Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM) 是一种自身免疫性疾病，胰岛遭免疫系统攻击后，外周血中产生针对胰岛β细胞的多种抗体，导致胰岛细胞功能受损胰岛素分泌不足^[1]。在Ⅰ型糖尿病病人血清中已经鉴定发现锌转运蛋白8 (zinc transporter 8, ZnT8)为T1DM的自身抗原候选蛋白^[2]。60%−80%的新发T1DM患者呈ZnT8自身免疫抗体(ZnT8 autoantibody, ZnT8A) 阳性，4%的病例呈ZnT8A阳性^[3]。2014年美国食品药物管理局批准了首个ZnT8自身抗体的酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 检测试剂盒，可用于帮助诊断Ⅰ型糖尿病。该试剂盒的关键原料为具有抗原活性的重组ZnT8蛋白。

ZnT8蛋白全长包含369个氨基酸，由6个跨膜结构域以及氨基和羧基末端区域组成，能在细胞膜上形成二聚体^[4]。由于ZnT8蛋白近一半区域为跨膜结构，因此表达其全长蛋白较为困难。Wan等利用哺乳动物细胞HEK293尝试进行了第50−369位氨基酸表达，主要通过把多种脂质与ZnT8共孵育、干燥、超声的方法使ZnT8形成脂蛋白复合体，并应用于等离子体金芯片(plasmonic gold chip) 检测^[5]。不过，上述路线存在产量低、成本高等问题，尚未实现产业化应用。

抗原表位分析表明，ZnT8蛋白的抗原表位主要分布在N端(第1−74位氨基酸) 和C端(第268−369位氨基酸)，仅少量分布在跨膜区或位于细胞质及腔的短连接肽^[2]，因此，很多研究者尝试表达除跨膜区和连接肽外的N端和C端区域以制备抗原原料。据报道，ZnT8主要的表达形式有N端、C端、N-C融合体及C-C二倍体。N端可以在大肠杆菌中以包涵体形式表达^[6]，C端能在大肠杆菌中可溶表达^[7]或在HEK293中表达^[5]，N-C可以在大肠杆菌中以包涵体形式表达^[6]，C-C可以在大肠杆菌^[8]或昆虫细胞^[9]中可溶表达以及可以在哺乳动物细胞^[10]中表达。此外，在ZnT8后100位氨基酸中，第325位氨基酸的风险等位基因(rs13266634) 具有非同义单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，3种突变体的第325位氨基酸分别有精氨酸、色氨酸及谷氨酰胺(较低概率突变)^[11]，且SNP会影响ZnT8抗体与抗原的特异性反应^[12]。尽管研究者进行了多种尝试，但由上述表达系统所生产的ZnT8抗原蛋白不能有效检出血清抗体，无法满足诊断试剂开发的需求。

酿酒酵母通常用于表达在大肠杆菌中不能很好生产、具有折叠问题或需要翻译后修饰的重组蛋白^[13]，与昆虫或哺乳动物细胞相比，酿酒酵母更易于培养且成本更低，也易于规模放大，市场上利用酿酒酵母制成的产品有胰岛素、乙型肝炎表面抗原、尿酸氧化酶及胰高血糖素等^[14]。在酿酒酵母中已经成功表达了一些自身免疫相关抗原，如用于检测Ⅰ型糖尿病的蛋白酪氨酸磷酸酶相关分子(ICA512) 在酿酒酵母YRD-15中成功表达^[15]，Bauer等克隆了与红斑狼疮相关的增殖细胞核(PCNA) 抗原基因，用酵母菌NCYC239成功表达了该基因编码的蛋白^[16]。据调研，ZnT8尚未在酿酒酵母中进行重组表达，故本研究尝试使用酿酒酵母生产表达ZnT8重组蛋白。

