward primer (5′→3′) | Reverse primer (5′→3′) |
| TNF-α | CCAAAGGGATGAGAAGTTCC | CTCCACTTGGTG GTTTGCTA |
| IL-6 | ATGAAGTTCCTCTCTGCAAG | GTGTAATTAAGCCTCCGACT |
| IL-1β | TAGGCTCATCTGGGATCCTC | AAAAGGTGGCATTTCACAGT |
| IFN-α | ATGGCTAGGCTCTGTGCTTT | CTCTTGTTCCTGAGGTTAT |
| IFN-β | AGCTCCAAGAAAGGACGAACAT | GCCCTGTAGGTGAGGTTGATCT |
| IFN-γ | ATGAACGCTACACACTGCATCTTG | TCAGCAGCGACTCCTTTTCC |
| GAPDH | ACCACCATGGAGAAGGCTGG | CTCAGTGTAGCCCAGGATGC |
采用2−ΔΔCt法分析RT-qPCR结果，并用Microsoft Excel进行统计分析，所有数据均以至少3个独立实验的x±s表示。两组之间的比较采用双尾学生t-test检验(unpaired, two-tailed Student t-test) 分析差异显著性，*: P < 0.05; **: P < 0.01。使用GraphPad Prism 8软件进行作图。
2 结果与分析 2.1 遗传进化分析结果 2.1.1 HA和NA基因进化树分析以WHO推荐的疫苗株和国内2016‒2021年局部暴发流行的部分毒株为参考株，对B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的HA和NA基因构建遗传进化树，如图 1和图 2所示，IBV被分为Victoria和Yamagata两大谱系，遗传进化树显示B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018属于Victoria谱系，与疫苗株B/Washington/02/2019、B/Brisbane/60/2008和B/Colorado/06/2017同属一个分支，无谱系间重配现象。HA和NA遗传进化树均显示，B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与同年分离的毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1311/2018亲缘关系最近。
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图 1 B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的HA基因进化树
Fig. 1 The phylogenetic tree constructed based on the HA gene of strain B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 by neighbor-joining method.   |
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图 2 B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的NA基因进化树
Fig. 2 The phylogenetic tree constructed based on the NA gene of strain B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 by neighbor-joining method. |
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对HA氨基酸序列进行同源性分析发现B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与以上参考毒株的同源性在92.3%−99.8%之间。其中与2017年疫苗株B/Brisbane/60/2008和2020年的疫苗株B/Washington/02/2019的同源性均为99.7%；与2018年和2019年的疫苗株B/Colorado/06/2017同源性为98.8%。
对NA氨基酸序列进行同源性分析发现B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与以上参考株的同源性在92.9%−100.0%之间。与2017年疫苗株B/Brisbane/60/2008的同源性为98.7%；与2018年和2019年的疫苗株B/Colorado/06/2017、2020年的疫苗株B/Washington/02/2019同源性均为99.8%。
2.1.3 病毒HA、NA等关键氨基酸位点分析HA基因的高度突变性是流感病毒发生抗原漂移的重要原因，尤其是HA1的4个抗原决定簇120环(116−137)、150环(141−150)、160环(162−167) 和190螺旋(194−202)，其中Victoria谱系的120环还包含75和77位点[20]。B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与疫苗株相比，HA1区的氨基酸差异位点如表 3所示，并在模拟的HA三维结构模式图(图 3) 中标出，HA蛋白建模模板编号为PDB ID: 4NRL。B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，HA1区的突变位点有位于120环的I117V、N129D和190环的S197N；与疫苗株B/Washington/02/2019相比，HA1区突变位点有位于120环的R133G、E136K和190环的S197N，且在160环中有3个氨基酸(KND) 插入；与疫苗株B/Colorado/06/2017相比，有3个突变位点，分别是位于120环的G129D、位于160环的D162K和位于非抗原决定区的V180I，另外在160环还有2个氨基酸(ND) 插入。
| Strains | 117 | 129 | 133 | 136 | 162 | 163 | 164 | 180 | 197 |
| B/Brisbane/60/2008 | I | N | G | K | K | N | D | I | S |
| B/Washington/02/2019 | V | D | R | E | − | − | − | I | S |
| B/Colorado/06/2017 | V | G | G | K | D | − | − | V | N |
