2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 刘璐璐, 高建伟, 李长菲, 武岳, 孟颂东
- LIU Lulu, GAO Jianwei, LI Changfei, WU Yue, MENG Songdong
- PEG修饰有效提高热休克蛋白gp96抑制性多肽抗乳腺癌的功能
- PEGylation effectively improves anti-breast cancer efficiency of heat shock protein gp96 inhibitory polypeptide
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3363-3378
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3363-3378
- 10.13345/j.cjb.220067
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文章历史
- Received: January 26, 2022
- Accepted: April 19, 2022
引用本文
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2. 中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室, 北京 100101;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 北京康明海慧生物科技有限公司, 北京 100101;
5. 佛山热休生物技术有限公司, 广东 佛山 528000
2. CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. Cominghealth Biotechnology Co. Ltd., Beijing 100101, China;
5. Foshan Heat Shock Biotech Co. Ltd., Foshan 528000, Guangdong, China
据2020年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC) 调查数据显示，全球新发乳腺癌230万例，占全球新发癌症病例的11.7%，居所有癌症的首位[1]。国内女性乳腺癌的发病率、死亡率在恶性肿瘤中排名首位[2]，严重威胁女性健康。乳腺癌治疗手段包括手术治疗、激素受体的内分泌治疗、放射治疗、靶向治疗、化学治疗及免疫疗法等，目前仍以手术切除为主要治疗手段[3]。其中靶向治疗具有定位准确、针对性强、毒副反应小等特点，能够明显地延长患者的生存期，提高患者的生存质量，尤其适于晚期病人或无法耐受放、化疗的患者。现有的乳腺癌的靶向治疗主要针对的是人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER-2) 阳性乳腺癌，曲妥珠单抗作为全球首个获批上市的抗HER-2乳腺癌的靶向药物，它的应用极大改善了HER-2阳性乳腺癌的转归和预后[4]。对HER-2基因扩增和过表达的乳腺癌患者，曲妥珠单抗单独应用或与其他药物联合应用有效率可分别达到25%或50%。而HER-2阳性的乳腺癌患者仅占乳腺癌患者总数的15%−20%[3]，因此急需寻找新的乳腺癌靶点，开发出更为广谱的抗乳腺癌靶向药物。
三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC) 是指通过免疫组织化学技术或荧光原位杂交技术检测提示雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR) 及HER-2表达均为阴性的乳腺癌[5]，约占乳腺癌的15%−20%，多发于40−50岁绝经前的年轻女性[6]。因其进展迅速、侵袭力强、肿瘤体积大、分化差、复发风险高、预后差、肿瘤负荷高、耐药性强，且目前没有特效治疗药物及治疗可预测的生物标记物，5年生存率约为60%，占总体乳腺癌死亡率的25%左右，严重威胁患者的生命健康[7]。临床研究显示，30%−40%的TNBC可发生转移[8]，是各亚型中预后最差的高度异质性肿瘤，内分泌治疗(如他莫昔分) 和抗HER-2靶向治疗(如曲妥珠单抗) 对三阴性乳腺癌均无效[6]。TNBC仍有一些靶点表达阳性[9]，故我们可以研发新的靶向治疗手段。
热休克蛋白gp96 (glycoprotein 96, 糖蛋白96)，又名GRP94 (glucose-regulated protein 94, 糖调控蛋白94)，是HSP90家族的重要成员[10]，在正常生理条件下定位于细胞内质网[11]。与其他热休克蛋白一样，gp96的主要生物学功能是分子伴侣。它参与新生蛋白的折叠、转运、降解及多聚体的组装等[12]。与其他分子伴侣不同的是，gp96能结合的蛋白、多肽链种类有限，更具选择性。据报道目前已有20多种蛋白的成熟需要gp96的参与[13]，这些研究揭示gp96作为分子伴侣与多个客户蛋白形成蛋白质复合物发挥调控作用[14]。尽管gp96在正常细胞中定位于内质网，但在特定细胞和外界刺激下gp96也可能分布于细胞膜表面、高尔基体、细胞核和细胞外环境中[15-16]。这种现象通常与疾病等慢性应激相关[17]，受到了许多研究者广泛的关注[18]。越来越多的研究发现，细胞膜gp96在小鼠Meth-A肉瘤细胞、结肠癌和纤维肉瘤细胞等多种癌细胞表面过表达，提示其与癌症的发生、发展密切相关[19]。