本研究在酿酒酵母中建立了ZnT8重组蛋白的表达、纯化流程及其抗原性评价方法，为后续体外诊断试剂盒的开发打下良好基础。

化学感受态细胞Fast T1购自南京诺唯赞生物科技有限公司；酿酒酵母INVSc1、载体pYES2为本实验室保存。

酿酒酵母INVSc1是一种理想的蛋白表达双倍体菌株，基因型为MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52，表型为Leu^–、His^–、Ura^–、Trp^–，它在缺少尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸的SC基础培养基中无法生长。与其适配的pYES2载体是一种高拷贝的酿酒酵母表达载体，可以利用载体上的URA3基因通过尿嘧啶原养法在INVSc1中筛选转化子，添加半乳糖可以诱导重组蛋白表达，该载体包含GAL1启动子、CYC1转录终止子、URA3基因、多克隆位点及氨苄青霉素抗性基因^[17]。

无缝克隆试剂盒(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit) 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Bradford蛋白质定量试剂盒及可溶型单组分TMB底物溶液购自天根生化科技(北京) 有限公司；酶标板(Thermo Scientific™ MaxiSorp™) 购自赛默飞世尔科技(中国) 有限公司；考马斯亮蓝快速染液购自上海雅酶生物医药科技有限公司；ZnT8抗体购自艾比玛特医药科技(上海) 有限公司；Ni-TED Purose 6 Fast Flow购自嘉兴千纯生物科技有限公司；DEAE Bestarose Fast Flow购自博格隆(上海) 生物技术有限公司；三色预染蛋白质分子量标准(10−180 kDa) 及GoldBand 5 000 DNA marker均购自翌圣生物科技(上海) 股份有限公司；YNB培养基购自Invitrogen公司(SC及SC-U培养基的具体配方参见Invitrogen手册)。

所有血清样品均由上海博岳生物技术有限公司提供。

在https://www.uniprot.org/网站上查找到人源ZnT8蛋白全长序列(Entry ID: Q8IWΜ4)，交由南京金斯瑞生物科技有限公司根据表达宿主酿酒酵母进行密码子优化并合成相应的基因序列。随后设计了3种ZnT8抗原形式，分别选取ZnT8第268−369氨基酸命名为C，第1−74氨基酸及第268−369氨基酸(325Arg) 的串联体命名为N-C，第268−369氨基酸(第325位氨基酸为精氨酸) 及第268−369氨基酸(第325位氨基酸为色氨酸) 的串联体命名为C-C，将6×His标签添加于3种抗原形式的C端，其中N-C、C-C中间设计了两种连接铰链，由RoseTTAFold预测蛋白结构后选择最优结果进行构建。使用引物F_N、R_N和F_C、R_C (表 1) 将N、C的核酸序列分别扩增，并将N、C序列通过重叠PCR连接，再利用无缝克隆试剂盒克隆至pYES2表达载体的多克隆位点上。之后将连接产物转化至Fast T1感受态细胞，由于载体上含有氨苄抗性基因，可使用氨苄抗性培养基筛选，挑取抗性平板上单克隆进行PCR验证并测序，将测序正确的菌株保种并提取质粒，最后将质粒电转入酿酒酵母INVSc1感受态，涂布SC-U平板，因为SC-U培养基不含尿嘧啶，只有含pYES2质粒的重组子才能在该培养基中生长，故经SC-U平板筛选后，理论上长出的转化子都含有重组质粒，最后挑取平板上的单克隆抽提质粒测序，将测序正确的菌株保种，获得酿酒酵母表达菌株。

将酿酒酵母表达菌株在SC-U平板上划线活化，于28 ℃培养箱静置培养2−3 d，挑取3−5个单克隆接种至50 mL SC-U液体培养基，28 ℃、200 r/min培养过夜，次日按2%接种量接种于含2%半乳糖的300 mL SC-U液体培养基中，28 ℃、200 r/min培养26 h诱导表达，最后以4 ℃、12 000×g离心3 min收获菌体。菌体称重后按照50%浓度进行高压匀浆破碎，破碎压力为100 MPa，破碎2 min，停2 min，进行3个循环。将破碎液以4 ℃、12 000×g离心20 min分离上清及沉淀，上清用0.45 μm滤膜过滤等待纯化上样。

