2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 蒋静雯, 王云龙, 李玉林, 王继创, 张怡青, 王旭东, 王晓军, 张恒
- JIANG Jingwen, WANG Yunlong, LI Yulin, WANG Jichuang, ZHANG Yiqing, WANG Xudong, WANG Xiaojun, ZHANG Heng
- 含分子内佐剂的SARS-CoV-2 RBD域重组蛋白制备及免疫效果评价
- Preparation and immungenicity of recombinant protein containing intramolecular adjuvant in SARS-CoV-2 RBD domain
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3353-3362
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3353-3362
- 10.13345/j.cjb.210883
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文章历史
- Received: November 30, 2021
- Accepted: April 6, 2022
- Published: April 29, 2022
引用本文
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2. 郑州职业技术学院 生物工程系, 河南 郑州 450010;
3. 河南省生物工程技术研究中心, 河南 郑州 450010;
4. 河南省职工医院, 河南 郑州 450002
2. Department of Bioengineering, Zhengzhou Technical College, Zhengzhou 450010, Henan, China;
3. Henan Bioengineering Technology Research Center, Zhengzhou 450010, Henan, China;
4. Henan Provincial Staff Hospital, Zhengzhou 450002, Henan, China
由新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 引起的疫情近两年已席卷全球[1]，目前针对该病毒的治疗药物尚未全面普及，随着病毒变异株陆续出现[2]，国内外疫情形势依旧严峻复杂。开发针对传染性病原体的预防性疫苗是控制和阻止流行病大规模暴发的关键[3]。全球新型冠状病毒疫苗开发路线主要有灭活全病毒疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和减毒活疫苗[4]。灭活疫苗能引起较强的体液免疫应答，但细胞免疫应答反应较弱，且生产过程中存在生物安全风险[5]。载体疫苗以病毒为载体感染细胞，诱导较强的体液和细胞免疫反应，但腺病毒载体本身可能存在免疫影响[6]。核酸疫苗中mRNA疫苗相比DNA疫苗无需进入细胞核，相对更安全[7]。mRNA疫苗因其能引起强烈的细胞免疫和体液免疫反应而表现出极佳的保护效力[8]，但部分mRNA疫苗运输与保存条件较为苛刻[9]。
重组亚单位疫苗基因和氨基酸序列明确，新型冠状病毒S蛋白RBD域对决定组织嗜性和宿主范围至关重要，是主要的中和表位区域，成为新型冠状病毒亚单位疫苗研发的首选靶蛋白[10]。重组蛋白疫苗免疫原性弱，需要特定的佐剂来提升免疫效果[11]。分子内佐剂是一类既具有抗原递呈功能又具有佐剂效果的小分子多肽，因其能特异性或非特异性增强细胞免疫应答成为重组蛋白疫苗的研究热点之一[12]。疫苗研究中常用的分子内佐剂主要有流感病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)[13]、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(heat-labile enteretoxin B subunit, LTB)[14]、破伤风毒素肽(tetanus toxin, TT)[15]、促吞噬肽(tuftsin)[16]等。本研究将两种分子内佐剂破伤风毒素肽(TT830-843)、促吞噬肽(tuftsin) 与S蛋白RBD区域相串联，预期通过这两个肽的作用，增加S蛋白RBD区域(S-RBD) 抗原的免疫反应，增强细胞免疫应答。