早期研究表明，胞膜gp96在乳腺癌细胞高表达，但在正常乳腺组织中不表达[20]。Dejeans等[21]研究发现，gp96在乳腺癌中的过度表达与抵抗氧化应激和促进癌细胞增殖和迁移有关。gp96在复发性乳腺癌中的表达水平高于原发肿瘤[22]。最近的研究还表明，gp96的过表达与乳腺癌患者的脑转移和低生存率有关[23]，并且发现gp96过表达通过Wnt/β-catenin信号通路导致三阴性乳腺癌脑转移[24]。我们课题组利用HER-2过表达的乳腺癌模型证明，胞膜gp96的N端结构域(N-terminal domain, NTD) 与HER-2在细胞膜上互作，从而增加了HER-2蛋白的异源二聚化并活化下游细胞信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭[25]。同时，胞膜gp96通过与ER-α36互作从而促进乳腺癌细胞的生长和侵袭[26]。且胞膜gp96表达与乳腺癌的恶性程度与不良预后密切相关，因此胞膜gp96可作为包括三阴性乳腺癌在内的乳腺癌治疗的新靶点[17]。
基于热休克蛋白gp96氨基酸序列及空间构象，我们设计含有α-螺旋序列的多肽p37。该多肽能靶向gp96的ATP结合区，干扰gp96与HER-2的相互作用并降低其稳定性、促进HER-2在肿瘤细胞中的降解[27]。虽然多肽类药物的作用位点专一，但和其他多肽类药物一样，p37的溶解度低、稳定性差、肾脏清除速度快及血浆半衰期短等问题严重地制约了其临床应用[28]。聚乙二醇修饰又称分子的PEG化，即将多肽连接到非天然聚合物，是最早用于蛋白质修饰的化合物之一。PEG本身是一种不带电的亲水聚合物，不可生物降解，大部分无毒性，是目前已知聚合物中细胞及蛋白吸收水平最低的聚合物[29-30]。PEG链是由环氧乙烷的重复单位构成的一类高分子化合物[31]。PEG链延长半衰期主要是通过隐藏肽的抗原决定因素，使抗体无法识别到它是一个异物，并增加其大小而不会被肾脏轻易清除[32]。本研究尝试对p37多肽进行聚乙二醇修饰，以期增强其稳定性和抗肿瘤的活性，这将为研发新型抗乳腺癌的靶向药物提供依据。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料 1.1.1 细胞系和实验动物SK-BR-3细胞和MDA-MB-231细胞购自中国医学科学院基础医学研究所；BALB/c-nu小鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司；SD大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。动物实验遵守相关实验动物福利规定，动物实验方案经中国科学院微生物研究所伦理委员会批准，批准号为APIMCAS2022085。
1.1.2 主要试剂与设备多肽CY和LC由上海吉尔生化有限公司合成；蛋白gp96由本实验室人员胎盘提取；PEG2000和PEG5000购自北京键凯科技股份有限公司；紫杉醇注射液购自扬子江药业集团有限公司；L-15培养基、RPMI-1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 购自Gibco公司；gp96 monoclonal antibody购自Enzo Life Sciences公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 检测试剂盒购自DOJINDO公司；Tanswell plate购自Corning公司；Matrigel基质胶购自BD公司；Biacore3 000仪器由中国科学院微生物研究所公共仪器平台提供；分析性高效液相色谱仪、色谱柱Eclipse XDB-C18 Semi-Prep (5 μm, 9.4 mm×250 mm) 和XSELECT CSH C18 (5 μm, 4.6 mm×150 mm) 购自Angilent公司；游标卡尺购自西安艾瑞泽商贸有限公司。
1.1.3 主要溶液配制流动相A1液：20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，1 mmol/L EDTA·Na2，0.01% NaN3。
流动相B1液：20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，1 mmol/L EDTA·Na2，0.01% NaN3，1 000 mmol/L NaCl。
流动相A2液：0.1% TFA (H2O)。
流动相B2液：0.1% TFA (acetonitrile)。
PBST (0.05%)：NaCl 4 g，KCl 0.1 g，KH2PO4 0.12 g，Na2HPO4·12H2O 1.814 g，25 μL Tween-20，500 mL，pH 7.4。
HBS缓冲盐溶液：10 mmol/L HEPES，0.15 mol/L NaCl，3.4 mol/L EDTA，0.05% PBST；pH 7.4。
p37和mPEG2000CY母液(动物实验)：溶剂为PBS，终浓度分别为8 mg/mL和12 mg/mL。
流动相A液：0.1% TFA (H2O)。
流动相B液：0.1% TFA (acetonitrile)。
1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)：1 g BSA，溶于100 mL PBS。
紫杉醇(原始浓度为6 mg/mL，动物实验)：按照1︰3比例稀释加入PBS。