首先采用Ni-TED介质进行目的蛋白初步捕获。将A相缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, 300 mmol/L NaCl, pH 7.4) 以200 cm/h流速平衡介质，以100 cm/h上样，上样完毕后使用洗杂缓冲液(N-C、C-C、C的洗杂液分别为含20、50、10 mmol/L咪唑的A相缓冲液) 以200 cm/h流速洗脱杂质，随后使用含100 mmol/L咪唑的A相缓冲液以200 cm/h流速洗脱目的蛋白，收集洗脱峰后，使用B相缓冲液(50 mmol/L Tris- HCl, 300 mmol/L NaCl, 500 mmol/L咪唑，pH 7.4) 以200 cm/h流速冲洗介质。将各步纯化样品取样进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染色法检测亲和纯化效果。

合并纯化效果较好的样品后采用DEAE介质进一步除杂。将C相缓冲液(50 mmol/L Tris- HCl, pH 8.0) 以200 cm/h流速平衡介质，以100 cm/h上样，上样完毕后使用洗杂缓冲液(N-C、C-C、C的洗杂液分别为含50、100、200 mmol/L NaCl的C相缓冲液) 以200 cm/h流速洗脱杂质，随后使用洗脱缓冲液(N-C、C-C、C的洗脱液分别为含100、200、300 mmol/L NaCl的C相缓冲液) 以200 cm/h流速洗脱目的蛋白，收集洗脱峰后，使用D相缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, 1 M NaCl，pH 8.0) 以200 cm/h流速冲洗介质。将各步纯化样品取样进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色法检测最终纯化效果。

本实验使用桥连法ELISA^[18]进行蛋白活性评价。ELISA方法如下：(1) 包板：将每种纯化后的抗原蛋白稀释至2 μg/mL，每孔加入100 μL，室温静置包被2 h，弃上清，用PBST洗板5次，每次5 min。(2) 封闭：每孔加入5% BSA(溶于PBST) 200 μL，室温静置2 h，弃上清，用PBST洗涤板5次，每次5 min。(3) 孵育抗体：每孔加入血清25 μL，4 ℃静置孵育过夜，弃上清，用PBST洗板5次，每次5 min。(4) 捕获标记抗原：每孔加入生物素标记抗原100 μL (2 μg/mL稀释于5% BSA)，4 ℃静置孵育2 h，弃上清用PBST洗板5次，每次5 min。(5) 结合酶标亲和素：每孔加入链霉亲和素-HRP 100 μL(1︰500稀释于5% BSA)，室温振荡孵育20 min，弃上清，用PBST洗板5次，每次5 min。(6) 显色：每孔加入TMB 100 μL，孵育20 min，最后每孔加入100 μL 2 mol/L硫酸终止反应，于450 nm波长处读数。

连接串联体C-C及N-C时设计了两种连接铰链，分别为柔性铰链(GGGS)₃ (L1) 及刚性铰链PKPSTPPGSSGGGS (L2)。将两种铰链连接于C-C之间，提交至RoseTTAFold上进行结构预测，分别得图 1A、1B，两种模型可信度分别为0.71、0.67，从整体上看，两种连接方式中的两段C端结构都与原始序列结构相似，由L1连接的两段序列间结构相对离散，符合柔性铰链连接的预期，理论上更适合抗原抗体靠近，故选择L1连接方式。同样地，将两种铰链连接于N-C之间，提交至RoseTTAFold进行结构预测，分别得图 1C、1D，两种模型可信度都为0.58，从整体上看，两种连接方式中的两段C端结构都与原始序列结构相似，而L1连接的N端多为螺旋状，L2连接的N端无特定二级结构，参考Daniels等^[19]序列分析结果，N端73个氨基酸末端结构域具有显著的α-螺旋含量，但整体主要是无序的，特别是在28Gln和63Gly之间的区域，这可能是模型整体可信度低的原因，而AlphaFold预测全长(第1−369位氨基酸) 结构显示第62−74位氨基酸部分为螺旋且可信度90 > pLDDT > 70，故从已知可靠结果选择L1连接方式，即靠近第74位氨基酸的末端为螺旋的预测结构，更贴合蛋白原始构象。