本试验通过柔性连接肽GGG将分子内佐剂与S-RBD区域相串联，采用原核表达系统对其表达纯化条件进行探究，得到纯度较高、复性效果较好的S-TT-tuftsin重组蛋白。重组蛋白与铝佐剂混合后免疫BALB/c小鼠，体液免疫应答结果表明S-TT-tuftsin重组蛋白刺激机体产生的ELISA抗体效价可达1︰66 240，细胞免疫应答结果显示S-TT-tuftsin重组蛋白对淋巴细胞特异性刺激增殖指数可达4.71±0.15，免疫效果证明了分子内佐剂(TT830-843与tuftsin) 可刺激小鼠针对新冠S-RBD区域产生更强的体液免疫反应及细胞免疫应答，为新冠或其他病毒亚单位疫苗的研究提供理论基础和参考。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料实验动物BALB/c小鼠(6周龄) 购自郑州大学实验动物中心；异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside, IPTG)、小鼠脾脏淋巴细胞分离液试剂盒购自索莱宝公司；二乙氨乙基(dicthylaminoethyl, DEAE) Sepharose Fast Flow离子交换层析介质购自GE公司；尿素、氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司；S-RBD蛋白、S-RBD单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 标记的羊抗小鼠IgG (羊抗鼠-HRP)、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG (鼠抗人-HRP)、新冠亚单位疫苗(安徽智飞公司) 免疫人血清均由河南省生物工程技术研究中心提供。
1.2 实验方法 1.2.1 蛋白序列设计及在大肠杆菌中表达条件探究参考GenBank上SARS-CoV-2病毒的S蛋白基因序列(GenBank登录号：YP_009724390.1)，选取S蛋白RBD区域(319 aa–541 aa) 223个氨基酸对应的基因序列作为目的基因，通过柔性连接肽GGG将目的基因与TT830-843、tuftsin相连接(连接方式如图 1所示)，交由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成并连接到载体pET28a上。将重组质粒转入到大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)，在1 L液体培养基中培养至OD600达到1.0‒1.2之间时加入终浓度0.5 mmol/L的诱导剂IPTG，37 ℃、210 r/min诱导表达6 h，7 000 r/min离心10 min收菌。
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| 图 1 S-TT-tuftsin重组抗原基因设计结构示意图 Fig. 1 Structure diagram for designing the S-TT-tuftsin recombinant antigen gene. |
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向收集的菌体沉淀中加入30 mL、20 mmol/L Tris缓冲液，冰浴超声破碎(功率300 W，工作时间3 s，间歇时间3 s) 20 min，经1% Triton X-100洗涤1次，2 mol/L尿素、20 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0) 洗涤1次，最终得到溶于缓冲液8 mol/L尿素、20 mmol/L Tris (pH 8.0) 中的粗提蛋白。
粗提蛋白经DEAE阴离子交换柱(GE公司)进行纯化，对重组蛋白洗脱液中盐离子的浓度进行探究。纯化时缓冲液为8 mol/L尿素、20 mmol/L Tris (pH 8.0)，洗脱液为8 mol/L尿素、20 mmol/L Tris (pH 8.0)，和0、20、50、100、300 mmol/L氯化钠。通过SDS-PAGE分析确定纯化时目的蛋白最佳洗脱条件。
对重组蛋白进行Western blotting鉴定。配制5%脱脂奶粉室温封闭2 h，采用河南省生物工程技术研究中心提供的S-RBD单克隆抗体(1︰500) 作为一抗，4 ℃孵育过夜，以羊抗鼠-HRP (1︰3 000) 作为二抗，室温孵育2 h，随后配制DAB显色液进行显色。
1.2.3 重组蛋白复性与复性效果分析采用梯度透析复性法对纯度较高的包涵体蛋白进行复性。复性温度4 ℃，复性液为8 mol/L尿素、20 mmol/L Tris (pH 8.0)、甘油、精氨酸。复性时对甘油及精氨酸的浓度进行探究，甘油浓度分别设为5%、8%、10%，精氨酸浓度设为0.1、0.3、0.5 mol/L。随后以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 为阴性对照，真核S-RBD蛋白为阳性对照，实验室接种过新冠亚单位疫苗人血清(1︰100) 为一抗，鼠抗人-HRP (1︰3 000) 为二抗，Dot blotting检测复性后重组蛋白的活性。