PEG-p37母液：本实验所有剂量均按照mPEG2000CY中活性多肽部分(p37) 计算。高剂量组的实际称样量需要经折算因子1.44折算，详细信息如下：mPEG2000CY的称样量=p37理论需要量/含多肽的量(载药率)=p37理论需要量×1.44。加入PBS溶解，使其浓度为1.44 mg/mL (以称量总量计算)，然后用0.22 μm微孔滤膜过滤至无菌容器，最终得到浓度为1 mg/mL的母液。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与传代SK-BR-3培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱。MDA-MB-231培养在含10%胎牛血清的L-15培养液中，置于37 ℃、无CO2的细胞培养箱。两种细胞均为贴壁细胞，传代时需要通过胰酶消化：用移液器吸去培养基，加入2 mL磷酸缓冲盐(phosphate-buffered saline, PBS)，清洗2次，洗掉残留的培养基，吸去PBS；加入2 mL 10% 胰酶，晃动培养皿，使胰酶作用1–2 min，轻轻拍培养皿侧面，当大部分细胞开始脱落时加入2 mL新鲜培养基，混合均匀，终止消化；将消化后的细胞加入15 mL离心管中，100×g离心4 min；倒掉上清，加入1 mL新鲜培养基重悬细胞；根据细胞生长速度，接种适当比例的细胞到含有新鲜培养基的培养皿中，轻轻摇晃均匀后，放入培养箱中培养。
1.2.2 乳腺癌模型构建收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，用PBS重悬至3×107个/mL，在BALB/c-nu小鼠右侧腋下皮下接种0.2 mL (6×106个) 细胞，共接种5只BALB/c-nu小鼠。接种后每天观察肿瘤生长情况。待肿瘤生长至500−600 mm3时，处死小鼠取出瘤块。在健康BALB/c-nu小鼠右侧腋下皮下瘤块移植，每只BALB/c-nu小鼠移植的瘤块体积约为1 mm3，待肿瘤生长至平均体积70−150 mm3左右，根据肿瘤大小随机分组。
1.2.3 多肽的PEG化我们选取一端修饰有马来酰亚胺的PEG (另一端连接甲氧基)，在p37的N端或C端引入含巯基的半胱氨酸，通过马来酰亚胺与巯基间的Michael加成反应，合成4种PEG化的p37多肽，即mPEG2000CY、mPEG5000CY、mPEG2000LC和mPEG5000LC。
CY为将p37的N端添加半胱氨酸得到的多肽。LC为将p37的C端添加半胱氨酸得到的多肽。PEG为mPEGxMal结构。甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，x为PEG的平均分子量；Mal表示马来酰亚胺，马来酰亚胺修饰在PEG的一端；m表示甲氧基，甲氧基连接在PEG的另一端。PEG化方法如下：(1) 将20 mg (0.010 mmol) mPEG2000Mal/(0.004 mmol) mPEG5000Mal与10 mg (0.002 mmol) 多肽CY/LC的混合物溶于10 mL (5 mmol/L) 的NaH2PO4缓冲溶液中，用5 mmol/L的Na2HPO4溶液调节反应溶液pH值至7.2，HPLC监测反应，直至多肽反应完全。(2) 采用HiTrap SP FF (1 mL) 大量纯化连接产物，洗脱液为流动相A1液和流动相B1液，洗脱条件为：先用A1液和B1液的体积比分别为80%和20%的混合液冲平，再用A1液和B1液的体积比分别为67%和33%的混合液洗脱收集样品。当吸光值开始升高时则开始收集样品。(3) 将收集到的样品用Millipore超滤离心管(3 kDa) 4 ℃、3 500 r/min离心浓缩至500 μL。浓缩后的样本用HiTrap Desalting (5 mL) 进行脱盐处理。冻干溶剂后得到的蓬松状态的PEG化多肽纯品。p37的N端和C端PEG修饰原理分别如图 1和图 2所示。
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| 图 1 p37的N端PEG修饰 Fig. 1 PEG modification on the N-terminal of p37. |
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| 图 2 p37的C端PEG修饰 Fig. 2 PEG modification on the C-terminal of p37. |
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mPEG2000CY/mPEG2000LC纯度由分析型高效液相色谱仪(流速为1 mL/min) 给出，色谱柱为Angilent Eclipse XDB-C18 Semi-Prep (5 μm, 9.4 mm×250 mm)。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A2液和流动相B2液组成。线性梯度洗脱B2液的体积百分比由40%匀速升至65%，A2液的体积百分比由60%匀速降至35%，洗脱时间11 min，洗脱流速为1 mL/min，紫外检测波长220 nm。
mPEG5000CY/mPEG5000LC用反相高效液相色谱仪对按照上述步骤所得的反应产物进行纯化，线性梯度洗脱B2液的体积百分比由30%匀速升至52%，A2液的体积百分比由70%匀速降至48%，洗脱时间11 min，洗脱流速为2.5 mL/min，紫外检测波长为220 nm。冻干溶剂后得到蓬松状态的PEG多肽纯品。纯度分析同mPEG2000CY，不同的是线性梯度洗脱B2液的体积百分比由20%匀速升至100%，A2液的体积百分比由80%匀速降至0，洗脱时间25 min。