图 1 不同连接铰链的蛋白结构预测模型 Fig. 1 Structure prediction of C-C and N-C with two linkers. Structure prediction of C-C with L1(A), L2(B) and N-C with L1(C), L2(D) by RoseTTAFold. NTD starts in purple, CTD ends in red.

图选项

含有重组子C、N-C、C-C大肠杆菌菌落经引物F_V、R_V (表 1) PCR验证后，电泳显示分别在370 bp、590 bp、660 bp处有1条带(图 2)，与预期大小一致，经过测序与模板序列完全一致。

图 2 含有重组子C、N-C、C-C菌落的PCR验证 Fig. 2 PCR validation of recombinant colonies with constructs. M: marker; 1: C; 2: N-C; 3: C-C.

图选项

Western blotting检测结果表明，含有重组子的酿酒酵母经半乳糖诱导后，3种蛋白均在理论大小处有特异性条带(图 3)。SDS-PAGE显示，目的蛋白C主要存在于破碎上清中，大小为10 kDa左右，取破碎上清纯化，最终得到理想纯度蛋白C (图 4A)；同样地，在诱导表达重组蛋白C-C后，破碎上清中35 kDa附近有一明显条带，纯化后最终得到理想纯度蛋白C-C (图 4B)，这与理论大小24 kDa相差较大，猜测可能是因为酿酒酵母特有的超糖基化修饰引起的分子量变大，而蛋白C未发现分子量明显变大，这可能是由于C-C比C多出的柔性铰链可以灵活转动且暴露，其中3个丝氨酸的羟基可能被超糖基化修饰，形成超长O-糖链；同样地，经半乳糖诱导后，重组蛋白N-C在25 kDa附近有一明显条带，且主要表达于上清中，纯化后最终得到理想纯度蛋白N-C (图 4C)。

图 3 Western blotting验证蛋白表达 Fig. 3 Western blotting analysis. 1, 2: the pellets and the supernatants after expression.

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图 4 SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果 Fig. 4 SDS-PAGE analysis. (A) C. (B) C-C. (C) N-C. M: protein marker; 1: before expression; 2: after expression; 3: after purification.

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为筛选抗原性最佳的表达形式，使用ELISA测定3种抗原的血清反应性。取13位Ⅰ型糖尿病病人血清作为阳性血清(P)，取16位健康志愿者血清作为阴性血清(N)，3种蛋白C、N-C、C-C的ELISA结果显示(图 5)，16个阴性样品的测定值没有明显差异，13个阳性样品的检出率(以2倍阴性样本平均值作为cut-off值) 分别为53.8% (7/13)、61.5% (8/13)、53.8% (7/13)，3组特异性均为100% (16/16)。虽然3种蛋白具有相似检出率，但N-C蛋白相对其他2个蛋白在样本P3、P4、P8测试值上有明显差异，分别提升了105.7%、100.4%，163.8%、194.7%及93.7%、96.0%。因此，决定将蛋白N-C进行下一步测试。

图 5 ELISA检测重组抗原活性 Fig. 5 ELISA for detecting the immunogenicity of recombinant proteins. Thirteen positive serum for T1DM and 16 healthy human serum were tested for antigen C, N-C and C-C by ELISA. P: positive sera; N: negative sera.