1.2.4 抗原免疫及特异性抗体测定前期经实验探究，重组S-TT-tuftsin蛋白免疫剂量为50 μg时效果较好(具体结果略)。
将15只6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组5只，分别为PBS组、S-RBD组、S-TT-tuftsin组。S-RBD组与S-TT-tuftsin组各取50 μL (50 μg) 蛋白，PBS组取50 μL灭菌的PBS，分别与等体积的铝佐剂混合，皮下多点免疫小鼠。于首次免疫第14天按照上述程序进行第二次免疫。每7 d尾静脉取血并采用酶联免疫吸附法(ELISA法) 检测小鼠产生抗体的水平。
ELISA法对免疫鼠血清抗体水平进行检测。包被蛋白为S-RBD抗原，免疫鼠血清抗体预稀释1︰50倍后倍比稀释，对血清抗体效价进行检测。每孔加样100 μL，37 ℃孵育30 min后PBST洗板5次(下同)，随后加入羊抗鼠-HRP (1︰6 000) 每孔100 μL，37 ℃孵育后洗板，再加入显色剂A与显色剂B各50 μL，37 ℃孵育20 min后取出每孔加50 μL终止液，立即使用酶标仪双波长检测(450 nm与630 nm)。
1.2.5 免疫小鼠淋巴细胞增殖试验免疫鼠血清抗体水平到达平台期时颈椎脱臼处死小鼠，于无菌条件下解剖取出脾脏，采用小鼠脾脏淋巴细胞分离液试剂盒分离出脾淋巴细胞后进行细胞计数，并用RPMI-1640培养基稀释细胞后铺于96孔板，每孔铺2×105个细胞。使用终浓度为10 μg/mL的相应抗原刺激淋巴细胞，同时以5 μg/mL刀豆蛋白刺激作为阳性对照，无抗原刺激孔作为阴性对照，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。然后向每孔加入10 μL的CCK8试剂，继续培养4 h后在酶标测定仪上用450 nm与630 nm波长(双波长检测)测定OD值。刺激指数(stimulation index, SI)=(刺激孔OD630–刺激孔OD450)/(无抗原刺激孔OD630−无抗原刺激孔OD450)。
1.2.6 免疫鼠血清假病毒中和试验假病毒购自义翘神州(货号：PSV001，HIV-1系统)，表面表达SARS-CoV-2 Spike蛋白，并携带有荧光素酶报告基因。将PBS组、重组S-RBD蛋白组、重组S-TT-tuftsin蛋白组免疫鼠血清从1︰2开始倍比稀释至1︰256，取50 μL稀释后血清与等体积的假病毒混合后孵育1 h，将混合液添加到hACE2-293T细胞板(2×105个细胞/孔)中，培养48 h后对每孔细胞中荧光素酶发光值(relative luciferase activity unit, RLU) 进行检测。计算RLU值相对减少率，EC50值经Graphpad Prism 8软件“log (inhibitor) vs. response (four parameters)”四参数拟合分析得到。阳性对照为安徽智飞亚单位疫苗3针免疫14 d后的人血清。
2 结果与分析 2.1 重组蛋白表达与纯化对诱导前后菌液取样进行SDS-PAGE分析，结果显示，S-TT-tuftsin诱导后样本泳道中在29 kDa处较诱导前样本条带明显(图 2泳道2、3)，说明在IPTG的诱导下成功表达了S-TT-tuftsin重组蛋白，实验结果与预期相符。
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| 图 2 重组S-TT-tuftsin抗原表达纯化 Fig. 2 Expression and purification of recombinant S-TT-tuftsin antigen. 1–6: recombinant S-TT-tuftsin antigen expression and purification. Lane information: 1: protein marker; 2: before induction; 3: after induction; 4: broken supernatant; 5: broken precipitate; 6: after purification; 7: recombinant S-RBD antigen. |
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经超声破碎后SDS-PAGE分析发现重组蛋白以包涵体形式表达(图 2泳道4、5)，随后对包涵体蛋白进行洗涤及DEAE-阴离子交换层析纯化，在氯化钠浓度为20 mmol/L时收集到纯度较高的重组蛋白(图 2泳道6)。
2.2 抗原Western blotting鉴定以S-RBD单克隆抗体作为一抗对重组蛋白进行Western blotting鉴定时，阴性对照BSA不显色，S-TT-tuftsin与S-RBD重组蛋白均能与S-RBD单克隆抗体发生特异性反应而显色，且位置条带正确(图 3)。试验与预期结果相符。