1.2.4 药理学实验(Biacore和半衰期测定)通过Biacore方法分别检测制备的PEG多肽片段与gp96蛋白之间的相互作用。检测所用仪器为Biacore 3 000系统，使用CM5传感芯片。将浓度为1 mg/mL的蛋白gp96用不同pH值(5.5、5.0、4.5、4.0) 的缓冲液稀释至50 μg/mL，体积100 μL，使其带上不同量的电荷。然后，将蛋白以5 μL/min的流速流过芯片表面，观察它与芯片的结合曲线，判断最合适的pH条件。取同体积N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS) 和N-乙基-N-二甲基-氨丙基碳二亚胺(N-ethyl-N-dimethyl-aminopropylcarbodiimide, EDC) 混合成100 μL，12 000 r/min离心5 min；取一定体积的gp96蛋白，按预结合的比例稀释，稀释后需要150 μL；取100 μL乙醇胺(ethanolamine) HCl。以上试剂平衡到室温25 ℃左右，高速离心5 min。将上述3种试剂放在样品架上，设定加样流速为10 μL/min，点击“inject”选项进样，使gp96偶联在芯片上。设定结合gp96的流通池为检测通道，未结合gp96蛋白的流通池为参比通道，HBS缓冲溶液为流动相，流通池的流速为10 μL/min。将各PEG多肽用HPS稀释成不同浓度(156、312、625、1 250、2 500 nmol/L)，离心后上样，观察结合过程。
半衰期则使用UPLC-MS对各个样品浓度进行测量。用硼砂缓冲液(pH 9.5) 配制多肽p37和PEG多肽浓度为1 mg/mL的储备液。取该储备液适量用乙腈体积百分比为50%的乙腈水溶液配制成多肽浓度为25.0、37.5、50.0、75.0、100.0、150.0、250.0 μg/mL的标准曲线工作液。取准备好的标准曲线工作液20 μL，加入空白鼠血浆80 μL，配制多肽浓度为5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0 μg/mL的标准曲线样品，标准曲线样品中加入20 μL 20% (质量百分比) 磷酸溶液和300 μL甲醇-乙腈(甲醇与乙腈的体积比为1︰1)，涡旋混匀约2 min；4 000 r/min离心10 min，取上清液上样分析，得2个多肽的标准曲线，并依该方法配置质控样品检测其精密度。试验动物为雌雄SD大鼠，体重160−180 g，p37和mPEG2000CY多肽分别处理每组4只SD大鼠，雌雄各2只。给药前称定体重，通过静脉注射给药，剂量为8 mg/kg。给药后，分别在0 min和30 min、1、2、4、6、10、12、24 h通过尾静脉每次取血0.3 mL收集在装有6 μL抑肽酶和5 μL肝素钠的离心管中，4 500 r/min离心5 min分离上层血浆置于–80 ℃冰箱保存。取100 μL待测样本的血浆，加入20 μL 20%磷酸溶液、20 μL 50%乙腈水溶液和300 μL甲醇-乙腈(1︰1) 溶液，涡旋混匀约2 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液上样分析。洗脱液由A相和B相组成，洗脱液中B相的体积百分比由20%匀速升至35%，A相的体积百分比由80%匀速降至65%，洗脱时间10 min，洗脱流速为1 mL/min，紫外检测波长为220 nm，进样体积为20 μL。待程序完成后，计算样品峰面积以及对应的浓度。做成代谢曲线，并计算半衰期。
1.2.5 体外杀伤实验体外杀伤实验采用CCK-8方法。取对数生长期的SK-BR-3细胞，用2 mL PBS洗1次，弃去PBS加入胰酶消化，2 min后加入RPMI-1640培养基终止消化并反复吹打。收集后，用PBS清洗1次，后用血细胞计数板计数，在96孔板中每孔加入7×103个细胞，体积为100 μL。将铺好的96孔板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中24 h。
配制浓度为20 mg/mL的各个样品母液，将多肽母液、阳性对照品(紫杉醇) 和阴性对照(PBS) 与培养基混合，稀释为9个浓度梯度。取出96孔板，吸弃旧培养基后，加入含不同浓度样品的培养基，100 μL/孔，每个浓度做3个复孔。将96孔板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中48 h。
48 h后弃去含药物的培养基，加入含10% CCK-8新鲜培养基，110 μL/孔，避免产生气泡。再将96孔板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中1−4 h。用酶标仪测定OD490吸光值，参比波长选择630 nm。细胞生长抑制率计算公式为：(对照组OD490-630平均值−实验组OD490-630平均值)/对照组OD490-630×100%。
MDA-MA-231细胞的增殖抑制实验方法同SK-BR-3细胞，不同的是MDA-MB-231细胞培养方法为用L-15培养基无CO2培养箱培养。