| B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 | V | D | G | K | K | N | D | I | N |
| − represents deletion. | |||||||||
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| 图 3 B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的HA蛋白三聚体、单体模拟图 Fig. 3 Simulated subunit and homotrimer of HA protein of strain B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018. (A) Simulated homotrimer of HA protein shown in green. (B) Simulated subunit of HA protein, HA1 shown in cyan, HA2 shown in yellow and the different amino acid in HA1 shown in blue. A：模拟的HA蛋白三聚体，用绿色表示；B：模拟的HA蛋白单体，HA1用青色表示，HA2用黄色表示，HA1区域中抗原决定区和RBS区的氨基酸差异位点用蓝色表示 |
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IBV HA上的受体结合位点(receptor binding site, RBS) 区由HA1的190螺旋(HA1 193−202) 构成顶部，240环(HA1 237−242) 构成左边缘，140环(HA1 136−143) 构成右边缘，HA1的4个残基Phe-95、Trp-158、His-191和Tyr-202构成了受体结合位点的基部[21]。B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与B/Colorado/06/2017相比受体结合位点并无发生突变；与B/Brisbane/60/2008相比，有位于190螺旋的S197N突变；与B/Washington/02/2019相比，有位于140环的E136K突变和位于190螺旋的S197N突变。另外，Glu-136和Asn-197是抗原表位相关氨基酸位点，S197N使该处增加1个糖基化位点。
NA可切断HA蛋白与唾液酸受体的结合，使病毒粒子释放并扩散，是抗流感病毒药物(神经氨酸酶抑制剂类) 的主要作用靶点。B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与疫苗株相比，NA的氨基酸差异位点如表 4所示，并在模拟的NA三维结构模式图(图 4) 中标出，其中NA蛋白建模模板编号为PDB ID：1B9V。与2017年疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的突变位点有I120V、K220N、S295R、N340D、E358K和D384G；与2018年疫苗株B/Colorado/06/2017相比，B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的突变位点有Q371K；与2019年疫苗株B/Washington/02/2019相比，B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的突变位点有T395A。
| Strains | 120 | 220 | 295 | 340 | 358 | 371 | 384 | 395 |
| B/Brisbane/60/2008 | I | K | S | N | E | K | D | A |
| B/Washington/02/2019 | V | N | R | D | K | K | G | T |
| B/Colorado/06/2017 | V | N | R | D | K | Q | G | A |
| B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 | V | N | R | D | K | K | G | A |
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| 图 4 B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的NA蛋白四聚体、单体模拟图 Fig. 4 Simulated subunit and homotetramer of NA protein of B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018. (A) Simulated homotetramer of NA protein shown in green. (B) and (C) simulated subunit of NA protein, rotate (B) 90° counterclockwise to get (C), NA neuraminidase active sites shown in cyan, the auxiliary sites shown in magenta and the different amino acid in HA1 shown in blue. A：模拟的NA蛋白四聚体，用绿色表示；B和C：模拟的NA蛋白单体，将(B) 逆时针旋转90°得到(C)，NA酶活性位点用青色表示，辅助位点用品红色表示，氨基酸差异位点用蓝色表示 |
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NA片段上的抗病毒药物关键作用位点包括8个酶催化活性位点(R118、D151、R152、R224、E276、R292、R371、Y406) 和11个辅助位点(E119、R156、W178、S179、D/N198、I222、E227、H274、E277、N294、E425)，分别作用于唾液酸底物和作为框架结构起稳定作用，这些关键位点的改变可能导致病毒耐药性的产生[22]。研究毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 NA片段中的上述保守位点，没有氨基酸突变，推测该毒株对神经氨酸酶抑制类药物敏感。
2.2 IBV对BALB/c小鼠致病性分析 2.2.1 IBV在MDCK细胞上的TCID50将IBV 10倍梯度稀释并感染96孔板中的MDCK细胞，感染72 h后观察细胞出现细胞病变(CPE) 的情况并记录，再根据Reed-Muench方法计算IBV的TCID50，测得IBV的滴度为107.5 TCID50/mL。