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| 图 3 重组S-TT-tuftsin抗原与S-RBD抗原Western blotting鉴定结果图 Fig. 3 Western blotting identification of recombinant S-TT-tuftsin antigen and S-RBD antigen. Lane information: 1: protein marker; 2: S-TT-tuftsin; 3: S-RBD; 4: BSA (negative control). |
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经实验验证，确定复性液中甘油浓度为8%、精氨酸浓度为0.3 mol/L和0.5 mol/L时，重组蛋白析出量最少，最终确定S-TT-tuftsin重组蛋白复性液中甘油最佳浓度为8%，精氨酸最佳浓度为0.3 mol/L。
以新冠亚单位疫苗免疫人血清作为一抗对重组蛋白的复性效果进行分析，Dot blotting实验结果显示(图 4)，S-TT-tuftsin与S-RBD重组蛋白均能与人血清多克隆抗体特异性结合而显色，阴性对照BSA不显色，说明复性后的重组蛋白可用于后续免疫实验。
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| 图 4 重组S-TT-tuftsin抗原与S-RBD抗原Dot blotting鉴定结果 Fig. 4 Diagram of Dot blotting identification results of recombinant S-TT-tuftsin antigen and S-RBD antigen. The channel information: 1: S-TT-tuftsin; 2: S-RBD; 3: BSA (negative control). |
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采用ELISA法对免疫42 d内每组小鼠抗体效价进行检测，以每组小鼠抗体效价均值作图(图 5)。结果显示，在免疫的各个时期S-TT-tuftsin组抗体效价均高于S-RBD组，且二次免疫后抗体水平明显升高。首次免疫后35 d时，抗体水平到达平台期，S-RBD组ELISA抗体效价仅为1︰35 360，而S-TT-tuftsin组ELISA抗体效价达到1︰66 240，显著高于S-RBD组ELISA抗体效价(n=5, P < 0.05)。实验结果表明，重组S-TT-tuftsin蛋白诱导小鼠产生特异性抗体的水平明显强于S-RBD蛋白。
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| 图 5 抗原免疫42 d内抗体水平检测 Fig. 5 Profiles of antibody levels within 42 days of antigen immunization. **: P < 0.01; ***: P < 0.000 1. |
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通过抗体水平到达平台期时免疫鼠的脾淋巴细胞增殖试验来反映抗原特异性刺激小鼠体内淋巴细胞增殖情况。从图 6可以看出，重组S-TT-tuftsin蛋白刺激免疫鼠淋巴细胞增殖的能力较强，刺激指数SI可达4.71±0.15，而S-RBD抗原刺激指数仅为1.83±0.09。通过统计学分析，重组S-TT-tuftsin蛋白特异性刺激淋巴细胞增殖能力显著强于S-RBD抗原(n=5, P < 0.000 1)。
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| 图 6 免疫鼠特异性刺激淋巴细胞增殖能力 Fig. 6 Immunized mice specifically stimulate the proliferation ability of lymphocytes. ****: P < 0.000 1 |
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样品的稀释度经对数变换后与抑制率之间存在典型的四参数抑制曲线(图 7)，EC50值由Graphpad Prism 8软件分析得到。与PBS组免疫鼠血清(阴性对照) 对比，阳性对照中和抗体活性为1︰43，重组S-TT-tuftsin蛋白免疫鼠血清中和抗体活性为1︰29。结果表明，制备的重组S-TT-tuftsin蛋白免疫鼠血清具有一定的中和活性。