1.2.6 细胞侵袭实验实验前1 d在4 ℃冰箱融化Matrigel，在Transwell上层小室中加入60 μL的Matrigel，37 ℃包被1 h，PBS缓冲液洗涤2次。将已消化计数好的乳腺癌细胞SK-BR-3用p37及4个PEG多肽的无血清培养液(终浓度为6 μmol/L) 稀释到4×105个/mL，取100 μL加入Transwell上层小室，Transwell下层小室加入600 μL完全细胞培养液，作为实验组；用无血清培养液代替含多肽片段的无血清培养液，作为阴性对照组。在37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养24 h，用棉签刮去上层Transwell小室中的细胞，50%甲醇/50%丙酮固定15 min后，再用PBS缓冲液洗3次，DAPI染色，荧光显微镜下计数侵袭的细胞数。侵袭抑制率的计算公式为：(阴性对照组中侵袭的细胞数–实验组中侵袭的细胞数)/阴性对照组中侵袭的细胞数×100%。
1.2.7 SK-BR-3和MDA-MB-231细胞膜表面gp96检测取对数生长期的SK-BR-3和MDA-MB-231细胞，吸弃培养基。PBS洗2次，加入1 mL胰酶，消化2 min。加入1 mL含血清培养基终止消化，100×g离心4 min。吸弃上清，用PBS洗3次。实验组按照5×105个细胞/100 μL混合细胞与抗体溶液，其中抗体使用浓度为1%，溶剂为1% BSA。室温孵育1 h后，在100×g条件下离心4 min，用PBS洗3次。100 μL用FITC标记山羊抗小鼠IgG (H+L) 二抗，抗体使用浓度为1%，溶剂为1% BSA，室温孵育30 min。在100×g条件下离心4 min，PBS洗3次后再用100 μL PBS重悬。对照组不添加gp96抗体。只加二抗。用流式细胞仪进行检测细胞膜gp96表达情况。
1.2.8 体内抑瘤实验使用上文1.2.2构建的乳腺癌小鼠模型，阴性对照组注射PBS溶液，阳性对照组注射紫杉醇制剂。给药剂量与方式见表 1。给药第1天起每2 d称量1次肿瘤体积，计算公式为：V=0.5×a×b2 (a、b分别代表肿瘤的长径和短径)。本次试验的试验终点为阴性对照组肿瘤体积均值超过2 000 mm3。试验结束后，剥离瘤块称重并拍照，将瘤块分别储存在10%福尔马林固定液以及液氮中。根据测量的结果计算相对肿瘤抑制率(TGI) 计算公式为：RTV=VT/V1；T/C=TRTV/CRTV×100%；TGI=(1–T/C)×100% (V1为给药前测量的肿瘤体积，VT为每次测量的肿瘤体积。TRTV为治疗组平均RTV，CRTV为对照组平均RTV)。
| Groups | Group name | Quantity | Dosage (mg/kg) | Concentration (mg/mL) | Volume (μL/mouse) | Route | Frequency |
| 1 | Negative control | 6 | N/A | N/A | 200 | i.v | Q2D |
| 2 | Positive control | 6 | 15.0 | 1.50 | 200 | i.p | BIW |
| 3 | Low-dose group | 6 | 2.5 | 0.25 | 200 | i.v | Q2D |
| 4 | Mid-dose group | 6 | 5.0 | 0.50 | 200 | i.v | Q2D |
| 5 | High-dose group | 6 | 10.0 | 1.00 | 200 | i.v | Q2D |
| i.v: intravenous injection, i.p: intraperitoneal injection; Q2D: once every two days, BIW: twice every week. | |||||||
用分析型高效液相色谱仪检测结果显示，所得mPEG2000CY的纯度为93.4%，mPEG5000CY的纯度为95.3%，mPEG2000LC的纯度为94.7%，mPEG5000LC的纯度为92.2%。利用中国科学院微生物研究所公共仪器平台的质谱系统，采用VG PLATFORM质谱仪，用MALDI-TOF技术进样，鉴定出相应分子量的PEG多肽mPEG2000CY、mPEG5000CY、mPEG2000LC、mPEG5000LC (分别如图 3A、3B、3C、3D所示)。结果显示，mPEG2000CY和mPEG2000LC的分子量为6.5 kDa左右，mPEG5000CY和mPEG5000LC的分子量为9.5 kDa左右，与理论相符。并且Biacore3 000的检测结果表明，4个PEG化多肽p37与gp96蛋白均有亲和力(表 2)，仅比p37稍低。
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| 图 3 4个PEG化多肽p37的鉴定 Fig. 3 Identification of four PEG-conjugated peptides. The molecular weight of mPEG2000CY (A), mPEG5000CY (B), mPEG2000LC (C), and mPEG5000LC (D) is determined by MALDI-TOF-MS. |
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| Peptide | Kd (mol/L) |
| P37 | 6.33×10–8 |
| mPEG2000CY | 6.90×10–8 |
| mPEG5000CY | 7.32×10–8 |
| mPEG2000LC | 7.54×10–8 |