2.2.2 IBV感染BALB/c小鼠的LD50将不同剂量的IBV滴鼻感染6周龄BALB/c雌性小鼠后，连续15 d观察小鼠存活状况并记录体重，Reed-Muench方法计算出IBV感染BALB/c小鼠的LD50为105.9 TCID50。感染后小鼠的体重变化和生存曲线如图 5所示，106.2 TCID50组的小鼠感染后体重陡降，至第7天全部死亡；105.9 TCID50组的小鼠感染后体重持续下降，第7天降到最低，为实验开始时体重的75%，且出现部分死亡(死亡率50%)，随后存活小鼠体重逐渐回升；105.6 TCID50组的小鼠和105.3 TCID50组的小鼠感染后体重均出现不同程度地下降并回升，但无死亡。
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| 图 5 IBV感染后小鼠体重变化(A) 与生存曲线(B) Fig. 5 Body weight change (A) and survival rate (B) post infection. The animal experiment was repeated three times. |
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将感染后的小鼠心脏采血后进行解剖，取肺脏并观察IBV (0.5 LD50) 感染不同时间后的小鼠肺脏外观病变情况，如图 6A所示。对照组小鼠肺脏表面光滑，呈淡粉红色，颜色均匀，含气(图 6A-a)。感染后12 h (图 6A-b) 和1 d (图 6A-c)，肺脏出现肿胀，但病变不明显；感染后3 d，肺脏出现明显病变，病变范围约占整个肺脏的20%−40% (图 6A-d)；感染5 d后，肺脏病变范围扩大，约占整个肺脏的30%−50% (图 6A-e)；感染后7 d，肺脏病变进一步扩大，约占整个肺脏的70% (图 6A-f)。
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| 图 6 IBV感染小鼠引起的肺损伤 Fig. 6 Lung damage post IBV infection. (A) Appearance of lung post infection. a: negative control; b: 12 h post infection; c: 1 d post infection; d: 3 d post infection; e: 5 d post infection; f: 7 d post infection. (B) Lung indices post infection. *: P < 0.05, **: P < 0.01. (C) Histopathologic changes of lungs post infection. a: negative control; b: 12 h post infection; c: 1 d post infection; d: 3 d post infection; e: 5 d post infection; f: 7 d post infection. Scale bar=100 μm. |
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对解剖出的完整肺脏进行称量，计算肺指数，如图 6B所示。从图中可以看出，IBV感染后12 h的肺指数与对照组相比，差异不显著(P > 0.05)。随感染时间延长，肺指数持续升高，其中，感染后7 d肺指数(2.26%) 达最高，为对照组(0.8%) 的2.8倍，差异极显著(P < 0.01)。
取左肺置于4%的多聚甲醛中固定后，制备HE染色的病理切片并进行扫描分析，如图 6C所示。从图中可以看出，对照组肺泡充盈，形态结构明显(图 6C-a)；感染后12 h肺泡间隔增宽(图 6C-b)；感染后1 d肺泡间隔进一步加宽(图 6C-c)；感染后3 d发生肺实变，肺泡结构不明显，出现巨噬细胞和中性粒细胞(图 6C-d)；感染后5 d炎性细胞浸润、聚集(图 6C-e)；感染后7 d依然有炎性细胞浸润，但较5 d少(图 6C-f)。
2.2.4 IBV感染后小鼠肺内的病毒滴度为了详细了解IBV在小鼠肺脏中的复制情况，取研磨后的肺脏上清，测定其中IBV的TCID50，如图 7所示。结果表明，从感染后12 h开始，均能检测到病毒。感染后1 d的病毒滴度最高(103.3 TCID50/mL)，而感染后3 d、5 d和7 d，病毒滴度有所下降，分别为102.7 TCID50/mL、102.5 TCID50/mL和102.3 TCID50/mL。
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| 图 7 IBV感染后小鼠肺脏中的病毒滴度 Fig. 7 The IBV titer in lungs post infection. |
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TNF-α、IL-6、IL-1β为促炎细胞因子，可刺激和维持白细胞向炎症部位的细胞活化和迁移，导致炎症的发生，并可能造成疾病严重程度的升级[23]，因此本研究还对IBV感染后不同时间点小鼠肺脏中的TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平进行了检测，以期评估IBV引起的炎症反应，结果如图 8A–8C所示。与对照组相比，实验组的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA显著上调(P < 0.05)，且均在感染后12 h达到高峰，后呈下降的趋势。感染后12 h，TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平分别为对照组的21.5倍、25.0倍和8.5倍，说明IBV感染后能在短时间内引起肺脏中炎症反应的发生。
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| 图 8 IBV感染后小鼠肺脏细胞因子mRNA水平 Fig. 8 The mRNA transcription level of cytokines in lungs infected by IBV. *: P < 0.05; **: P < 0.01. |