图选项

将N-C包被酶标板，梯度稀释血清，ELISA结果显示，OD₄₅₀值随着血清稀释倍数的变化呈线性关系(y = 1.169 5x^{0.666 3}，R² = 0.995) (图 6)。将测试值作ROC曲线，曲线下面积AUC为0.851 (图 7 B)，AUC越接近1，表明该方法的诊断价值越高，使用最大约登指数(0.644) 处对应的阈值作为诊断分界点具有最佳准确度，此时cut-off值为0.142 (图 7 A)，检出率为76.9% (n=13)，特异性为87.5% (n=16)，对比“金标”RSR公司的Fast Zinc Transporter 8 (ZnT8) Autoantibody ELISA Kit敏感性为72% (n=50)，特异性为97% (n=90)，本实验的检测方法在敏感性上无明显差异，特异性有待提高。

图 6 血清稀释度与检测值的标准曲线 Fig. 6 Standard curve of diluted serum and detected value. Bridging-type ELISA was performed with diluted serum. The fitting curve and equation were showed.

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图 7 ROC曲线评价重组蛋白N-C抗原性检测方法 Fig. 7 The evaluation for detecting recombinant protein N-C antigenicity with ROC curve method. (A) ELISA for detecting the immunogenicity of recombinant protein N-C with cut-off value determined by ROC curve. (B) ROC analysis of ELISA. AUC was included.

图选项

ZnT8是Ⅰ型糖尿病的重要候选抗原，基于ZnT8所开发的自身抗体检测试剂盒可用于帮助诊断Ⅰ型糖尿病，由于国内尚未建立活性ZnT8的重组生产体系，因此急需实现原料国产化。本研究使用酿酒酵母系统表达了ZnT8的不同形式抗原，分别为C、N-C及C-C表达纯化后进行ELISA检测血清抗体识别能力，结果显示检出率分别为53.8% (7/13)、61.5% (8/13) 及53.8% (7/13)，此结果与IAA、IA-2A、GADA在糖尿病人中检出率^[20]有可比性。3种蛋白虽具有相似检出率，但在其中3个阳性样本中，N-C蛋白相对C、C-C蛋白在样本P3、P4、P8测试值上提升了约1倍，可能是因为ZnT8的N端对于这3种测试血清中相应抗体也有识别能力，推测在这些抗体中，除去C端，N端也存在对应抗原表位，与文献报道相符^{[3, 10]}。而在所有测试血清中，C与C-C的测试值没有明显差异，但有研究指出使用TaqMan探针对224名T1DM患者血清测试发现，60名患者血清仅对325Arg的构建体有反应，31名患者血清仅对325Trp的构建体有反应^[12]，本实验结果未体现出SNP在325R及325W对抗原表位产生的影响，可能是测试样本量过少，或者是本实验的检测方法无法检测到这种细微差异。

故基于本实验N-C蛋白能更好地识别血清中的抗体。将N-C ELISA测试结果用ROC曲线表征方法敏感性及特异性，检出率与RSR相应产品对比，敏感性无明显差异、特异性有待提高。除去样本量原因或由于方法学引起的偏差，从蛋白本身考虑，N-C蛋白中N端结构本是无序的，无序蛋白虽然自身不一定能折叠成有序的结构，但其通常具有重要生物学功能，且大多为具有蛋白质-蛋白质相互作用的高亲和力蛋白^[21]，这意味着ZnT8的N端很可能会与血清中一部分蛋白发生非特异性结合，产生假阳性，导致特异性降低，之后可以通过蛋白质工程改变个别氨基酸序列减少非特异性结合。为了最终实现诊断试剂中ZnT8抗原蛋白的开发，仍需扩大临床样本量，先判定是否是由N-C蛋白本身引起的特异性偏低，再继续考察方法的特异性及敏感性，根据具体情况完善cut-off值，提升诊断准确性，进而评价ZnT8抗原蛋白在Ⅰ型糖尿病中的体外诊断意义，实现国产替代原料的开发。