| mPEG5000LC | 8.23×10–8 |
流式细胞检测发现，乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-231细胞膜上高表达热休克蛋白gp96 (图 4A)，进一步采用CCK-8法检测p37、PEG-p37对SK-BR-3和MDA-MB-231乳腺癌细胞的体外增殖抑制作用。阳性对照采用紫杉醇，阴性对照为PBS。
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| 图 4 PEG-p37抑制乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-231的增殖 Fig. 4 PEGylated polypeptide p37 inhibits the proliferation of breast cancer cell SK-BR-3 and MDA-MB-231. (A) Expression of cell membrane gp96 was detected on SK-BR-3 and MDA-MB-231 cells. (B) The effect of SK-BR-3 cell viability under treatment with the indicated concentrations of p37 was determined by CCK-8 assay (left). At the IC50 concentration (126.4 μmol/L) of p37 on SK-BR-3, the proliferation inhibition rates of mPEG2000CY, mPEG5000CY, mPEG2000LC and mPEG5000LC were determined respectively (right). (C) The effect of MDA-MB-231 cell viability under treatment with the indicated concentrations of p37 was determined by CCK-8 assay (left). At the IC50 concentration (281.2 μmol/L) of p37 on MDA-MB-231, the proliferation inhibition rates of mPEG2000CY, mPEG5000CY, mPEG2000LC and mPEG5000LC were determined respectively (right). Data were shown as x±s of three replicates. *: P < 0.05; **: P < 0.01 by t-test. |
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在SK-BR-3的体外增殖实验中，紫杉醇浓度为0.023 4 μmol/L，是其对SK-BR-3的IC50对应浓度。计算得出p37对SK-BR-3的IC50值为126.4 μmol/L (图 4B左)，在此IC50相同摩尔浓度下，测试mPEG2000CY、mPEG5000CY、mPEG2000LC、mPEG5000LC对SK-BR-3的增殖抑制率分别为58%、48%、33%和30%，如图 4B (右) 所示。mPEG2000CY抑制率最高，达到58%。
在MDA-MB-231细胞的体外增殖实验中，紫杉醇浓度为0.11 μmol/L，是其对MDA-MB-231的IC50对应浓度。计算得出p37对MDA-MB-231的IC50值为281.2 μmol/L (图 4C左)，在此IC50相同摩尔浓度下，测试mPEG2000CY、mPEG5000CY、mPEG2000LC、mPEG5000LC对MDA-MB-231的增殖抑制率分别为59.2%、47.3%、36.4%、29.6%，如图 4C (右) 所示。mPEG2000CY抑制率最高，达到59.2%。
2.2.2 PEG化多肽p37抑制乳腺癌细胞的侵袭随后，我们利用Transwell plate和Matrigel分别检测p37和PEG-p37对乳腺癌细胞SK-BR-3侵袭的影响。结果表明，p37和4个PEG多肽能显著抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的侵袭，其中mPEG2000CY、mPEG5000CY、mPEG2000LC、mPEG5000LC的抑制率分别为53.8%、41.2%、36.3%和28.5% (图 5)，mPEG2000CY抑制效果最明显。
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| 图 5 PEG-p37抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的侵袭 Fig. 5 PEGylated p37 inhibits the invasion of breast cancer cell SK-BR-3. SK-BR-3 cells were treated with p37, mPEG2000CY, mPEG5000CY, mPEG2000LC, or mPEG5000LC for 24 h. Cell invasion was measured by Transwell invasion assay. (A) Images of cells on the other side of the chamber stained by DAPI were shown. (B) The invasion inhibition rates of p37, mPEG2000CY, mPEG5000CY, mPEG2000LC and mPEG5000LC were determined respectively. Data were shown as x±s of three replicates. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001 by t-test. |