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干扰素是机体抵抗病毒入侵的第一道天然免疫防线，在抗病毒的过程中发挥着重要的作用，IBV感染后干扰素可迅速上调[24-25]，因此，本研究还对IBV感染后小鼠肺脏中的IFN-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA水平进行了检测。结果如图 8D–8F所示。IBV感染后12 h，与对照组相比，IFN-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA水平显著上调(P < 0.05)。其中，IFN-α的mRNA水平在感染后12 h达到峰值，为对照组的7倍，随后与12 h相比呈逐渐下降趋势；IFN-β的mRNA水平在感染后1 d达到峰值，为对照组的11.5倍，随后与1 d相比呈逐渐下降趋势；而IFN-γ的mRNA水平在感染后7 d达到峰值，为对照组的14.6倍。
3 讨论IBV每年都在全球范围以局部暴发或季节性流行的方式引起流感的发生，约占全球流感疾病负担的1/3[26]，对全球公共卫生提出巨大挑战。IBV主要通过改变HA抗原性以逃避宿主的免疫系统，从而在普通人群中引起反复流行[27]。研究表明，只有发生在HA1区的抗原决定区和受体结合位点及其周围的点突变，才有可能造成流感病毒抗原改变，引发新的流感流行。据报道，HA片段162−164位是决定Victoria谱系IBV的抗原性的关键氨基酸位点，该位点缺失2个或3个氨基酸后均能引起抗原性改变[28]。在本文中，我们将研究毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与另外3个疫苗株的HA1区域氨基酸差异位点进行了比较(表 3)。其中，B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与B/Brisbane/60/2008 162−164位均无缺失，因此推测B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与B/Brisbane/60/2008抗原性相似；B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与疫苗株B/Washington/02/2019 (162−164位缺失) 和B/Colorado/06/2017 (163−164位缺失) 相比，抗原性可能发生了改变。
除HA的抗原性外，HA与受体的亲和性对病毒的感染也至关重要。已有报道表明，IBV HA片段的F95Y、G141E、R162M、D196Y、N197S和G141R/G237E突变均可影响HA与受体的亲和性。其中，F95Y、R162M、D196Y和N197S突变能增强HA与受体的亲和性(N194D和N197S主要增强HA与α-2, 3唾液酸受体的结合性，F95Y主要增强HA与α-2, 3唾液酸受体的结合性)，而G141E和G141R/G237E突变则可显著降低HA与受体的亲和性(G141R/G237E主要降低HA与α-2, 6唾液酸受体的结合性)[29-33]。本研究毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与疫苗株B/Brisbane/60/2008和B/Washington/02/2019之间存在S197N的突变，使该处增加1个糖基化位点，因此推测B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的HA对α-2, 3唾液酸受体的亲和性会更弱。B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018与疫苗株B/Colorado/06/2017相比，影响HA与受体结合的关键氨基酸并没有改变，因此推测B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的HA与受体的亲和性也未发生改变。
NA是B型流感病毒药物的作用靶点。据WHO检测数据，目前与IBV耐药相关的突变位点有R152K、D198E、D198N、I122T、N294S和G402S等[34]。另外Bumham等通过反向遗传技术发现了E199A和H274Y的突变可以降低病毒对药物的敏感性[35]。Fujisaki等发现非NA酶活性区域的E105K突变病毒也可降低对神经氨酸酶抑制剂类药物的敏感性，由于该突变位点位于单体边缘，可能降低氢键的结合能量，影响四聚体结构的稳固性[36]。本研究中B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株的NA序列中酶催化活性位点和辅助位点无耐药性突变，推测对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。
随着对IBV研究的深入，建立稳定的IBV小鼠感染模型尤为重要，有研究通过B/Lee/40毒株在小鼠体内连续传代，建立鼠适应株，用于构建IBV小鼠感染模型，但要求感染剂量较高且感染后难致死[37]。还有研究通过使用免疫抑制剂或基因敲除降低小鼠天然免疫[38]，提高病毒复制能力的方法来建立IBV小鼠感染模型。除此之外，也有通过在小鼠体内多次传代筛选出鼠致死性病毒毒株的报道[19]。本研究用IBV Victoria谱系的临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018感染小鼠，发现小鼠高度易感且出现死亡，感染小鼠肺部出现典型病变和炎症，如肺泡结构破坏严重、炎性细胞浸润、巨噬细胞和中性粒细胞增加等。另外，感染不同时间后小鼠肺中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和干扰素IFN-α、IFN-β和IFN-γ转录水平显著上调，这与IBV可通过视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ (retinoic acid-inducible gene Ⅰ, RIG-Ⅰ) 介导的信号传导刺激机体产生天然免疫应答，从而引发宿主大量炎症因子、干扰素及干扰素诱导基因等免疫因子的表达的研究结果一致[39]。其中促炎因子TNF-α和IL-6等招募巨噬细胞和中性粒细胞到病毒感染的肺部，引起肺部发生急性炎症反应，从而造成肺部急性损伤，增强疾病程度，甚至引起宿主死亡[40-42]。
本研究对临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的HA、NA的核苷酸和氨基酸分别进行了遗传进化和突变位点比对分析，为评估抗原进化、发现新的突变基因和流感病毒的防控提供参考；另外，本研究还就B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018对小鼠的致病性进行了分析，发现该毒株对小鼠高度易感且可致死，并建立了小鼠体内感染模型，为阐明IBV的致病机制和抗IBV药物、疫苗评价奠定基础。
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