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| 图 7 免疫鼠血清假病毒中和结果 Fig. 7 Pseudovirus neutralization in immunized mouse serum. |
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安全有效的疫苗[17]对抗击新型冠状病毒肺炎全球大流行至关重要。重组疫苗是新型冠状病毒疫苗研制的重要方向之一，无论从结构还是序列选择上基本都锚定新型冠状病毒主要结构蛋白S蛋白或其上部分序列[18-20]，且在动物实验[21]或临床试验[22]中均表现出较好的保护性免疫效果。重组纳米疫苗的研究也在应对新冠疫情中迅速发展，其中美国诺瓦瓦克斯自主研发的重组纳米疫苗[23]已在临床试验中得到较好的免疫原性与安全性。有关佐剂的研究也同样对疫苗研发起到推动作用，用于新冠疫苗的佐剂有铝佐剂、AS03[24]、CpG[25]以及一些新型佐剂[26]等，均在不同程度上增强疫苗的免疫效果及中和抗体水平。重组疫苗除了可以起到免疫保护性作用之外，疫苗的安全性[27]也是人们同样关注的问题。临床研究中，仅有部分受试者接种疫苗后出现暂时性局部不良反应[28]，且在未加干预的情况下可自行消除。这表明，在现有研究基础上，重组疫苗在应对疫情的作用上是安全且有效的。
SARS-CoV-2病毒上的RBD区域决定组织嗜性和宿主范围，具有关键中和表位[29]，是研制多种新型冠状病毒疫苗的首选靶标，且目前进行临床试验或上市的新型冠状病毒重组蛋白疫苗、mRNA疫苗和病毒载体疫苗部分以RBD区域为主要抗原[30]，且有研究表明，选择RBD作为抗原与选择S蛋白作为抗原的mRNA疫苗在保护率和针对变异病毒的有效率并无明显差异[31]。为进一步提高重组蛋白的免疫效果，研究者通常借助通用T细胞表位的辅助作用，克服不同人群的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC) 的限制，进而诱导更强的免疫反应，且通用表位相对分子质量应尽可能小，避免机体产生针对表位的特异性抗体[32]。破伤风毒素(tetanus toxin, TT) 是细菌产生的一种单链多肽，其p2表位TT830-843可与MHC蛋白结合，在不同的疫苗平台上已被用作免疫系统的通用佐剂表位[33]，可增强抗原性和整体免疫应答[34]。研究表明，将TT肽与胃泌素蛋白相连接制备新型抗胃泌素疫苗，有效地增强了抗原表位本身的体液免疫和细胞免疫应答[35]。促吞噬肽(tuftsin) 是一种天然的免疫刺激四肽(TKPR)，已被证实可以增加巨噬细胞介导的吞噬作用、脾细胞增殖[36]，将tuftsin作为分子内佐剂融合表达既能保持结构稳定且可大幅度提升亚单位疫苗的免疫效果[37]。
考虑到抗原标签切除时，可能存在因残留的标签或蛋白酶引发安全性等问题[38]，实验设计了无标签的抗原，通过包涵体蛋白的洗涤与离子交换层析来提高重组蛋白的纯度。重组蛋白梯度透析复性时最佳复性液组合为8%甘油与0.3 mol/L精氨酸[39]，对重组蛋白的聚集起到一定的抑制作用，有利于重组蛋白的正确折叠。Dot blotting实验的结果表明了制备的重组蛋白复性时折叠效果较好。本研究设计将TT830-843、tuftsin分子内佐剂与S蛋白RBD区域串联，进而提高S-RBD抗原的免疫原性，动物免疫及淋巴细胞增殖实验的数据也验证了这一设计的有效性。ELISA检测结果表明，抗体水平到达平台期时(免疫35 d)，重组S-TT-tuftsin蛋白组诱导小鼠产生特异性抗体的效价为1︰66 240，显著高于S-RBD蛋白组(P < 0.05)。CCK8实验结果表明，重组S-TT-tuftsin蛋白特异性刺激淋巴细胞增殖的指数为4.71±0.15，S-RBD蛋白的刺激指数仅为1.83±0.09，重组S-TT-tuftsin蛋白特异性刺激淋巴细胞增殖的能力显著强于S-RBD蛋白(P < 0.000 1)，说明在TT830-843和tuftsin分子内佐剂作用下，重组S-TT-tuftsin蛋白诱导小鼠产生了更强的细胞免疫应答，实验结果与预期设计相符。Su等[40]设计将S蛋白抗原与分子内佐剂联合使用，结果发现新型抗原可以刺激机体获得更高水平的中和抗体，也进一步验证了分子内佐剂在提升抗原免疫效果中的作用。
综上所述，分子内佐剂TT830-843和tuftsin可诱导新型冠状病毒S-RBD重组亚单位蛋白在小鼠体内产生更强的体液免疫和细胞免疫，有望成为新型冠状病毒肺炎重组蛋白疫苗的候选抗原。由于实验条件有限，重组蛋白免疫小鼠后活病毒中和实验未能进行检测，后续我们还将进一步探究分子内佐剂在S-RBD基因序列上的位点及组合方式对免疫效果的影响，为新型冠状病毒及其他病毒亚单位疫苗的研制提供参考。
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