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根据以上结果，我们选取对乳腺癌细胞SK-BR-3增殖抑制和侵袭抑制效果最明显的PEG多肽mPEG2000CY，计算其与p37的各项药动学参数(表 3)。结果表明：相对于p37，mPEG2000CY在动物体内的半衰期(T1/2) 明显延长(p37 vs. mPEG2000CY, 2.44±0.39 vs. 10.90±5.03, P < 0.01)；mPEG2000CY的清除率(Cl_F_obs) 显著低于多肽p37，平均滞留时间(MRTlast) 显著延长。以上结果可说明PEG多肽mPEG2000CY在动物体内代谢时间和稳定性均明显延长，达到延长药物作用时间的目的。
| Peptide | T1/2 (h) | Tmax (h) | Cmax (μg/mL) | Cl_F_obs (mL/kg) | MRTlast (h) |
| p37 | 2.44±0.39 | 0.94±0.17 | 91.64±26.18 | 430.66±78.13 | 1.89±0.31 |
| mPEG2000CY | 10.90±5.03** | 1.78±0.29* | 79.41±19.53* | 145.31±23.15** | 8.45±2.74** |
| Data were shown as x±s of four mice. *: P < 0.05; **: P < 0.01 by t-test. | |||||
鉴于SK-BR-3细胞成瘤性较差，所以选择三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞开展移植瘤实验。动物实验结果表明低剂量(2.5 mg/kg)、中剂量(5 mg/kg) 和高剂量(10 mg/kg) 的mPEG2000CY均能显著抑制肿瘤生长，且对肿瘤的抑制呈剂量依赖性(图 6A)，低剂量组TGI为60.41%，中剂量组TGI为84.57%，高剂量组TGI为79.38%；中剂量组、高剂量组出现明显抑瘤效果(TGI > 60%)，且与紫杉醇阳性对照组(78.95%) 相近。
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| 图 6 mPEG2000CY抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的移植瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期 Fig. 6 mPEG2000CY inhibits the tumor growth of transplanted breast cancer cell MDA-MB-231. (A) Effect of mPEG2000CY treatment on tumor growth, determined by measuring implanted tumor volume at the indicated times (left) and tumor weight (right) at day 23 post treatment when the nude mice were sacrificed. Mice treated with PBS or paclitaxel served as negative or positive control. (B) Overall survival from treatment to death (tumor volume > 2 500 mm3) for each group. Data were shown as x±s of six mice. **: P < 0.01; ***: P < 0.001 by t-test. |
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同时我们对小鼠的总生存期(overall survival, OS) 进行了评估(图 6B)，从接受药物治疗开始至小鼠死亡(判断标准为肿瘤体积 > 2 500 mm3)，得到阴性对照组、低剂量mPEG2000CY、中剂量mPEG2000CY、高剂量mPEG2000CY、紫杉醇阳性对照组的中位OS分别为27、43、61、59、52 d，说明中剂量和高剂量mPEG2000CY组与其他组相比，在治疗乳腺癌中有更好的预后。
3 讨论本研究通过亲和力分析、细胞实验和动物实验系统考察了不同PEG修饰策略(多肽N端和C端修饰、不同分子量的PEG) 对p37多肽抗乳腺癌功能的影响，我们得到4种PEG修饰的抑制乳腺癌的p37多肽，分别是N端PEG修饰的mPEG2000CY和mPEG5000CY，C端PEG修饰的mPEG2000LC和mPEG5000LC。我们检测了4个PEG多肽对乳腺癌细胞SK-BR-3的增殖及侵袭力影响，结果显示N端PEG修饰的多肽比C端PEG修饰的多肽对SK-BR-3的增殖和侵袭的抑制效果更强，其中mPEG2000CY的抑制效果最明显。因此我们选择mPEG2000CY，计算它和未修饰的多肽p37的各项药动学参数，结果显示，PEG修饰的多肽在大鼠体内的半衰期明显延长、肾脏清除率显著降低、平均滞留时间显著延长。说明PEG修饰的确可以增加多肽在体内的稳定性，延长其作用时间。进一步通过荷瘤小鼠实验验证mPEG2000CY有效抑制乳腺癌肿瘤生长，为研发靶向胞膜gp96的新型靶向药物提供了依据。
细胞实验发现与p37多肽相比，mPEG2000CY对乳腺癌细胞增殖的抑制明显增强，但抑制细胞侵袭性的活性减弱(图 4和图 5)，造成不一致的原因可能是p37和mPEG2000CY靶向胞膜gp96后对不同gp96客户蛋白HER2、EGFR、ER-α36、uPAR的稳定性和下游通路的抑制程度存在一定差异[25-26, 33]，例如HER2/EGFR通路在促进乳腺癌细胞增殖方面发挥重要作用，而uPAR则主要促进细胞侵袭，具体分子机制需要进一步研究。此外，本研究通过gp96结合亲和力实验、体外细胞增殖和侵袭实验验证与p37相比，mPEG2000CY具有大致类似的亲和力和抑制活性，而mPEG2000CY在动物体内的半衰期增加约4.5倍(表 3)，提示mPEG2000CY在体内具有更高的抑瘤功能，因此体内抑瘤实验使用低、中、高剂量的mPEG2000CY，研究其对乳腺肿瘤生长的抑制效果。
本文研究中使用的细胞系包括HER-2阳性的乳腺癌细胞系SK-BR-3和三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，gp96在这两种细胞系的膜表面均有高表达。对于HER-2+乳腺癌细胞，mPEG2000CY的作用机制是可能包括干扰胞膜gp96与HER-2相互作用并降低其稳定性、促进HER-2降解；而对于MDA-MB-231，mPEG2000CY的作用机制可能是干扰gp96与ER-α36、uPAR相互作用，从而降低这些客户蛋白的稳定性。
我们对p37 PEG化延长其半衰期，主要目的是增强其在体内抗肿瘤的功能、降低毒副作用，我们通过前期动物试验观察发现p37存在肾脏清除速度快、血浆半衰期短和小鼠皮肤的刺激性大、容易造成注射部位皮肤溃烂等缺陷，对多肽PEG修饰后的mPEG2000CY对小鼠的上述毒副作用明显减弱，尤其是皮肤刺激性基本消失(未发表数据)，我们推测可能与药物溶解性提高、降低药物在注射部位和血管壁的沉积有关，因此药物的成药性显著提高。通过本研究证明mPEG2000CY可明显抑制小鼠移植瘤的生长、延长荷瘤小鼠的生存期，对皮下荷瘤小鼠生存期的延长可能与药物有效抑制体内乳腺癌细胞的侵袭和转移有关。
目前临床治疗三阴性乳腺癌的药物为紫杉醇和靶向PD-1或PD-L1抗体药物联合使用，单纯紫杉醇治疗并不能达到预期疗效，鉴于本研究中荷瘤小鼠为BALB/c-nu裸鼠，不适用PD-1或PD-L1抗体，因此抑瘤实验中阳性对照为单独使用紫杉醇。紫杉醇属于广谱化疗药，它通过与细胞骨架蛋白微管蛋白结合而促进细胞凋亡，mPEG2000CY属于靶向药物，通过靶向胞膜gp96、降低其通路客户的稳定性来发挥作用，因此紫杉醇和mPEG2000CY的作用机理不同，使用紫杉醇并不是最合适的阳性对照，但由于三阴性乳腺癌目前临床上缺乏有效的治疗药物，选择合适的对照药物仍具有一定难度。
PEG分子作为一种良好的修饰材料在生物制药领域被广泛用于修饰各种蛋白、酶和药物转运载体，PEG修饰后的蛋白多肽能降低免疫原性与免疫反应性，增加分子的大小、质量，减少组织器官的摄取，最终通过改变药代动力学的方式有效地解决了困扰其临床应用的一系列问题[34]。
基于gp96独特的结构域，已经发现多种特异性化合物[35]，如PU-H54、PU-WS13和PU-H39等，这些化合物多数为靶向HSP90、gp96的ATP结合区及其调控区域[36]。有研究通过化合物库筛选与模拟、并与计算分析相结合，发现了一种靶向gp96嘌呤结构的选择性抑制剂PU-H54[37]。对该化合物进一步结构修饰后，得到具有更强特异性的化合物PU-WS13。PU-WS13的发现为研究gp96的分子伴侣功能提供了新的工具[38]。Hua等[39]的研究表明，PU-WS13可以通过靶向抑制gp96活性，阻断Wnt/LRP Survivin通路，抑制骨髓瘤细胞生长并诱导其发生凋亡和坏死，为多发性骨髓瘤的治疗提供了新的思路。Rothan等[40]的研究发现，PU-WS13还可以抑制登革热病毒和寨卡病毒的复制，是黄病毒感染的有效小分子抑制剂。这些研究结果显示，gp96是多种疾病和癌症的潜在药物靶标，因此以gp96为靶点的药物开发具有巨大前景。
然而，gp96作为重要分子伴侣在几乎所有的有核细胞(包括正常细胞) 中表达，并具有重要生理功能，以上靶向HSP90、gp96的小分子化合物不可避免地也进入正常细胞，如果用于肿瘤治疗必将带来多种毒副作用。越来越多的证据表明，细胞膜gp96可作为治疗多种恶性肿瘤的新型靶点[20]，这为设计特异性靶向胞膜gp96的药物提供了可能，由于正常细胞表面并不表达gp96，所以设计靶向胞膜gp96的药物可避免小分子化合物干扰正常细胞生理功能所带来的潜在毒副作用。鉴于目前三阴性乳腺癌急需研发新型靶向药物，mPEG2000CY有望开发成为特异性高、毒副作用小的新型治疗乳腺癌和三阴性乳腺癌的靶向药物。
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